專利名稱：豬偽狂犬病病毒強(qiáng)毒株、其基因缺失疫苗株及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株病毒強(qiáng)毒株以及在其基礎(chǔ)上獲得的基因缺失疫苗株，尤其涉及一株豬偽狂犬病病毒強(qiáng)毒株HeNl、由該強(qiáng)毒株HeNl缺失gE基因獲得的基因缺失疫苗株rPRV-gE_-EGFP+，本發(fā)明還涉及HeNl和疫苗株rPRV-gE_-EGFP+在預(yù)防或治療豬偽狂犬病中的應(yīng)用，本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
偽狂犬病(Pseudorabies,PR 又名 Aujeszky’s disease, AD)是由偽狂犬病病毒(Pseudorabies Virus, PRV)引起的多種家畜、野生動(dòng)物、伴侶動(dòng)物和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的一種急性傳染病。在自然條件下，本病最常見于豬、牛、羊、犬、貓和鼠類。偽狂犬病病毒除對豬以外，對所有易感動(dòng)物都是致死性病程。對豬主要表現(xiàn)為神經(jīng)癥狀、流涎、呼吸困難、繁殖障礙、生長停滯、失重及高死亡率。哺乳仔豬感染偽狂犬病的臨床表現(xiàn)最為典型、嚴(yán)重和一致，均出 現(xiàn)神經(jīng)癥狀、麻痹、衰竭死亡，死亡率幾乎高達(dá)100% ;隨著年齡增長死亡率逐漸下降，成豬僅為2%，但一般情況下成豬感染不發(fā)病，而呈隱形經(jīng)過，僅見打噴嚏、咳嗽、體溫升高等輕微癥狀；妊娠母豬感染偽狂犬病毒可引起流產(chǎn)、死胎、產(chǎn)弱仔和木乃伊化胎兒；對公豬可引起睪丸鞘膜炎。該病具有高度的傳染性，一旦在豬群中發(fā)現(xiàn)，將很快通過空氣和接觸經(jīng)呼吸道傳播給其他豬只和豬場，近來的研究表明偽狂犬病病毒還可以通過乳汁和生殖道感染。在規(guī)?；i場，PR是常規(guī)免疫防控對象。利用強(qiáng)弱毒鑒別ELISA進(jìn)行的血清流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，基因缺失疫苗免疫后仍有一定比例的豬場和豬只存在野毒抗體，并偶有病毒分離的報(bào)道。由于造成的經(jīng)濟(jì)損失有限，并未引起足夠重視。但近一年來，有多個(gè)使用常規(guī)疫苗免疫的規(guī)模化豬場出現(xiàn)了疑似PR流行的現(xiàn)象，主要表現(xiàn)為母豬產(chǎn)弱仔、死胎，仔豬出現(xiàn)神經(jīng)癥狀及死亡等。將送檢的組織進(jìn)行PCR鑒定和病毒分離，證明豬場確實(shí)存在PRV野毒感染。目前本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)從河南、黑龍江、吉林、遼寧、內(nèi)蒙古等省豬場送檢的病料中檢測到PRV野毒。由于PRV基因組較大，約145kb，我們從各豬場送檢樣品中通過PCR擴(kuò)增PRV的gE基因進(jìn)行了測序，結(jié)果表明各豬場流行毒株的這兩個(gè)基因高度同源，同源性在99%以上，與PRVKaplan株(匈牙利，GenBank登錄號(hào)JQ809328)同源性最低，為97. 5%。免疫接種是防控PRV的最有效方法。我國于上世紀(jì)70年代從匈牙利引進(jìn)了PRVBartha k61株，該病毒是世界上公認(rèn)的優(yōu)良疫苗株，國內(nèi)規(guī)?；i場大都應(yīng)用該疫苗，PR也得到了很好的控制。但現(xiàn)在的情況是，PR發(fā)病豬場都按照常規(guī)程序免疫過該疫苗，是否新流行毒株存在抗原變異導(dǎo)致免疫豬不能有效抵抗該病毒？我們利用血清中和試驗(yàn)和綿羊的免疫接種試驗(yàn)證實(shí)，Bartha k61免疫豬產(chǎn)生的中和抗體不能有效中和新分離病毒，而且免疫Bartha k61的綿羊也不能完全抵抗新病毒的攻擊。因此急需開發(fā)新的安全有效的PRV疫苗以應(yīng)對新流行的毒株。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的之一是提供一株豬偽狂犬病病毒強(qiáng)毒株。
