專利名稱：大腸桿菌o157的環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增檢測引物組、檢測方法和試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種大腸桿菌0157的環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增檢測引物組、檢測方法和試劑盒。
背景技術(shù)：
大腸埃希氏菌0157 (Escherichia coll 0157)是一類能引起嚴(yán)重食物中毒的致瀉大腸桿菌，Escherichia coli 0157 :H7是出血性大腸桿菌的主要血清型。自1982年以來，E. coli 0157 H7相繼在美國、英國、加拿大、日本等國家引起暴發(fā)和流行。該致病菌是引起腹瀉和出血性腸炎的重要致病菌，有29Γ7%的病人會出現(xiàn)出血性腎病綜合征，其感染已經(jīng)成為世界性問題。除Ε. coli 0157 Η7以外，產(chǎn)志賀毒素可發(fā)酵山梨醇的大腸埃希氏菌0157 :匪(nonmobile)已經(jīng)成為歐洲大陸過去10年重要的致病菌。人感染E. coli 0157 H7的主要途徑是食用或接觸被污染的牛肉、牛奶、蔬菜、水果和水源等，而且引發(fā)感染的劑量極低，僅攝取10個活菌就有可能致病，可引起出血性腹瀉、出血性結(jié)腸炎、出血性尿毒癥，甚至死亡。對于E. coli 0157的檢測，我國現(xiàn)行國標(biāo)GB/T 4789. 36-2008中采用的方法是采用改良EC肉湯培養(yǎng)基(mEC+n)，在36°C培養(yǎng)18 24h進(jìn)行前增菌，然后平板劃線顯色培養(yǎng)基，或者免疫磁珠富集后平板劃線顯色培養(yǎng)基，之后挑取可疑菌落進(jìn)行形態(tài)、染色及血清學(xué)試驗、生化鑒定等進(jìn)行最終判定，檢測過程耗時長達(dá)2-4d，難以適應(yīng)大批量食品樣品快速檢驗的要求。我國行業(yè)進(jìn)出口食品標(biāo)準(zhǔn)SN/T 0973-2010對E. coli 0157:H7目前采用的方法是對樣品在改良EC肉湯培養(yǎng)基(mEC+n)增菌后進(jìn)行免疫學(xué)方法檢測，同時輔助其他生化鑒定方法，此方法同國標(biāo)方法有類似之處，檢測周期比較長。近年來，大腸桿菌0157分子檢測方法如PCR、LAMP方法等逐漸建立起來，這些方法具有較高的特異性和靈敏性，但是由于食品種類復(fù)雜，樣品成品及其背景微生物對E. coli0157的干擾較多，加上E. coli 0157受到培養(yǎng)溫度、鹽度、pH值及培養(yǎng)基各種組分等因素的影響較大，因此，目前的各種方法中，還沒有一套完善、高效、靈敏的檢測方法適用于所有來源的樣品包括(食品、水、土壤及臨床樣本)。此外，最近的研究發(fā)現(xiàn)，改良EC肉湯由于膽鹽和新生霉素等抑菌劑含量較高，對目標(biāo)菌E. coli 0157的復(fù)蘇和生長有一定影響，導(dǎo)致在一些復(fù)雜基質(zhì)的樣品中E. coli 0157無法檢出。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一目的是提供一種應(yīng)用環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增檢測大腸埃希氏菌(Escherichia coli)0157的檢測引物組,利用該檢測引物組可以特異性的檢測大腸埃希氏菌 0157。本發(fā)明的應(yīng)用環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增檢測大腸埃希氏菌(Escherichia coli) 0157的檢測引物組，其特征在于，由下列引物組成
上游外引物F3 :5’ -TGCAACTACTGTAAGTAATGGA-3’ ；下游外引物B3 :5 ’ -TTGTTCTATGTCACTAACAGAC-3 ’ ；上游內(nèi)引物FIP : 5 ’ -TGTTGGAACAATAACTTCATCTCCT-ACGGTTGCTCTTCATTTAGC-3 ’ ；下游內(nèi)引物BIP :5’ -AATGCTATAAAATACACAGGAGCCA-ATTTGCCAAGTTTCATTATCTGA-3，。本發(fā)明的第二個目的是提供一種非疾病的診斷和治療目的的大腸埃希氏菌0157的檢測方法，其特征在于，對樣品進(jìn)行增菌培養(yǎng)獲得增菌液，提取增菌液中的細(xì)菌DNA，然后通過環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增的方法用上述檢測引物組對細(xì)菌DNA進(jìn)行選擇性擴(kuò)增，確認(rèn)是否存在有擴(kuò)增產(chǎn)物。所述的樣品優(yōu)選為肉制品，如豬肉和牛肉。·
