專(zhuān)利名稱(chēng)：一種基因重組大腸桿菌及其高效生產(chǎn)普魯蘭酶的方法
—種基因重組大腸桿菌及其高效生產(chǎn)普魯蘭酶的方法技術(shù)領(lǐng)域
一種基因重組大腸桿菌及其高效生產(chǎn)普魯蘭酶的方法，屬于微生物發(fā)酵生產(chǎn)普魯蘭酶的技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
普魯蘭酶(pullulanase，EC. 3. 2.1. 41)是一類(lèi)可以特異性水解普魯蘭、支鏈淀粉及其極限糊精中的α-1，6_糖苷鍵的脫支酶。在淀粉糖化過(guò)程中，普魯蘭酶與糖化酶共同作用，普魯蘭酶切割支鏈淀粉分支點(diǎn)，糖化酶只需切割線(xiàn)性的低聚糖，即可顯著地提高淀粉的水解效率。使用普魯蘭酶不僅可降低糖化酶用量，還可使DE值提高到97%以上，提高水解產(chǎn)物葡萄糖或麥芽糖的質(zhì)量和純度。
目前已發(fā)現(xiàn)多種產(chǎn)普魯蘭酶的微生物，但大部分都無(wú)法應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)，主要原因有(I)酶的耐熱耐酸性差，淀粉的糖化過(guò)程在55°c -60°c、pH 4. 5-5. O的范圍內(nèi)進(jìn)行， 而大多數(shù)種類(lèi)的普魯蘭酶在此范圍內(nèi)活性很低；(2)酶活水平低，很多普魯蘭酶產(chǎn)生菌胞外分泌普魯蘭酶的能力不強(qiáng)，分泌的普魯蘭酶又容易遭到蛋白酶的降解，因此難以進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)。目前，普魯蘭酶的工業(yè)化生產(chǎn)菌株極少，只有諾維信公司和杰能科公司有能力工業(yè)化生產(chǎn)并銷(xiāo)售此酶。諾維信公司的普魯蘭酶產(chǎn)品占領(lǐng)了中國(guó)乃至世界95%以上的市場(chǎng)份額，其價(jià)格相當(dāng)昂貴。我國(guó)關(guān)于普魯蘭酶的研究主要集中在產(chǎn)普魯蘭酶菌株的篩選和優(yōu)化等方面，效果均不太理想。隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，利用基因工程技術(shù)改造菌種，進(jìn)一步提高酶的產(chǎn)量及活性，降低生產(chǎn)成本成為可能，并在世界范圍內(nèi)越來(lái)越得到重視。近幾年， 我國(guó)學(xué)者利用基因工程技術(shù)構(gòu)建基因工程菌株，取得了一定的效果。例如，2006年，夏子芳 用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)海棲熱胞菌普魯蘭酶基因，得到少量酶活；2008年，張明焱在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)Iicheniforms的普魯蘭酶編碼基因，獲得5. 6 U/mL酶活；2010年,王淑軍等從深海古菌Thermococcus siculi HJ21中PCR擴(kuò)增出一種新的普魯蘭酶基因，并在大腸桿菌中得到表達(dá)，但酶活較低。綜上所述，在普魯蘭酶的微生物發(fā)酵生產(chǎn)過(guò)程中，不論是野生菌還是工程菌，主要存在的問(wèn)題就是胞外酶活較低，造成了普魯蘭酶的生產(chǎn)成本上升，形成工業(yè)化生產(chǎn)的障礙。
本發(fā)明利用基因工程表達(dá)調(diào)控技術(shù)，構(gòu)建了適用于普魯蘭酶表達(dá)分泌的基因工程菌株，在自誘導(dǎo)培養(yǎng)基中實(shí)現(xiàn)過(guò)量表達(dá)普魯蘭酶，并通過(guò)添加甘氨酸改變細(xì)胞通透性而進(jìn)一步提高胞外普魯蘭酶的產(chǎn)量，為工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。發(fā)明內(nèi)容
( I)要解決的技術(shù)問(wèn)題本發(fā)明的目的是提供基因重組大腸桿菌及其高效生產(chǎn)普魯蘭酶的方法。本發(fā)明目的不僅僅在于通過(guò)微生物菌株發(fā)酵生產(chǎn)胞外普魯蘭酶，而是通過(guò)構(gòu)建適合的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)將具有優(yōu)良的耐酸耐熱性能的長(zhǎng)野芽孢桿菌普魯蘭酶基因在大腸桿菌中獲得高效重組表達(dá)，而且利用自誘導(dǎo)培養(yǎng)基并通過(guò)添加甘氨酸調(diào)控細(xì)胞透性的策略進(jìn)一步提高重組大腸桿菌生產(chǎn)胞外普魯蘭酶的能力和產(chǎn)量，從而開(kāi)發(fā)新型重組普魯蘭酶的生產(chǎn)工藝和應(yīng)用價(jià)值。
(2)技術(shù)方案本發(fā)明首先構(gòu)建表達(dá)長(zhǎng)野芽孢桿菌UaciBm naganoensisXCTCC M 2012388普魯蘭酶基因的重組大腸桿菌，將來(lái)源于長(zhǎng)野芽孢桿菌的普魯蘭酶基因在大腸桿菌中進(jìn)行重組表達(dá)，在此基礎(chǔ)上，將重組大腸桿菌在自誘導(dǎo)培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)以高效表達(dá)普魯蘭酶，并通過(guò)添加甘氨酸獲得胞外普魯蘭酶的高效生產(chǎn)。
