miRNA檢測(cè)探針及miRNA的擴(kuò)增檢測(cè)方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種線性模版和一種發(fā)夾探針，及利用所述的線性模版和發(fā)夾探針進(jìn)行miRNA擴(kuò)增檢測(cè)的方法。本發(fā)明的線性模版和發(fā)夾探針易于設(shè)計(jì)；本發(fā)明的miRNA擴(kuò)增檢測(cè)方法的擴(kuò)增效率較高，檢測(cè)靈敏度較高。
【專利說(shuō)明】mi RNA檢測(cè)探針及m i RNA的擴(kuò)增檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和核酸化學(xué)領(lǐng)域具體涉及一種miRNA檢測(cè)發(fā)夾探針及miRNA的擴(kuò)增檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]MicroRNAs (miRNA)是真核細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的一類有調(diào)控功能的非編碼RNA，通常大約有20-25個(gè)核苷酸。miRNA是由較長(zhǎng)的含有hairpin結(jié)構(gòu)的前體經(jīng)過(guò)Dicer酶的剪切加工成形的，隨后與RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(miRISCs)結(jié)合，并通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)識(shí)別相應(yīng)的信使RNA (mRNA)。由于互補(bǔ)程度的不同，miRNA可以降解或阻遏靶mRNA的翻譯。研究表明miRNA在動(dòng)植物中有廣泛的表達(dá)，參與各種各樣的調(diào)節(jié)途徑，包括發(fā)育、病毒防御、造血過(guò)程、器官形成、細(xì)胞增殖和凋亡、脂肪代謝等。miRNA具有保守性，特異性和時(shí)序性，只在特定的細(xì)胞和組織中表達(dá)，因此決定了細(xì)胞和組織功能的特異性。區(qū)別于寡核苷酸和RNA的降解片段，miRNA 3’端為羥基，5’端有一個(gè)磷酸基。miRNA與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展進(jìn)程密切相關(guān)，miRNA的異常表達(dá)與腫瘤的分期、進(jìn)展及代謝有關(guān)，一些miRNA在正常細(xì)胞中表達(dá)量高，在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)降低，提示他們可能作為抑癌基因，作為抑癌基因的miRNA的缺失將導(dǎo)致或突變將導(dǎo)致細(xì)胞的轉(zhuǎn)化和癌基因的激活；一些miRNA會(huì)協(xié)同行使癌基因的功能，抑制凋亡蛋白的合成。miRNA可作為腫瘤監(jiān)測(cè)和腫瘤愈后的生物學(xué)標(biāo)志物，miRNA的檢測(cè)對(duì)于腫瘤的早期診斷和愈后診斷具有重要的意義。
[0003]miRNA分子 的序列短小，在基因組中存在較多的互補(bǔ)序列，在不同生物體內(nèi)與靶標(biāo)結(jié)合的方式也不盡相同，而且通常還與多種蛋白相互作用，因此miRNA的高靈敏分析成為亟待解決的問(wèn)題?，F(xiàn)有的miRNA檢測(cè)技術(shù)主要包括Northern blot ( 一種檢測(cè)RNA的雜交印跡技術(shù))，微陣列，RT-PCR(逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))，恒溫?cái)U(kuò)增等。其中,Northern blot是在變性條件下將待檢的RNA樣品進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，繼而進(jìn)行轉(zhuǎn)膜和探針雜交檢測(cè)，這種方法的特異性非常高，但是工序復(fù)雜，需要的樣本量大，靈敏度低；微陣列法是采用特殊的玻片或硅芯片，在數(shù)平方厘米之面積上布放數(shù)千或數(shù)萬(wàn)個(gè)核酸探針，待檢樣品中的核酸與探針雜交結(jié)合后，借由熒光或電流等方式檢測(cè)，這種方法可以同時(shí)實(shí)現(xiàn)多重miRNA分析，但是檢測(cè)成本較高；RT_PCR技術(shù)是將RNA的逆轉(zhuǎn)錄和cDNA的聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增反應(yīng)相結(jié)合的技術(shù)，它能夠?qū)怂徇M(jìn)行高效率的擴(kuò)增；恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)能在恒溫條件下實(shí)現(xiàn)核酸的高效擴(kuò)增，其中鏈置換擴(kuò)增采用聚合酶和切刻酶對(duì)特定模板進(jìn)行循環(huán)地延伸、切刻，因而可擴(kuò)增產(chǎn)生大量的目的片段，但是對(duì)設(shè)備的要求很高。