所述的對樣品進(jìn)行增菌培養(yǎng)優(yōu)選是將樣品接入選擇性增菌液中，然后在42土 1°C培養(yǎng)6 8小時，獲得增菌液，所述的選擇性增菌液為每225ml緩沖蛋白胨水中含有8mg萬古霉素。利用該選擇性增菌液可以選擇的對肉制品中的大腸埃希氏菌0157進(jìn)行增菌，BPff-V進(jìn)行增菌，有利于E. coli 0157的復(fù)蘇和生長，且萬古霉素抗生素的低劑量使用，可以有效抑制其他競爭菌的生長，42 °C溫度增菌培養(yǎng)也可以有效降低肉制品中其他雜菌的生長，提高目標(biāo)菌E. coli0157的檢出率，更有利于對肉制品進(jìn)行檢測。所述的通過環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增的方法用上述檢測引物組對細(xì)菌DNA進(jìn)行選擇性擴(kuò)增具體為環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增體系為體系總體積25 μ L,包括2. 5μ L IOXThermopol反應(yīng)緩沖液、O. 4 μ L10mmol/LdNTPs、0. 5 μ L 10 μ mol/L 上游外引物 F3、0. 5 μ L 10 μ mol/L 下游外引物Β3、1μ L40ymol/L上游內(nèi)引物FIP、ly L 40 μ mol/L下游內(nèi)引物ΒΙΡ、0. 6 μ LlOOmmol/L ]\%504、12.5“1^11101/1甜菜堿、4 4 1^滅菌雙蒸水(1(1!120，88七 DNA 聚合酶 8U/μ L 和 2 μ L 細(xì)菌DNA，反應(yīng)條件為在溫度為65°C孵育45 60min。所述的確認(rèn)是否存在有擴(kuò)增產(chǎn)物可以利用電泳檢測、熒光顯色檢測或濁度檢測環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物是否具有擴(kuò)增產(chǎn)物，優(yōu)選用熒光顯色檢測，具體是在反應(yīng)管中加入SYBRGreen I顯色劑，Γδπι η后觀察結(jié)果，如果顏色為橙色，則樣品大腸埃希氏菌0157陰性，無大腸埃希氏菌0157，如果顏色為綠色，則樣品大腸埃希氏菌0157陽性，含有大腸埃希氏菌0157。所述的lOXThermopol反應(yīng)緩沖液是現(xiàn)有技術(shù)中的物質(zhì)，可以從試劑公司購買至丨J，其含有200mmol/L pH8. 8的三羥基甲基氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl)、100mmol/L氯化鉀(KCl)、100mmol/L 硫酸銨(NH4) 2S04、20mmol/L 硫酸鎂(MgSO4)和 1% 曲拉通 X-100(TtitonX-100)，余量為水。本發(fā)明的第三個目的是提供一種大腸埃希氏菌0157的檢測試劑盒，包括環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增試劑和檢測引物組，其特征在于，所述的檢測引物組由下列引物組成上游外引物F3 :5 ’ -TGCAACTACTGTAAGTAATGGA-3 ’下游外引物B3 :5 ’ -TTGTTCTATGTCACTAACAGAC-3 ’上游內(nèi)引物FIP : 5 ’ -TGTTGGAACAATAACTTCATCTCCT-ACGGTTGCTCTTCATTTAGC-3 ’下游內(nèi)引物BIP :5’ -AATGCTATAAAATACACAGGAGCCA-ATTTGCCAAGTTTCATTATCTGA-3，。所述的大腸埃希氏菌0157的檢測試劑盒還包括選擇性增菌液，該選擇性增菌液為每225ml緩沖蛋白胨水中含有8mg萬古霉素。本發(fā)明在對E. coli 0157增菌液種類、增菌溫度和培養(yǎng)時間等因素進(jìn)行比較和驗證的基礎(chǔ)上，將萬古霉素-緩沖蛋白胨水(BPW)選擇增菌與rfbE-LAMP技術(shù)相結(jié)合，建立了一種檢測肉制品中E. coli 0157的快速方法。rfbE基因是編碼大腸桿菌0157菌體O抗原的特異合成酶，是鑒定大腸桿菌0157的重要依據(jù)，針對E. coli 0157特異性基因設(shè)計特異性引物，具有較強(qiáng)的特異性，適于大腸桿菌0157的檢測。