一種長(zhǎng)野芽抱桿菌naganoensis) LBMAE-1,已保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)CCTCC NO M 2012388 ；來(lái)源于CCTCC NO M 2012388菌株的普魯蘭酶基因/^7，其核苷酸序列為SEQ ID NO:1，其氨基酸序列為SEQ ID NO: 2。
用CCTCC NO M 2012388菌株構(gòu)建重組大腸桿菌疋coli BL21 (DE3)/ pET28a(+)-PelB-/^7的方法，將來(lái)源于CCTCC NO M 2012388菌株的普魯蘭酶基因在大腸桿菌中進(jìn)行重組表達(dá)；步驟為一、普魯蘭酶基因的獲得CCTCC NO Μ 2012388 培養(yǎng)基=CaCl2 O. 25 g/L, MgSO4 · 7H20 O. 5 g/L,(NH4) 2SO4 0.2 g/L,酵母提取物2 g/L,無(wú)水葡萄糖5 g/L, KH2PO4 3 g/L,無(wú)機(jī)鹽溶液 I mL/L，用雙蒸水配制，pH 5. O。無(wú)機(jī)鹽溶液=ZnSO4 · 7H20 O.1 g/L, MnCl2 · H2O O. 03 g/ L, H3BO3 O. 3 g/L, CoCl2 · 6H20 0. 2 g/L, CuCl2 · 2H20 0. 01 g/L, NiCl2 · 6H20 0. 02 g/L, Na2MoO4 · 2H20 0. 03 g/L。
將CCTCC NO M 2012388菌種接種于含有25 mL培養(yǎng)基的250 mL搖瓶中，于37°C、 200 rpm振蕩培養(yǎng)7 2 h。培養(yǎng)結(jié)束后，將菌體離心并用生理鹽水洗滌兩次，收集細(xì)胞利用基因組 DNA 提取試劑盒 Genomic DNA Extraction Miniprep System (VI0GENE 公司)提取基因組DNA。
合成引物1:5，- RaacaGGATCCaRatRRRaacaccacaaaC _3，，合成弓I物 2 :5’ - attccctcgagtttaccatcagatgggct -3’。
引物I含有BamHl限制性酶切位點(diǎn)，引物2含有Xho I限制性酶切位點(diǎn)。
PCR 反應(yīng)體系ddH20 37 μ L，10 X Reaction Buffer 5 μ L,dNTP(25 mmol/L)0. 5 yL，引物 I (50 pmol/μ L) I yL，引物 2 (50 pmol/μ L) I μ L，基因組 DNA 5 μ L，Taq DNA polymerase (5 U/μ L) 0. 5 μ L。
以CCTCC NO M 2012388基因組DNA為模板，采用PCR方法擴(kuò)增普魯蘭酶基因。 PCR反應(yīng)過(guò)程95°C預(yù)變性5 min ；95°C I min、60°C O. 5 min、72°C 2 min，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)； 72°C延伸 10 min。
利用3S Spin Agarose Gel DNA Purification Kit(上海申能博彩生物科技有限公司)純化DNA片斷。
DNA溶液中加入1/10體積的乙酸鈉溶液(3 mol/L, pH 5. 2)和2倍體積無(wú)水乙醇，-20°C沉淀 lh。12000 rpm 于 4°C離心 30 min。加入 75% 乙醇 500 μ L 洗滌，12000 rpm 于4°C離心30 min，無(wú)菌操作臺(tái)吹干后溶于適量TE緩沖液中，所得普魯蘭酶基因立即使用或_20°C保存。
二、含有普魯蘭酶基因的重組大腸桿菌的構(gòu)建目的基因Z^/7及質(zhì)粒pET20b (+)的酶切利用質(zhì)粒提取試劑盒Min1-Plasmid Rapid Isolation Kit (北京博大泰克生物基因技術(shù)有限公司)提取質(zhì)粒pET20b (+)。
按照水、緩沖液、PCR產(chǎn)物或質(zhì)粒DNA、酶的順序加到Eppendorf管中，蓋好管蓋， 振蕩使液體充分混勻，置于離心機(jī)內(nèi)離心2s使液體集中于管底，37°C水浴3h，在管中加入 1/10的Loading Buffer或?qū)⒐苤糜?5°C保溫lOmin，終止酶切反應(yīng)。酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析并切膠回收目的片段，濃縮。
反應(yīng)體系組成10XHBuffer 4 μ L，基因組 DNA 10 μ L, BamHl 2 μ L, Xhol 2 μ L, ddH20將體系補(bǔ)足40 μ L0