本發(fā)明目的之二是提供一株由該豬偽狂犬病病毒強(qiáng)毒株經(jīng)基因工程方法缺失gE基因并插入EGFP標(biāo)記的弱毒疫苗株，用該弱毒疫苗株所制備的疫苗對于PRV新流行毒株具有良好的保護(hù)效力。本發(fā)明目的之三是提供一種預(yù)防或治療豬偽狂犬病的疫苗組合物。本發(fā)明的上述目的分別是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的從我國河南省疑似PRV感染的某豬場采集病豬的腦組織，提取組織基因組DNA，利用PRV gE特異性引物進(jìn)行PCR鑒定(圖1)，將陽性腦組織勻漿液進(jìn)行離心、過濾取濾液凍存待用。Veix)細(xì)胞在37°C下培養(yǎng)48h形成單層后，每瓶接種Iml濾過的病料懸液上清，吸附Ih后，換含2%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)在37°C下培養(yǎng)，觀察3 4天有無細(xì)胞病變產(chǎn)生(圖2)。當(dāng)60 70%細(xì)胞出現(xiàn)CPE變化時(shí)收毒，將有病變的毒株傳2 3代后用PRVgE的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增和病毒粒子電鏡觀察鑒定。試驗(yàn)表明利用PRV gE特異性引物能夠擴(kuò)增到預(yù)期大小的片段，將該片段測序后與GenBank上發(fā)表的序列進(jìn)行比較，其同 源性在97%以上，其序列結(jié)果為SEQ ID N0:2所示。將培養(yǎng)物進(jìn)行電鏡觀察，可以觀察到病毒粒子呈圓形，有中空和實(shí)心兩種特征，有的有囊膜有的無囊膜(圖3)。根據(jù)上述結(jié)果證明，該分離毒株為PRV，命名為HeNl株，分類命名偽狂犬病病毒，該毒株保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址在北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)中國科學(xué)院微生物研究所，其菌種保藏編號(hào)為=CGMCC NO. 6656，保藏日期為2012年10月12日。BALB/c小鼠接種PRV HeNl株后出現(xiàn)了典型的偽狂犬病癥狀用嘴啃咬注射部位，導(dǎo)致局部被毛脫落、皮膚出血、嚴(yán)重者后肢被咬斷，注射病毒含量在103_°_106_ciTCID5tl的小鼠在接種后60h內(nèi)死亡。通過計(jì)算PRV HeNl對BALB/c小鼠的LD5tl為23HCID5(I。注射DMEM培養(yǎng)液的對照鼠無異常表現(xiàn)。SPF斷奶仔豬接種PRV HeNl株后只出現(xiàn)一過性發(fā)熱反應(yīng)，體溫達(dá)到41°C，持續(xù)3-5天，此外無其他臨床發(fā)病癥狀和剖檢變化。利用微量中和試驗(yàn)和綿羊的免疫攻毒試驗(yàn)證實(shí)新分離毒株(PRV HeNl株)與疫苗株Bartha k61之間存在抗原差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Bartha k61接種豬產(chǎn)生的中和抗體水平與HeNl接種豬相比普遍較低，其能50%中和自身病毒的血清稀釋度均在1:40以內(nèi)，對新分離病毒HeNl的中和能力更低，50%中和病毒的血清稀釋度在1: 10左右。HeNl接種豬在感染后2周就能產(chǎn)生高水平的中和抗體，50%中和病毒的血清稀釋度均在1:80以上，而且對兩種病毒的中和能力都較高。通過基因克隆技術(shù)以PRV HeNl株的部分gl和Us2基因作為同源臂，以及綠色熒光蛋白基因(EGFP)作為篩選標(biāo)記構(gòu)建了轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒pU⑶sAB-EGFP，將PRVHeNl基因組和轉(zhuǎn)移載體共轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞，經(jīng)過4輪噬斑純化和鑒定證實(shí)獲得了缺失gE基因同時(shí)插入EGFP標(biāo)記的重組偽狂犬病病毒rPRV-gE_-EGFP+。