本發(fā)明針對大腸桿菌0157的rfbE基因，設(shè)計和篩選了一套特異性檢測引物組以及含有該檢測引物組的檢測試劑盒和利用該檢測試劑盒通過環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增的檢測方法，進(jìn)而確定待檢測樣品中是否存在大腸桿菌0157的檢測方法。本發(fā)明的檢測試劑盒和檢測方法具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確率達(dá)到99%、檢測時間短的優(yōu)點，從樣品處理到報告結(jié)果只需花8-10h，不需要PCR儀和電泳儀，操作過程簡單，解決了傳統(tǒng)檢測方法耗時長、傳統(tǒng)培養(yǎng)方法靈敏度低、血清凝集有交叉反應(yīng)等問題，對于及時有效地應(yīng)對食源性突發(fā) 公共衛(wèi)生事件具有重大意義，特別適合基層檢測機(jī)構(gòu)和飲用水加工企業(yè)自檢使用。
具體實施例方式以下實施例是對本發(fā)明的進(jìn)一步說明，而不是對本發(fā)明的限制。I、選擇性增菌液的配制(I)萬古霉素抑菌劑的配制稱取8mg萬古霉素干粉，加入ImL純水溶解，O. 22 μ m膜過濾除菌，得到萬古霉素抑菌劑。(2)培養(yǎng)基配制稱取25. 5g緩沖蛋白胨成品干粉，用IOOOmL蒸餾水，攪拌加熱煮沸至充分溶解，121°C高壓滅菌15min，分裝三角瓶，每瓶225mL，冷卻至40°C，每瓶加入ImL萬古霉素抑菌齊U，得到萬古霉素-緩沖蛋白胨水。2、環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增檢測(I)環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增體系環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增反應(yīng)體系含有IXThermopol反應(yīng)緩沖液、30(Γ500μπιο1/1 dNTP s (四種脫氧核苷酸的混合物)、4 6mmol/L硫酸鎂(MgS04)、O. Γο. 3 μ mol/L 外引物(F3/B3)，Γ2 μ mol/L 內(nèi)引物(FIP/BIP)，O. 8 lmol/L 甜菜堿，BstDNA聚合酶8U/ μ L,細(xì)菌DNA。上游外引物F3 :5 ’ -TGCAACTACTGTAAGTAATGGA-3 ’下游外引物Β3 :5 ’ -TTGTTCTATGTCACTAACAGAC-3 ’上游內(nèi)引物FIP : 5 ’ -TGTTGGAACAATAACTTCATCTCCT-ACGGTTGCTCTTCATTTAGC-3 ’下游內(nèi)引物BIP :5’ -AATGCTATAAAATACACAGGAGCCA-ATTTGCCAAGTTTCATTATCTGΑ-3，。最佳反應(yīng)體系為反應(yīng)體系為25yL，包括2. 5yL IOXThermopol反應(yīng)緩沖液、O. 4μ L 10mmol/LdNTPs、0. 5μ L 10 μ mol/L 上游外引物 F3、0. 5 μ L 10 μ mol/L 下游外引物B3、I μ L 40 μ mol/L 上游內(nèi)引物 FIP、I μ L 40 μ mol/L 下游內(nèi)引物 ΒΙΡ、0· 6 μ LIOOmmoI/LMgS04> 12. 5 μ L 2mol/L甜菜堿、2 μ L細(xì)菌DNA模板、4 μ L滅菌雙蒸水ddH20, Bst DNA聚合酶 8Μ/μ L。
(2)環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增條件于恒溫水浴鍋上65°C孵育45_60min，取出反應(yīng)管。(3)觀察結(jié)果在反應(yīng)管中加入I μ L 10%的顯色劑SYBR Green I，直接用肉眼觀察顏色變化，如顏色為橙色，說明待檢測樣品陰性，不含有Ε. coli 0157，如顏色變?yōu)榫G色，說明待檢測樣品陽性，含有Ε. coli 0157。實施例I :人工污染牛肉中大腸桿菌0157檢測I、樣品處理將標(biāo)準(zhǔn)菌株E.coli 0157 H7NCTC12900，在LB肉湯中復(fù)蘇18h，取ImL菌液用無菌生理鹽水進(jìn)行10倍梯度稀釋，將ιο'ιο'ιο—8三個稀釋度進(jìn)行平板計數(shù)，濃度分別為Axio2Jxio1 和 4X10°cfu/mL ;取 1(Γ8 濃度菌液 Iml 加入到 25g 不含 E. coli 0157 H7的牛肉樣品中，混勻Ih進(jìn)行人工染菌。