目的基因pul與質(zhì)粒pET20b (+)的連接將目的基因/^/7與質(zhì)粒pET20b (+)連接，反應(yīng)體系組成如下質(zhì)粒pET20b (+) 0.8 μ L， 目的基因Ζ^/74.2 μ L7Ligation Solution 5 μ L0混合連接液，將其置于16°C培養(yǎng)箱中連接反應(yīng)12小時(shí)，得重組質(zhì)粒pET20b (+) -pul。
重組質(zhì)粒pET20b (+) -pul轉(zhuǎn)化大腸桿菌在100 μ L大腸桿菌疋coli BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞懸液中加入10 μ L重組質(zhì)粒 pET20b (+)-/^/7，輕輕混勻，冰浴中靜置30分鐘。轉(zhuǎn)入42°C水浴中，熱擊90s。快速轉(zhuǎn)移至冰浴中，冷卻2min。加入700 μ L的LB液體培養(yǎng)基，37°C、100 rpm搖床溫育培養(yǎng)lh。培養(yǎng)后菌液3000 rpm離心2min,棄上清600 μ L,剩余菌液混勻后涂布到含有50 μ g/mL氨節(jié)抗生素的LB平板上，37°C倒置培養(yǎng)。獲得含有目的普魯蘭酶基因的重組大腸桿菌疋 coli BL21 (DE3) / pET20b (+) _/^/人
帶有信號(hào)肽PelB的目的基因與質(zhì)粒pET28a(+)的連接將重組質(zhì)粒pET20b (+)-/^/7及表達(dá)載體pET28a(+)分別用限制性?xún)?nèi)切酶油al RXhol 分步單酶切。按照水、緩沖液、重組質(zhì)粒pET20b(+)-/7W或表達(dá)載體pET28a(+)、酶的順序加到Eppendorf管中，蓋好管蓋，振蕩使液體充分混勻，置于離心機(jī)內(nèi)離心2s使液體集中于管底，37°C水浴3h，在管中加入1/10的Loading Buffer或?qū)⒐苤糜?5°C保溫lOmin，終止酶切反應(yīng)。酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析并切膠回收目的片段，濃縮。反應(yīng)體系組成10XH Buffer 4 μ L，pET20b (+)或 pET28a(+) 10 μ I,IbaI 2 μ I,IAoI 2 μ L, ddH20將體系補(bǔ)足40 μ L0
將膠回收線(xiàn)性化的目標(biāo)片段PelB_/w7與pET28a(+)載體連接，反應(yīng)體系組成如下載體 pET28a(+) I μ L,目標(biāo)片段 PelB_/w/74 μ L, Ligation Solution 5 μ L?；旌线B接液，將其置于16°C培養(yǎng)箱中連接反應(yīng)12小時(shí)，得重組質(zhì)粒pET28a(+)-PelB-Z^人
重組質(zhì)粒pET28a (+) -VeYQ-pul轉(zhuǎn)化大腸桿菌在100 μ L大腸桿菌萬(wàn).coli BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞懸液中加入10 μ L pET28a(+)-PelB-/^7，輕輕混勻，冰浴中靜置30min。轉(zhuǎn)入42°C水浴中，熱擊90s?？焖俎D(zhuǎn)移至冰浴中，冷卻2min。加入700 μ L的LB液體培養(yǎng)基，37°C、100 rpm搖床溫育培養(yǎng)lh。培養(yǎng)后菌液3000 rpm離心2min,棄上清600 μ L,剩余菌液混勻后涂布到含有50 μ g/mL卡那霉素的LB平板上，37°C倒置培養(yǎng)。獲得含有目的普魯蘭酶基因的重組大腸桿菌疋 coli BL21 (DE3) / pET28a (+)-PelB-/w人
三、重組大腸桿菌的培養(yǎng)和胞外普魯蘭酶的生產(chǎn)自誘導(dǎo)培養(yǎng)自誘導(dǎo)培養(yǎng)基(g/L) :β_乳糖I 50，無(wú)水葡萄糖O. 5，甘油5，KH2PO4 6. 8，MgSO4 O. 24， 胰蛋白胨10，酵母提取物5，Na2HPO4 7. LNa2SO4 O. 71，NH4Cl 2. 67，痕量元素溶液400 μ L/ L, pH 7. 5 8· O。
痕量元素溶液(g/L)=FeCl3 8. 125，CaCl2 2. 22, MnCl2 2. 52, ZnSO41. 61, CoCl2O.26，CuCl2 O. 27，NiCl2 O. 26，Na2MoO4 O. 41，Na2SeO3 O. 346，H3BO3 O. 124，HCl 2. 19。
將重組菌疋co7iBL21 (DE3) / pET28a (+) -PelB-/w7 于含有 50 μ g/mL 卡那霉素的 LB固體培養(yǎng)基上過(guò)夜活化培養(yǎng)，從固體平板上挑取單個(gè)菌落接種于3 mL含有50 μ g/mL 卡那霉素的液體LB培養(yǎng)基中于37°C、200 rpm振蕩培養(yǎng)，隨時(shí)監(jiān)測(cè)培養(yǎng)基中OD6tltl的變化情況，待0D_達(dá)到2 3時(shí)，按5% 10%接種量接種于50 mL含50 μ g/mL卡那霉素的自誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，于l(T40°C、200rpm震蕩培養(yǎng)2 20h后，添加終濃度I 25 g/L的甘氨酸，溫度轉(zhuǎn)為 1(T40°C培養(yǎng)6(T70h。培養(yǎng)結(jié)束后，將發(fā)酵液于10000 rpm離心IOmin后得發(fā)酵上清用于菌株胞外酶活的測(cè)定。