通過噬斑試驗(yàn)和一步生長曲線測定等方法對重組偽狂犬病病毒rPRV-gE_-EGFP+的生長特性進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)重組病毒rPRV-gE__EGFP+在體外細(xì)胞培養(yǎng)中的增殖速度與親本毒HeNl株相比沒有明顯差別，說明缺失和插入沒有影響重組病毒在體外的繁殖速度。重組病毒rPRV-gE_-EGFP+在Vero細(xì)胞上盲傳12代，綠色熒光蛋白仍能夠穩(wěn)定表達(dá)，通過PCR鑒定可以檢測到插入的外源片段和插入位點(diǎn)兩側(cè)的病毒基因序列，表明所獲得的重組病毒rPRV-gE_-EGFP+能夠穩(wěn)定遺傳。因此本發(fā)明還提出了一株豬偽狂犬病病毒疫苗株，其特征在于所述的疫苗株是在所述的豬偽狂犬病病毒強(qiáng)毒株的基礎(chǔ)上，通過基因工程方法缺失gE基因并插入EGFP標(biāo)記得到的。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施例中，插入序列及其側(cè)翼核苷酸序列為SEQ ID N0:3所
/Jn o在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施例中，所述的豬偽狂犬病病毒疫苗株，命名為rPRV-gE_-EGFP+，分類命名偽狂犬病病毒，該毒株保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址在北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)中國科學(xué)院微生物研究所，其菌種保藏編號(hào)為=CGMCC NO. 6657，保藏日期為2012年10月12日。。通過對PRV HeNl株以及rPRV_gE—EGFP+的免疫效力進(jìn)行評(píng)價(jià)發(fā)現(xiàn)，HeNl接種豬相比Bartha k61接種豬產(chǎn)生的中和抗體水平高；rPRV-gE_-EGFP+免疫后對雙城株和HeNl株都具有良好的保護(hù)效果，而Bartha k61免疫羊不能完全抵抗新分離毒株HeNl株的攻擊，因此rPRV-gE_-EGFP+可以作為疫苗候選株以應(yīng)對新出現(xiàn)的疫情。 因此，再進(jìn)一步的，本發(fā)明還提出了一種治療或預(yù)防豬偽狂犬病的疫苗組合物，其特征在于由所述的豬偽狂犬病病毒強(qiáng)毒株滅活后的產(chǎn)物或豬偽狂犬病病毒基因缺失疫苗株和藥學(xué)上可接受的佐劑組成。更進(jìn)一步的，本發(fā)明還提出了所述的豬偽狂犬病病毒強(qiáng)毒株在制備預(yù)防或治療豬偽狂犬病藥物中的用途。及所述的豬偽狂犬病病毒強(qiáng)毒株在制備診斷或檢測豬偽狂犬病藥物中的用途。及所述的基因缺失疫苗株在制備預(yù)防或治療豬偽狂犬病藥物中的用途。及所述的基因缺失疫苗株在制備診斷或檢測豬偽狂犬病藥物中的用途。本發(fā)明的強(qiáng)毒株可制備成滅活疫苗(單苗或聯(lián)苗)，基因缺失疫苗株rPRV-gE二EGFP+可制備成活疫苗或滅活疫苗(單苗或聯(lián)苗)等，都可有效預(yù)防或治療豬偽狂犬病，也可將其制備成診斷豬偽狂犬病的診斷試劑。本發(fā)明基因缺失疫苗株rPRV-gE_-EGFP+具有安全性好、保護(hù)效率高、利于鑒別診斷等優(yōu)點(diǎn)。


圖1某豬場送檢腦組織樣品的PCR鑒定；1:陰性對照,2-8:送檢樣品9:陽性對照，10:DNA marker圖2腦組織勻漿液感染Vero細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞病變；A :正常Vero細(xì)胞；B:受感染的Vero細(xì)胞圖3病毒粒子的電鏡觀察；圖4兩株病毒誘導(dǎo)中和抗體水平比較；A:注射PRV Bartha k61株的豬血清 B:注射PRV HeNl株的豬血清.圖5rPRV_gE\EGFP+的重組位點(diǎn)示意圖；圖6pUCUsAB_EGFP 的酶切鑒定。M:DL15000 ；1. BamH I 酶切質(zhì)粒 pUCUsAB-EGFP