2、樣品增菌將上述25g人工染菌牛肉類樣品，加入到225mL萬古霉素-緩沖蛋白胨水中，42土 1°C培養(yǎng)6h后得增菌液，取ImL增菌液到2mL滅菌離心管中，加入20 μ L Dynabeads E. coli 0157免疫磁珠富集lOmin，用100 μ L PBS_Tween20洗滌3次，提取細(xì)菌DNA。3、細(xì)菌DNA的提取取ImL磁珠富集的細(xì)菌培養(yǎng)物，IOOOOrpm離心3min，棄上清，沉淀加入50 μ LTE充分懸浮混勻，于100°C水浴IOmin,冰上冷卻3min, 12000r/min離心IOmin,取上清即為細(xì)菌
DNA，備用。4、LAMP 擴(kuò)增25yL的環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增反應(yīng)體系包括2.5yL IOXThermopol反應(yīng)緩沖液、0. 4 μ LlOmmol/LdNTPs.O. 5 μ LlO μ mol/L 上游外引物 F3、0. 5μ L 10 μ mol/L 下游外引物Β3、1 μ L40 μ mol/L 上游內(nèi)引物 FIP、I μ L 40 μ mol/L 下游內(nèi)引物 BIP,0. 6 μ LIOOmmoI/LMgSO4> 12. 5 μ L2mol/L甜菜堿、2 μ L細(xì)菌DNA模板、4 μ L滅菌雙蒸水ddH20,Bst DNA聚合酶8U/ μ L,于PE2400PCR儀上進(jìn)行65°C恒溫擴(kuò)增45min，得到環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增反應(yīng)(LAMP)產(chǎn)物。4、結(jié)果觀察擴(kuò)增后的LAMP產(chǎn)物加入2 μ L10%的顯色劑SYBR Green I，結(jié)果顯示為綠色，說明樣品中含有E.coli 0157 H7，而陰性對照(H2O)為橙色，陽性對照(E. coli0157 H7NCTC12900菌株DNA)為綠色。用此方法可以將低量的目標(biāo)菌檢測出來，靈敏度可以達(dá)到4cfu/mL。實施例2 :冷鮮豬肉中大腸桿菌0157檢測I、樣品增菌將25g市場購買的豬肉樣品，加入到225mL萬古霉素-緩沖蛋白胨水中，42土1°C培養(yǎng)8h后得增菌液，取ImL增菌液到2mL滅菌離心管中，加入20 μ L Dynabeads E. coli0157免疫磁珠富集lOmin，用100 μ L PBS_Tween20洗滌3次，提取細(xì)菌DNA。2、細(xì)菌DNA的提取取ImL磁珠富集的細(xì)菌培養(yǎng)物，IOOOOrpm離心3min，棄上清，沉淀加入50 μ LTE充分懸浮混勻，于100°C水浴IOmin,冰上冷卻3min, 12000r/min離心lOmin,取上清即為細(xì)菌
DNA，備用。
3、LAMP 擴(kuò)增25yL的環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增反應(yīng)體系包括2.5yL IOXThermopol反應(yīng)緩沖液、
O.4 μ LlOmmol/LdNTPs.O. 5 μ L 10 μ mol/L 上游外引物 F3、0. 5 μ L 10 μ mol/L 下游外引物Β3、1 μ L40 μ mol/L 上游內(nèi)引物 FIP、I μ L 40 μ mol/L 下游內(nèi)引物 BIP,O. 6 μ LIOOmmoI/LMgSO4> 12. 5 μ L2mol/L甜菜堿、2 μ L細(xì)菌DNA模板、4 μ L滅菌雙蒸水ddH20,Bst DNA聚合酶8U/ μ L，于ΡΕ2400 PCR儀上進(jìn)行65°C恒溫擴(kuò)增60min，得到環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增反應(yīng)(LAMP)產(chǎn)物。4、顯色劑觀察結(jié)果在反應(yīng)管的LAMP產(chǎn)物中加入I μ L顯色劑SYBR Green I，觀察顏色變化，反應(yīng)管顏色變?yōu)榫G色，檢測結(jié)果陽性，說明樣品中含有E.coli 0157，這與傳統(tǒng)國標(biāo)GB/T4789. 36-2008方法結(jié)果吻合，證明此方法數(shù)據(jù)可靠，而陰性對照(H2O)為橙色，陽性對照 (E. coli0157 H7NCTC12900 菌株 DNA)為綠色。實施例3 :冷鮮牛肉中大腸桿菌0157檢測I、樣品增菌將25g市場購買的牛肉樣品，加入到225mL萬古霉素-緩沖蛋白胨水中，42土1°C培養(yǎng)8h后得增菌液，取ImL增菌液到2mL滅菌離心管中，加入20 μ L Dynabeads· E. coli0157免疫磁珠富集lOmin，用100 μ L PBS_Tween20洗滌3次，提取細(xì)菌DNA。2、細(xì)菌DNA的提取取ImL磁珠富集的細(xì)菌培養(yǎng)物，IOOOOrpm離心3min，棄上清，沉淀加入50 μ LTE充分懸浮混勻，于100°C水浴IOmin,冰上冷卻3min, 12000r/min離心lOmin,取上清即為細(xì)菌