分別考察了誘導(dǎo)溫度、甘氨酸使用濃度、37°C下培養(yǎng)時(shí)間和乳糖濃度的影響，最終確定了自誘導(dǎo)條件為自誘導(dǎo)培養(yǎng)基中乳糖濃度為10 g/L，在37°C下培養(yǎng)2h后，添加終濃度6 g/L的甘氨酸并轉(zhuǎn)入20°C下培養(yǎng)70h。培養(yǎng)結(jié)束后,將發(fā)酵液于10000 rpm離心IOmin 后得發(fā)酵上清用于菌株胞外酶活的測(cè)定。
采用優(yōu)化的自誘導(dǎo)培養(yǎng)基和發(fā)酵產(chǎn)酶條件后，胞外普魯蘭酶酶活可達(dá)到505 U/ mL。
普魯蘭酶測(cè)定方法取100 μ L用100 mM、pH 5. O的醋酸緩沖液適當(dāng)稀釋的酶液與等體積的溶于100 mM、 pH 5. O醋酸緩沖液中的10 g/L普魯蘭相混合于50 °C水浴中保溫30min。加入DNS試劑 300 μ L搖勻，置于沸水中煮沸15min，取出以流動(dòng)水迅速冷卻后，于540 nm波長(zhǎng)處，以O(shè). 5 cm比色杯,測(cè) 定反應(yīng)液的吸光度值。
酶活單位定義在上述指定的條件下，每min催化分解普魯蘭多糖生成相當(dāng)于I μ mol葡萄糖的還原糖所需的酶為I個(gè)酶活單位(U)。
(3)有益效果成功克隆了長(zhǎng)野芽孢桿菌(也CiBw1S naganoensis) CCTCC NO M 2012388普魯蘭酶編碼基因，該基因全長(zhǎng)2781 bp，編碼926個(gè)氨基酸殘基，其基因的核苷酸序列為SEQ ID NO: 1，其氨基酸組成為SEQ ID N0:2。
將質(zhì)粒pET20b(+)的信號(hào)妝 PelB 與長(zhǎng)野芽抱桿菌naganoensis)CCTCC NO M 2012388普魯蘭酶編碼基因連結(jié)，并共同插入表達(dá)載體pET28a(+)中，轉(zhuǎn)化入相應(yīng)表達(dá)宿主瓦BL21(DE3)中成功構(gòu)建帶有信號(hào)肽和目的基因/^7的重組菌株萬(wàn).coli BL21 (DE3) / pET28a(+)-PelB-Z^人
將自誘導(dǎo)培養(yǎng)基和添加甘氨酸調(diào)控細(xì)胞透性的策略用于重組大腸桿菌疋coli BL21 (DE3)/ pET28a(+)-PelB-/w7的培養(yǎng)和普魯蘭酶的發(fā)酵產(chǎn)酶，優(yōu)化自誘導(dǎo)培養(yǎng)基和發(fā)酵產(chǎn)酶條件后，胞外普魯蘭酶酶活可以達(dá)到505 U/mL,比長(zhǎng)野芽孢桿菌OfeciJAz1S naganoensis) CClCC M 2012388出發(fā)菌株的酶活力(O. 4 U/mL)提高1260倍。這些工作為重組大腸桿菌高效生產(chǎn)胞外普魯蘭酶提供了有效策略，對(duì)于開(kāi)發(fā)新型重組胞外普魯蘭酶的生產(chǎn)工藝和應(yīng)用價(jià)值具有重要意義。
生物材料樣品保藏長(zhǎng)野芽孢桿菌iBaciIlus naganoensis ) LBMAE-1已進(jìn)行保藏，保藏單位中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，簡(jiǎn)寫(xiě)CCTCC，地址中國(guó)武漢武漢大學(xué)，保藏編號(hào) CCTCC NO M 2012388，保藏日期為 2012 年 9 月 28 日。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1LB培養(yǎng)基胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L, NaCl 10 g/L, pH7. O。需要時(shí)使用前加入卡那霉素(50 μ g/mL)，固體培養(yǎng)基添加15 g/L瓊脂粉。
挑取重組大腸桿菌萬(wàn).coli BL21 (DE3)/ pET28a(+)-PelB-/^7陽(yáng)性克隆單菌落接種于3 mL含50 μ g/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，于37°C，200 rpm振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。 取I mL培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接于50 mL含50 μ g/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，于37°C、200 rpm 振蕩培養(yǎng)至OD6tltl約為O. 6。向培養(yǎng)物中加入誘導(dǎo)物IPTG至終濃度O. 8 mmol/L，在培養(yǎng)溫度30°C下進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)12h。培養(yǎng)結(jié)束后，將發(fā)酵液于10000 rpm離心IOmin后得發(fā)酵上清用于菌株胞外酶活的測(cè)定。利用LB培養(yǎng)基和IPTG誘導(dǎo)方式，獲得胞外重組普魯蘭酶活力為8 U/mL。