而近年來(lái)發(fā)展的采用發(fā)夾探針作為模板的鏈置換擴(kuò)增方法可實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增信號(hào)的實(shí)時(shí)采集，具有廣闊的應(yīng)用前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明旨在解決上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的問(wèn)題提出一種miRNA的擴(kuò)增方法，實(shí)現(xiàn)miRNA的高靈敏度檢測(cè)。
[0005]為此，本發(fā)明提供了一種線性模版，用于miRNA檢測(cè)，包括三個(gè)部分，從3’端到5’端依次為:靠近3’端的第一結(jié)合位點(diǎn)，位于中間的是切刻內(nèi)切酶識(shí)別序列的互補(bǔ)序列，靠近5’端的第一擴(kuò)增區(qū)域；
[0006]所述的第一結(jié)合位點(diǎn)與待測(cè)miRNA具有互補(bǔ)配對(duì)序列；
[0007]所述的第一擴(kuò)增區(qū)域含有15-25個(gè)核苷酸，所述第一擴(kuò)增區(qū)域的互補(bǔ)序列可以作為引物引發(fā)延伸反應(yīng)。
[0008]優(yōu)選地，所述的線性模版具有序列表中SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列。
[0009]本發(fā)明另外提供了一種發(fā)夾探針，用于miRNA檢測(cè)，包括四個(gè)部分，從3’端到5’端依次為:靠近3’端的第二結(jié)合位點(diǎn)，第一莖區(qū)域，切刻內(nèi)切酶識(shí)別序列的互補(bǔ)序列，第二擴(kuò)增區(qū)域；[0010]所述的第二結(jié)合位點(diǎn)與線性模版的第一擴(kuò)增區(qū)域有部分重復(fù)序列，能夠與所述的第一擴(kuò)增區(qū)域的互補(bǔ)序列進(jìn)行互補(bǔ)配對(duì)；
[0011]所述的第二擴(kuò)增區(qū)域與待測(cè)miRNA具有互補(bǔ)配對(duì)序列；
[0012]所述的第一莖區(qū)域與所述第二擴(kuò)增區(qū)域的反向序列有互補(bǔ)配對(duì)序列；
[0013]所述的第一莖區(qū)域與所述的第二擴(kuò)增區(qū)域通過(guò)發(fā)夾探針序列的自身回折進(jìn)行序列互補(bǔ)配對(duì)形成雙螺旋結(jié)構(gòu)，形成發(fā)夾探針的莖結(jié)構(gòu)；所述的切刻內(nèi)切酶識(shí)別序列的互補(bǔ)序列形成發(fā)夾探針的環(huán)結(jié)構(gòu)；所述的第二結(jié)合位點(diǎn)形成發(fā)夾探針的3’突出末端。
[0014]優(yōu)選地，所述的發(fā)夾探針具有序列表中SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列。
[0015]優(yōu)選地，所述的第二結(jié)合位點(diǎn)5’末端堿基上標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)；所述的第二擴(kuò)增區(qū)域5’末端堿基上標(biāo)記有熒光基團(tuán)。
[0016]當(dāng)所述的發(fā)夾探針通過(guò)自身回折形成莖結(jié)構(gòu)時(shí)，淬滅基團(tuán)和熒光基團(tuán)靠近，熒光基團(tuán)發(fā)出的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收，此時(shí)的發(fā)夾探針無(wú)法發(fā)出熒光信號(hào)。
[0017]本發(fā)明還提供了一種利用上述線性模版和發(fā)夾探針進(jìn)行miRNA擴(kuò)增檢測(cè)方法，包括以下步驟:
[0018]a、檢測(cè)探針的設(shè)計(jì)
[0019]根據(jù)待測(cè)miRNA序列設(shè)計(jì)上述線性模版和發(fā)夾探針，在發(fā)夾探針第二結(jié)合位點(diǎn)5’末端堿基上標(biāo)記熒光淬滅基團(tuán)，在發(fā)夾探針第二擴(kuò)增區(qū)域5’末端堿基上標(biāo)記熒光基團(tuán)；