DNA，備用。3、LAMP 擴(kuò)增25yL的環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增反應(yīng)體系包括2.5yL IOXThermopol反應(yīng)緩沖液、
0.4 μ LlOmmol/LdNTPs.O. 5 μ L 10 μ mol/L 上游外引物 F3、0. 5 μ L 10 μ mol/L 下游外引物Β3、1 μ L40 μ mol/L 上游內(nèi)引物 FIP、I μ L 40 μ mol/L 下游內(nèi)引物 BIP,0. 6 μ LIOOmmoI/LMgSO4> 12. 5 μ L2mol/L甜菜堿、2 μ L細(xì)菌DNA模板、4 μ L滅菌雙蒸水ddH20,Bst DNA聚合酶8U/ μ L，于ΡΕ2400 PCR儀上進(jìn)行65°C恒溫擴(kuò)增60min，得到環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增反應(yīng)(LAMP)產(chǎn)物。4、顯色劑觀察結(jié)果在反應(yīng)管的LAMP產(chǎn)物中加入I μ L顯色劑SYBR Green I，觀察顏色變化，反應(yīng)管顏色為橙色，檢測結(jié)果陰性，說明樣品中E.coli 0157未檢出，這與傳統(tǒng)國標(biāo)GB/T4789. 36-2008方法的結(jié)果吻合，證明此方法數(shù)據(jù)可靠，而陰性對照(H2O)為橙色，陽性對照(E. coli0157 H7NCTC12900 菌株 DNA)為綠色。按照步驟2的方法提取表I所述菌株的DNA，分別按照步驟3和步驟4的方法進(jìn)行LAMP擴(kuò)增和顯色劑觀察結(jié)果，結(jié)果如表I所示，從表I可以看出，其他非目標(biāo)菌(如表I所示)擴(kuò)增和檢測結(jié)果均呈陰性橙色，表明此試劑盒和檢測方法具有較高的特異性。表I :非目標(biāo)菌的擴(kuò)增結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種應(yīng)用環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增檢測大腸埃希氏菌(Escherichia coli)0157的檢測引物組，其特征在于，由下列引物組成 上游外引物 F3 :5’ -TGCAACTACTGTAAGTAATGGA-3’ ； 下游外引物 B3 :5’ -TTGTTCTATGTCACTAACAGAC-3’ ；上游內(nèi)引物 FIP :5’ -TGTTGGAACAATAACTTCATCTCCT-ACGGTTGCTCTTCATTTAGC-3’ ；下游內(nèi)引物 BIP :5’ -AATGCTATAAAATACACAGGAGCCA-AITTGCCAAGTTTCATTATCTGA-3’。
2.一種非疾病的診斷和治療目的的大腸埃希氏菌0157的檢測方法，其特征在于，對樣品進(jìn)行增菌培養(yǎng)獲得增菌液，提取增菌液中的細(xì)菌DNA，然后通過環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增的方法用權(quán)利要求I所述的檢測引物組對細(xì)菌DNA進(jìn)行選擇性擴(kuò)增，確認(rèn)是否存在有擴(kuò)增產(chǎn)物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測方法，其特征在于，所述的樣品為肉制品。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測方法，其特征在于，所述的肉制品為豬肉或牛肉。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的檢測方法，其特征在于，所述的對樣品進(jìn)行增菌培養(yǎng)是將樣品接入選擇性增菌液中，然后在42土1°C培養(yǎng)61小時，獲得增菌液，所述的選擇性增菌液為每225ml緩沖蛋白胨水中含有8mg萬古霉素。