實(shí)施例2 LB培養(yǎng)基胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L, NaCl 10 g/L, pH7. O。需要時(shí)使用前加入卡那霉素(50 μ g/mL)，固體培養(yǎng)基添加15 g/L瓊脂粉。
挑取重組大腸桿菌萬(wàn).coli BL21 (DE3)/ pET28a(+)-PelB-/^7陽(yáng)性克隆單菌落接種于3 mL含50 μ g/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，于37°C，200 rpm振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。 取I mL培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接于50 mL含50 μ g/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，于37°C、200 rpm 振蕩培養(yǎng)至OD6tltl約為O. 6。向培養(yǎng)物中加入誘導(dǎo)物IPTG至終濃度O. 4 mmol/L，在培養(yǎng)溫度30°C下進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)12h。培養(yǎng)結(jié)束后，將發(fā)酵液于10000 rpm離心IOmin后得發(fā)酵上清用于菌株胞外酶活的測(cè)定。利用LB培養(yǎng)基和IPTG誘導(dǎo)方式，獲得胞外重組普魯蘭酶活力為 11 U/mL。
實(shí)施例3自誘導(dǎo)培養(yǎng)基(g/L) :β_乳糖10，無(wú)水葡萄糖O. 5，甘油5，KH2PO4 6. 8，MgSO4 O. 24，胰蛋白胨 10，酵母提取物 5，Na2HPO4 7. 1，Na2SO4 O. 71，NH4Cl 2. 67，痕量元素溶液 400 μ L / L, pH 7. 5 8· O。痕量元素溶液(g/L) =FeCl3 8. 125，CaCl2 2. 22，MnCl2 2. 52，ZnSO41. 61， CoCl2 O. 26, CuCl2 O. 27, NiCl2 O. 26, Na2MoO4 O. 41, Na2SeO3 O. 346, H3BO3 O. 124, HCl 2.19。
重組菌疋co7iBL21 (DE3) / pET28a (+) - el^>-pul 菌液接種于 50 mL含 50mg/L卡那霉素的自誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，于37°C、200rpm震蕩培養(yǎng)3小時(shí)后，添加終濃度6 g/L的甘氨酸， 溫度轉(zhuǎn)為20°C培養(yǎng)60小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后，將發(fā)酵液于10000 rpm離心10分鐘后得發(fā)酵上清用于菌株胞外酶活的測(cè)定。采用自誘導(dǎo)培養(yǎng)基和優(yōu)化的發(fā)酵產(chǎn)酶條件后，胞外普魯蘭酶酶活可達(dá)到306. 5 U/mL。
實(shí)施例4自誘導(dǎo)培養(yǎng)基(g/L) :β_乳糖10，無(wú)水葡萄糖O. 5，甘油5，KH2PO4 6. 8，MgSO4 O. 24，胰蛋白胨 10，酵母提取物 5，Na2HPO4 7.1,Na2SO4 O. 71 ,NH4Cl 2. 67，痕量元素溶液 400 μ L/L，pH 7· 5 8· 0。痕量元素溶液(g/L) =FeCl3 8. 125, CaCl2 2· 22，MnCl2 2. 52, ZnSO41. 61, CoCl2O.26，CuCl2 O. 27，NiCl2 O. 26，Na2MoO4 O. 41，Na2SeO3 O. 346，H3BO3 O. 124，HCl 2. 19。
重組菌疋co7iBL21 (DE3) / pET28a (+) - el^>-pul 菌液接種于 50 mL 含 50mg/L 卡那霉素的自誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，于37°C、200rpm震蕩培養(yǎng)2h后，添加終濃度6 g/L的甘氨酸，溫度轉(zhuǎn)為20°C培養(yǎng)60h。培養(yǎng)結(jié)束后，將發(fā)酵液于10000 rpm離心10分鐘后得發(fā)酵上清用于菌株胞外酶活的測(cè)定。采用自誘導(dǎo)培養(yǎng)基和優(yōu)化的發(fā)酵產(chǎn)酶條件后，胞外普魯蘭酶酶活可達(dá)到 440. 7 U/mL。