具體實(shí)施例方式下面通過實(shí)驗(yàn)并結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明，應(yīng)該理解的是，這些實(shí)施例僅用于例證的目的，決不限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員理解，在本發(fā)明權(quán)利要求所限定的精神和范圍內(nèi)可對其進(jìn)行許多改變，修改，甚至等效變更，但都將落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)實(shí)施例1豬偽狂犬病病毒強(qiáng)毒株(PRV HeNl株)的分離鑒定從我國河南省疑似PRV感染的某豬場采集病豬的腦組織，提取組織基因組DNA，利用PRV gE特異性引物進(jìn)行PCR鑒定(圖1)，將陽性腦組織勻漿液進(jìn)行離心、過濾取濾液凍存待用。Veix)細(xì)胞在37°C下培養(yǎng)48h形成單層后，每瓶接種Iml濾過的病料懸液上清，吸附Ih后，換含2%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)在37°C下培養(yǎng)，觀察3 4天有無細(xì)胞病變產(chǎn)生(圖2)。當(dāng)60 70%細(xì)胞出現(xiàn)CPE變化時(shí)收毒，將有病變的毒株傳2 3代后用PRVgE的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增和病毒粒子電鏡觀察鑒定。試驗(yàn)表明利用PRV gE特異性引物能夠擴(kuò)增到預(yù)期大小的片段，將該片段測序后與GenBank上發(fā)表的序列進(jìn)行比較，其同源性在97%以上，其序列結(jié)果為SEQ ID N0:2所示。將培養(yǎng)物進(jìn)行電鏡觀察，可以觀察到病毒粒子呈圓形，有中空和實(shí)心兩種特征，有的有囊膜有的無囊膜(圖3)。根據(jù)上述結(jié)果證明， 該分離毒株為PRV，命名為HeNl株，分類命名偽狂犬病病毒，該毒株保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址在北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)中國科學(xué)院微生物研究所，其菌種保藏編號(hào)為=CGMCC NO. 6656，保藏日期為2012年10月12日。BALB/c小鼠接種PRV HeNl株后出現(xiàn)了典型的偽狂犬病癥狀用嘴啃咬注射部位，導(dǎo)致局部被毛脫落、皮膚出血、嚴(yán)重者后肢被咬斷，注射病毒含量在103_°_106_ciTCID5tl的小鼠在接種后60h內(nèi)死亡。通過計(jì)算PRV HeNl對BALB/c小鼠的LD5tl為23HCID5(I。注射DMEM培養(yǎng)液的對照鼠無異常表現(xiàn)。SPF斷奶仔豬接種PRV HeNl株后只出現(xiàn)一過性發(fā)熱反應(yīng)，體溫達(dá)到41°C，持續(xù)3-5天，此外無其他臨床發(fā)病癥狀和剖檢變化。實(shí)施例2PRV HeNl株與疫苗株Bartha k61之間存在抗原差異I)利用微量中和試驗(yàn)和綿羊的免疫攻毒試驗(yàn)證實(shí)新分離毒株(PRV HeNl株)與疫苗株Bartha k61之間存在抗原差異。中和試驗(yàn)操作方法12頭40日齡的SPF豬，其中5頭肌注 ImL 含 IO7 0TCID50 的滅活的 PRV HeNl 株，5 頭肌注 ImL 含 IO7 0TCID50 的 Bartha k61株，另2頭注射DMEM培養(yǎng)液作為對照，于接種前及接種后每周采血分離血清，在接種后5周剖殺。采用固定病毒稀釋血清法測定疫苗Bartha k61接種豬血清和HeNl接種豬血清對兩株病毒(Bartha k61和HeNl)的中和效價(jià)。病毒量為IOOTCID5q/孔，血清為Bartha k61和HeNl分別接種SPF豬后在不同時(shí)間點(diǎn)采集，56°C滅活30min備用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Bartha k61接種豬產(chǎn)生的中和抗體水平與HeNl接種豬相比普遍較低，其能50%中和自身病毒的血清稀釋度均在1:40以內(nèi)，對新分離病毒HeNl的中和能力更低，50%中和病毒的血清稀釋度在I 10左右(圖4A)。HeNl接種豬在感染后2周就能產(chǎn)生高水平的中和抗體，50%中和病毒的血清稀釋度均在1:80以上，而且對兩種病毒的中和能力都較高(圖4B)。2)綿羊的免疫保護(hù)試驗(yàn)6-8月齡綿羊14只，PRV中和抗體檢測為陰性。隨機(jī)分為四組，A、C組(每組4只)每只肌肉注射0. 