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測方法，其特征在于，所述的通過環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增的方法用權(quán)利要求I所述的檢測引物組對細(xì)菌DNA進(jìn)行選擇性擴(kuò)增具體為環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增體系為體系總體積 25 μ L，包括 2. 5μ L IOXThermopol 反應(yīng)緩沖液、O. 4μ L I Ommo I/LdNTP S、O. 5 μ LlO μ mol/L 上游外引物 F3、0. 5 μ L 10 μ mol/L 下游外引物 B3、I μ L 40 μ mol/L 上游內(nèi)引物 FIP、lyL 4(^11101/1下游內(nèi)引物81 、0.6 4 1^100_01/1 MgS04U2. 5μ L 2mol/L 甜菜堿、4 μ L滅菌雙蒸水ddH20，Bst DNA聚合酶8U/ μ L和2 μ L細(xì)菌DNA，反應(yīng)條件為在溫度為65°C孵育45 60min。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測方法，其特征在于，所述的確認(rèn)是否存在有擴(kuò)增產(chǎn)物是利用電泳檢測、熒光顯色檢測或濁度檢測環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物是否具有擴(kuò)增產(chǎn)物。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的檢測方法，其特征在于，所述的用熒光顯色檢測，具體是在反應(yīng)管中加入SYBR Green I顯色劑，Γδπι η后觀察結(jié)果，如果顏色為橙色，則樣品大腸埃希氏菌0157陰性，無大腸埃希氏菌0157，如果顏色為綠色，則樣品大腸埃希氏菌0157陽性，含有大腸埃希氏菌0157。
9.一種大腸埃希氏菌0157的檢測試劑盒，包括環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增試劑和檢測引物組，其特征在于，所述的檢測引物組由下列引物組成 上游外引物 F3 :5’ -TGCAACTACTGTAAGTAATGGA-3’ 下游外引物 Β3 :5’ -TTGTTCTATGTCACTAACAGAC-3’上游內(nèi)引物 FIP :5’ -TGTTGGAACAATAACTTCATCTCCT-ACGGTTGCTCTTCATTTAGC-3’下游內(nèi)引物 BIP :5’ -AATGCTATAAAATACACAGGAGCCA-AITTGCCAAGTTTCATTATCTGA-3’。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述的大腸埃希氏菌0157的檢測試劑盒還包括選擇性增菌液，該選擇性增菌液為每225ml緩沖蛋白胨水中含有8mg萬古霉素。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種大腸桿菌O157的環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增檢測引物組、檢測方法和試劑盒。本發(fā)明針對大腸桿菌O157的rfbE基因，設(shè)計和篩選了一套特異性檢測引物組以及含有該檢測引物組的檢測試劑盒和利用該檢測試劑盒通過環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增的檢測方法，進(jìn)而確定待檢測樣品中是否存在大腸桿菌O157的檢測方法。本發(fā)明的檢測試劑盒和檢測方法具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確率達(dá)到99%、檢測時間短的優(yōu)點，從樣品處理到報告結(jié)果只需花8-10h，不需要PCR儀和電泳儀，操作過程簡單，解決了傳統(tǒng)檢測方法耗時長、傳統(tǒng)培養(yǎng)方法靈敏度低、血清凝集有交叉反應(yīng)等問題，對于及時有效地應(yīng)對食源性突發(fā)公共衛(wèi)生事件具有重大意義，特別適合基層檢測機(jī)構(gòu)和食品加工企業(yè)自檢使用。
文檔編號C12N15/11GK102943113SQ20121048029
公開日2013年2月27日 申請日期2012年11月22日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月22日
發(fā)明者張淑紅, 吳清平, 張菊梅, 賴則冰, 李海剛 申請人:廣東省微生物研究所, 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司