實(shí)施例5自誘導(dǎo)培養(yǎng)基(g/L) :β_乳糖10，無(wú)水葡萄糖O. 5，甘油5，KH2PO4 6. 8，MgSO4 O. 24，胰蛋白胨 10，酵母提取物 5，Na2HPO4 7.1,Na2SO4 O. 71 ,NH4Cl 2. 67，痕量元素溶液 400 μ L/L， pH 7· 5 8· O。痕量元素溶液(g/L) =FeCl3 8. 125,CaCl2 2· 22，MnCl2 2. 52,ZnSO41. 61,CoCl2O.26，CuCl2 O. 27，NiCl2 O. 26，Na2MoO4 O. 41，Na2SeO3 O. 346，H3BO3 O. 124，HCl 2. 19。
重組菌疋co7iBL21 (DE3) / pET28a (+) - el^>-pul 菌液接種于 50 mL 含 50mg/L 卡那霉素的自誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，于37°C、200rpm震蕩培養(yǎng)3h后，添加終濃度6 g/L的甘氨酸，溫度轉(zhuǎn)為20°C培養(yǎng)70h。培養(yǎng)結(jié)束后，將發(fā)酵液于10000 rpm離心10分鐘后得發(fā)酵上清用于菌株胞外酶活的測(cè)定。采用自誘導(dǎo)培養(yǎng)基和優(yōu)化的發(fā)酵產(chǎn)酶條件后，胞外普魯蘭酶酶活可達(dá)到 405. 2 U/mL。
實(shí)施例6自誘導(dǎo)培養(yǎng)基(g/L) :β_乳糖10，無(wú)水葡萄糖O. 5，甘油5，KH2PO4 6. 8，MgSO4 O. 24，胰蛋白胨 10，酵母提取物 5，Na2HPO4 7.1,Na2SO4 O. 71 ,NH4Cl 2. 67，痕量元素溶液 400 μ L/L， pH 7· 5 8· O。痕量元素溶液(g/L) =FeCl3 8. 125,CaCl2 2· 22，MnCl2 2. 52,ZnSO41. 61,CoCl2O.26，CuCl2 O. 27，NiCl2 O. 26，Na2MoO4 O. 41，Na2SeO3 O. 346，H3BO3 O. 124，HCl 2. 19。
重組菌疋co7iBL21 (DE3) / pET28a (+) - el^>-pul 菌液接種于 50 mL 含 50mg/L 卡那霉素的自誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，于37°C、200rpm震蕩培養(yǎng)2h后，添加終濃度6 g/L的甘氨酸，溫度轉(zhuǎn)為20°C培養(yǎng)70h。培養(yǎng)結(jié)束后，將發(fā)酵液于10000 rpm離心10分鐘后得發(fā)酵上清用于菌株胞外酶活的測(cè)定。采用自誘導(dǎo)培養(yǎng)基和優(yōu)化的發(fā)酵產(chǎn)酶條件后，胞外普魯蘭酶酶活可達(dá)到 505 U/mL。
權(quán)利要求
1.一種長(zhǎng)野芽孢桿菌(ifeci77w5· Aagafloefl1Si1S) LBMAE-1,已保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)CCTCC NO M 2012388 ；來(lái)源于CCTCC NO M 2012388菌株的普魯蘭酶基因/^7，其核苷酸序列為SEQ ID NO:1，其氨基酸序列為SEQ ID NO: 2。
2.用權(quán)利要求1所述CCTCCNO M 2012388菌株構(gòu)建重組大腸桿菌疋coli BL21 (DE3) / pET28a(+)-PelB-/^7的方法，其特征在于將來(lái)源于CCTCC NO M 2012388菌株的普魯蘭酶基因在大腸桿菌中進(jìn)行重組表達(dá)；步驟為(1)普魯蘭酶基因的獲得CCTCC NO Μ 2012388 培養(yǎng)基CaCl2 O. 25 g/L，MgSO4 · 7H20 O. 5 g/L, (NH4)2SO4 0.2 g/L，酵母提取物2 g/L，無(wú)水葡萄糖5 g/L, KH2PO4 3 g/L，無(wú)機(jī)鹽溶液I mL/L，用雙蒸水配制，pH 5. O ；無(wú)機(jī)鹽溶液=ZnSO4 · 7H20 O.1 g/L, MnCl2 · H2O O. 03 g/L, H3BO3 O. 3 g/L, CoCl2 · 6H20 0. 2 g/L, CuCl2 · 2H20 0. 01 g/L, NiCl2 · 6H20 0. 02 g/L, Na2MoO4 · 2H20 0. 03 g/L ；將CCTCC NO M 2012388菌種接種于含有25 mL培養(yǎng)基的250 mL搖瓶中，于37°C、 200 rpm振蕩培養(yǎng)72 h，培養(yǎng)結(jié)束后，將菌體離心并用生理鹽水洗滌兩次，收集細(xì)胞，利用 VI0GENE 公司的基因組DNA提取試劑盒Genomic DNA Extraction Miniprep System提取基因組DNA ；弓I物1:5，- gaacaGGATCCagatgggaacaccacaaaC Sf,弓I物 2 :5，- attccctcgagtttaccatcagatgggct _3，；引物I含韋BamHl限制性酶切位點(diǎn)，引物2含有通ο I限制性酶切位點(diǎn)；PCR 反應(yīng)體系ddH20 37 μ L，10 X Reaction Buffer 5 μ L,25 mmol/L 的 dNTP 0.5 μ L,50 pmol/μ L 的引物 I 取 I yL，50 pmol/μ L 的引物 2 取 I μ L，基因組 DNA 5 μ L,5 U/μ L 的 Taq DNA polymerase 0. 