2頭份(每頭份病毒含量為IO5 tlTCID5ci)的PRVBartha k61疫苗，B、D組(每組3只)作為攻毒對照。免疫后14天，A、B組每只羊肌肉注射ImL含IOOOLD5ci的PRV HeNl株，C、D組每只羊肌肉注射ImL含IOOOLD5ci的PRV雙城株(PRV-S)0攻毒前采血檢測。A、C組共8只綿羊在用PRV Bartha k61疫苗免疫后14天采集血清，利用IDEXX試劑盒檢測抗PRV gB抗體(gB基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)，A組有3只抗體陽性，C組有4只抗體陽性。攻毒后9天內(nèi)，對照羊全部發(fā)病并死亡，HeNl攻毒組2只發(fā)病死亡(表I)。發(fā)病羊表現(xiàn)為瘙癢、角弓反張等神經(jīng)癥狀。表IBartha k61疫苗免疫羊?qū)Σ煌局甑墓ザ颈Ｗo(hù)效果
權(quán)利要求
1.一株豬偽狂犬病病毒(Porcine Pseudorabies Virus, PRV)強(qiáng)毒株,命名為HeNl, 保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，其菌種保藏編號(hào)為=CGMCC NO. 6656。
2.一株豬偽狂犬病病毒疫苗株，其特征在于所述的疫苗株是在權(quán)利要求1所述的豬偽狂犬病病毒強(qiáng)毒株的基礎(chǔ)上，通過基因工程方法缺失gE基因并插入EGFP標(biāo)記得到的。
3.如權(quán)利要求2所述的豬偽狂犬病病毒疫苗株，其特征在于插入序列及其側(cè)翼核苷酸序列為SEQ ID NO:3所示。
4.如權(quán)利要求2或3所述的豬偽狂犬病病毒疫苗株，其特征在于所述的豬偽狂犬病病毒疫苗株，命名為rPRV-gE_-EGFP+，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，其菌種保藏編號(hào)為=CGMCC NO. 6657。
5.一種治療或預(yù)防豬偽狂犬病的疫苗組合物，其特征在于由權(quán)利要求1所述的豬偽狂犬病病毒強(qiáng)毒株滅活后的產(chǎn)物和藥學(xué)上可接受的佐劑組成。
6.一種治療或預(yù)防豬偽狂犬病的疫苗組合物，其特征在于由權(quán)利要求2-4任一項(xiàng)所述的基因缺失疫苗株和藥學(xué)上可接受的佐劑組成。
7.權(quán)利要求1所述的豬偽狂犬病病毒強(qiáng)毒株在制備預(yù)防或治療豬偽狂犬病藥物中的用途。
8.權(quán)利要求1所述的豬偽狂犬病病毒強(qiáng)毒株在制備診斷或檢測豬偽狂犬病藥物中的用途。
9.權(quán)利要求2-4任一項(xiàng)所述的基因缺失疫苗株在制備預(yù)防或治療豬偽狂犬病藥物中的用途。
10.權(quán)利要求2-4任一項(xiàng)所述的基因缺失疫苗株在制備診斷或檢測豬偽狂犬病藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明公開了一株豬偽狂犬病病毒強(qiáng)毒株、其基因缺失疫苗株及其應(yīng)用。本發(fā)明分離得到的一株豬偽狂犬病病毒強(qiáng)毒株，命名為HeN1，其微生物保藏編號(hào)為CGMCC NO.6656，在該強(qiáng)毒株HeN1基礎(chǔ)上缺失gE基因獲得了基因缺失疫苗株rPRV-gE--EGFP+，其微生物保藏編號(hào)為CGMCC NO.6657。本發(fā)明的強(qiáng)毒株可制備成滅活疫苗(單苗或聯(lián)苗)，基因缺失疫苗株rPRV-gE--EGFP+可制備成活疫苗或滅活疫苗(單苗或聯(lián)苗)等，都可有效預(yù)防或治療豬偽狂犬病，也可將其制備成診斷豬偽狂犬病的診斷試劑。本發(fā)明基因缺失疫苗株rPRV-gE--EGFP+具有安全性好、保護(hù)效率高、利于鑒別診斷等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12N7/00GK102994458SQ201210486730
公開日2013年3月27日 申請日期2012年11月26日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月26日
發(fā)明者田志軍, 彭金美, 安同慶 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所