5 μ L ；以CCTCC NO Μ 2012388基因組DNA為模板，采用PCR方法擴(kuò)增普魯蘭酶基因，PCR反應(yīng)過(guò)程95°C預(yù)變性 5 min ；95°C I min,60°C 0. 5 min、72°C 2 min，進(jìn)行 30 個(gè)循環(huán)；72°C 延伸10 min ；利用上海申能博彩生物科技有限公司的3S Spin Agarose Gel DNA Purification Kit 純化DNA片斷DNA溶液中加入1/10體積pH 5. 2、3 mo I/L的乙酸鈉溶液和2倍體積無(wú)水乙醇，_20°C 沉淀lh，12000 rpm于4°C離心30 min，加入75%乙醇500 μ L洗滌，12000 rpm于4°C離心 30 min，無(wú)菌操作臺(tái)吹干后溶于適量TE緩沖液中，所得普魯蘭酶基因立即使用或-20°C 保存；(2)含有普魯蘭酶基因的重組大腸桿菌的構(gòu)建目的基因/^/7及質(zhì)粒pET20b (+)的酶切利用北京博大泰克生物基因技術(shù)有限公司的質(zhì)粒提取試劑盒Min1-Plasmid Rapid Isolation Kit 提取質(zhì)粒 pET20b (+)；按照水、緩沖液、PCR產(chǎn)物或質(zhì)粒DNA、酶的順序加到Eppendorf管中，蓋好管蓋，振蕩使液體充分混勻，置于離心機(jī)內(nèi)離心2s使液體集中于管底，37°C水浴3h，在管中加入1/10的 Loading Buffer或?qū)⒐苤糜?5°C保溫lOmin，終止酶切反應(yīng)，酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析并切膠回收目的片段，濃縮；反應(yīng)體系組成10 XH Buffer 4 μ L，基因組 DNA 10 μ L, BamHl 2 μ I, Ι οΙ 2 μ L, ddH20將體系補(bǔ)足40 μ L ；目的基因/^/7與質(zhì)粒pET20b (+)的連接將目的基因/^/7與質(zhì)粒pET20b (+)連接，反應(yīng)體系組成如下質(zhì)粒pET20b (+) 0.8 μ L， 目的基因4. 2 μ L7Ligation Solution 5 μ L，混合連接液，將其置于16°C培養(yǎng)箱中連接反應(yīng)12h，得重組質(zhì)粒pET20b (+) -pul ；重組質(zhì)粒pET20b (+) -pul轉(zhuǎn)化大腸桿菌在100 μ L大腸桿菌疋coli BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞懸液中加入10 μ L重組質(zhì)粒 pET20b (+) -/^/7，輕輕混勻，冰浴中靜置30min，轉(zhuǎn)入42°C水浴中，熱擊90s ;快速轉(zhuǎn)移至冰浴中，冷卻2 min,加入700 μ L的LB液體培養(yǎng)基，37°C、100 rpm搖床溫育培養(yǎng)lh，培養(yǎng)后菌液3000 rpm離心2 min,棄上清600 μ L,剩余菌液混勻后涂布到含有50 μ g/mL氨節(jié)抗生素的LB平板上，37°C倒置培養(yǎng)，獲得含有目的普魯蘭酶基因的重組大腸桿菌疋coli BL21 (DE3) / pET20b (+) -pul ；帶有信號(hào)肽PelB的目的基因與質(zhì)粒pET28a(+)的連接將重組質(zhì)粒pET20b (+)-/^/7及表達(dá)載體pET28a(+)分別用限制性?xún)?nèi)切酶油al RXhol 分步單酶切，按照水、緩沖液、重組質(zhì)粒pET20b (+) -pul或表達(dá)載體pET28a(+)、酶的順序加到Eppendorf管中，蓋好管蓋，振蕩使液體充分混勻，置于離心機(jī)內(nèi)離心2s使液體集中于管底，37°C水浴3h，在管中加入1/10的Loading Buffer或?qū)⒐苤糜?5°C保溫10 min，終止酶切反應(yīng)；酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析并切膠回收目的片段，濃縮；反應(yīng)體系組成 IOXH Buffer 4 μ L，pET20b (+)-/ 7 或pET28a (+) 10 μ I,IbaI 2 μ Ι,Ι οΙ 2 μ L, ddH20 將體系補(bǔ)足40 μ L ;將膠回收線(xiàn)性化的目標(biāo)片段PelB-/w7與pET28a(+)載體連接，反應(yīng)體系組成如下載體 pET28a(+) I μ L,目標(biāo)片段 PelB-/w/7 4 μ L, Ligation Solution 5 μ L,混合連接液， 將其置于16°C培養(yǎng)箱中連接反應(yīng)12h，得重組質(zhì)粒pET28a(+)-PelB-/w7 ；重組質(zhì)粒pET28a(+)-PelB-/ W轉(zhuǎn)化大腸桿菌在100 μ L大腸桿菌疋coli BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞懸液中加入10 μ L pET28a(+)-PelB-/^7，輕輕混勻，冰浴中靜置30 min，轉(zhuǎn)入42°C水浴中，熱擊90s，快速轉(zhuǎn)移至冰浴中，冷卻2 min,加入700 μ L的LB液體培養(yǎng)基，37°C、100 rpm搖床溫育培養(yǎng)lh，培養(yǎng)后菌液3000 rpm離心2 min,棄上清600 μ L,剩余菌液混勻后涂布到含有50 μ g/mL 卡那霉素的LB平板上，37°C倒置培養(yǎng)，獲得含有目的普魯蘭酶基因的重組大腸桿菌疋 coli BL21 (DE3) / pET28a (+)-PelB-/w人
3.用權(quán)利要求2所述重組大腸桿菌疋coli BL21 (DE3)/ pET28a(+)-PelB-/w7生產(chǎn)胞外普魯蘭酶的方法，其特征在于自誘導(dǎo)培養(yǎng)自誘導(dǎo)培養(yǎng)基g/L :β-乳糖I 50，無(wú)水葡萄糖0.5，甘油5,KH2PO4 6. 8,MgSO4 0.24，胰蛋白胨 10，酵母提取物 5，Na2HPO4 7. l，Na2S04 0. 71 ,NH4Cl 2. 67，痕量元素溶液 400 μ L/L， 用雙蒸水配制，PH 7. 5^8. O ；痕量元素溶液 g/L =FeCl3 8. 125，CaCl2 2. 22，MnCl2 2. 52，ZnSO41. 61，CoCl2 0. 26， CuCl2 0. 27，NiCl2 0. 26，Na2MoO4 0. 41，Na2SeO3 0. 346，H3BO3 0. 124，HCl 2. 19 ；將重組菌疋 coli BL21 (DE3) / pET28a(+) - el^>-pul 于含有 50 μ g/mL 卡那霉素的 LB 固體培養(yǎng)基上過(guò)夜活化培養(yǎng)，從固體平板上挑取單個(gè)菌落接種于3 mL含有·50 μ g/mL卡那霉素的液體LB培養(yǎng)基中于37°C、200 rpm振蕩培養(yǎng)，隨時(shí)監(jiān)測(cè)培養(yǎng)基中OD6tltl的變化情況，待 0D_達(dá)到2 3時(shí)，按5°/Γ Ο%接種量接種于50 mL含50 μ g/mL卡那霉素的自誘導(dǎo)培養(yǎng)基中， 于l(T40°C、200rpm震蕩培養(yǎng)2 20h后，添加終濃度I 25g/L的甘氨酸，溫度轉(zhuǎn)為1(T40°C培養(yǎng)6(T70h;培養(yǎng)結(jié)束后，將發(fā)酵液于10000 rpm離心10 min后得發(fā)酵上清用于菌株胞外酶活的測(cè)定。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述重組大腸桿菌疋coli BL21 (DE3)/ pET28a(+)-PelB-/^7生產(chǎn)胞外普魯蘭酶的方法，其特征在于分別考察了誘導(dǎo)溫度、甘氨酸使用濃度、37°C下培養(yǎng)時(shí)間和乳糖濃度的影響，最終確定了自誘導(dǎo)條件為自誘導(dǎo)培養(yǎng)基中乳糖濃度為10 g/L，在 37°C下培養(yǎng)2h后，添加終濃度6g/L的甘氨酸并轉(zhuǎn)入20°C下培養(yǎng)70h ;培養(yǎng)結(jié)束后，將發(fā)酵液于10000 rpm離心10 min后得發(fā)酵上清用于菌株胞外酶活的測(cè)定；胞外普魯蘭酶酶活達(dá) 505 U/mL。
全文摘要
一種基因重組大腸桿菌及其高效生產(chǎn)普魯蘭酶的方法，屬于微生物發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明將質(zhì)粒pET20b(+)的信號(hào)肽PelB與長(zhǎng)野芽孢桿菌(Bacillusnaganoensis)CCTCC NOM2012388普魯蘭酶基因pul連接，并共同插入表達(dá)載體pET28a(+)中，構(gòu)建帶有信號(hào)肽和目的基因的重組菌株E.coliBL21(DE3)/pET28a(+)-PelB-pul。將自誘導(dǎo)培養(yǎng)和添加甘氨酸調(diào)控細(xì)胞透性的策略用于胞外普魯蘭酶的發(fā)酵生產(chǎn)，采用乳糖濃度10g/L的自誘導(dǎo)培養(yǎng)基，于37℃、200rpm震蕩培養(yǎng)約2h后，添加終濃度6g/L的甘氨酸并轉(zhuǎn)入20℃下培養(yǎng)70h，胞外普魯蘭酶酶活達(dá)505U/mL，比野生菌出發(fā)菌株的酶活力提高1260倍。本發(fā)明的應(yīng)用具有重要意義。
文檔編號(hào)C12N1/21GK102994425SQ201210481749
公開(kāi)日2013年3月27日 申請(qǐng)日期2012年11月24日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月24日
發(fā)明者聶堯, 徐巖, 嚴(yán)偉 申請(qǐng)人:江南大學(xué)