[0020]b、線性模版的擴(kuò)增
[0021]將線性模版、dNTPs、待測(cè)miRNA樣品進(jìn)行混合，預(yù)熱后冷卻，得到第一混合溶液:
[0022]將切刻內(nèi)切酶、DNA聚合酶加入到第一混合溶液中，進(jìn)行延伸反應(yīng)，得到第二混合溶液；
[0023]C、發(fā)夾探針的擴(kuò)增
[0024]將發(fā)夾探針加入到步驟b中得到的第二混合溶液中，進(jìn)行熒光定量PCR，并對(duì)熒光信號(hào)的實(shí)時(shí)變化進(jìn)行監(jiān)測(cè)。
[0025]優(yōu)選地，所述的DNA聚合酶為高保真的耐熱DNA聚合酶。
[0026]優(yōu)選地，所述的DNA聚合酶具有3’到5’方向核酸外切酶校讀活性。
[0027]優(yōu)選地，所述的切刻內(nèi)切酶選自Nt.BstNB1.Nt.BbvCI或Nt.Alw10
[0028]優(yōu)選地，所述的線性模版的擴(kuò)增中預(yù)熱溫度為95°C。
[0029]優(yōu)選地，所述的線性模版的擴(kuò)增中冷卻溫度為55°C。
[0030]優(yōu)選地，所述的發(fā)夾探針的擴(kuò)增的溫度為52°C。[0031]本發(fā)明的miRNA擴(kuò)增檢測(cè)方法的擴(kuò)增檢測(cè)原理為:進(jìn)行線性模版的擴(kuò)增時(shí)，待測(cè)miRNA可通過(guò)雜交的方式結(jié)合至線性模板的第一結(jié)合位點(diǎn)即待測(cè)miRNA結(jié)合位點(diǎn)上,DNA聚合酶與待測(cè)miRNA結(jié)合，以線性模板為擴(kuò)增模板進(jìn)行延伸，從而形成完整的雙鏈結(jié)構(gòu)，為第一雙鏈結(jié)構(gòu)。隨后切刻內(nèi)切酶識(shí)別第一雙鏈結(jié)構(gòu)的切刻內(nèi)切酶識(shí)別序列，在所述的切刻內(nèi)切酶識(shí)別序列的下游處對(duì)新合成鏈進(jìn)行切刻，在第一雙鏈結(jié)構(gòu)上產(chǎn)生了缺口，DNA聚合酶能與產(chǎn)生的缺口處結(jié)合，使被切鏈以線性模版為擴(kuò)增模版進(jìn)行再次延伸，同時(shí)被切鏈的下游寡核苷酸片段被置換出來(lái)，而再次延伸后的新第一雙鏈又可被切刻內(nèi)切酶切刻，繼而再被DNA聚合酶延伸，這種反復(fù)的延伸和切刻循環(huán)即構(gòu)成了線性模版擴(kuò)增。進(jìn)行發(fā)夾探針擴(kuò)增時(shí)，線性模版擴(kuò)增過(guò)程被切下的寡核苷酸片段稱為第一寡核苷酸片段，第一寡核苷酸片段可同發(fā)夾探針的3’突出末端即第二結(jié)合位點(diǎn)配對(duì)結(jié)合，DNA聚合酶與第一寡核苷酸片段結(jié)合，以發(fā)夾探針為模板引發(fā)延伸反應(yīng)，該延伸反應(yīng)使發(fā)夾探針打開(kāi)，熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)分離而使其熒光基團(tuán)的熒光信號(hào)得以恢復(fù)，與此同時(shí)，以發(fā)夾探針為模板引發(fā)延伸反應(yīng)形成了雙鏈結(jié)構(gòu)，為第二雙鏈結(jié)構(gòu)，第二雙鏈結(jié)構(gòu)上也含有切刻內(nèi)切酶識(shí)別序列，能夠進(jìn)行如線性模版的擴(kuò)增過(guò)程中的不斷的切刻、延伸循環(huán)，在這個(gè)循環(huán)過(guò)程中，第二雙鏈結(jié)構(gòu)新合成鏈的下游片段被置換出來(lái)，產(chǎn)生大量的寡核苷酸片段，成為第二寡核苷酸片段，第二寡核苷酸片段與第二擴(kuò)增區(qū)域?yàn)榛パa(bǔ)配對(duì)序列，而第二擴(kuò)增區(qū)域與待測(cè)miRNA具有互補(bǔ)配對(duì)序列，因此，第二寡核苷酸片段與待測(cè)miRNA相對(duì)應(yīng)的核苷酸序列有相同的片段，僅在5’端減少了兩個(gè)堿基，3’端減少了 I個(gè)堿基，同時(shí)尿嘧啶以及核糖核酸分別換成了胸腺嘧啶和脫氧核糖核酸4，因而第二寡核苷酸片段又可同線性模板雜交而繼續(xù)引發(fā)線性模板的擴(kuò)增，所產(chǎn)生第一寡核苷酸片段又繼續(xù)引發(fā)發(fā)夾探針的擴(kuò)增?？傊?，線性模板的擴(kuò)增和發(fā)夾探針的擴(kuò)增這兩個(gè)過(guò)程串聯(lián)起來(lái)，構(gòu)成了擴(kuò)增檢測(cè)miRNA的循環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)，可提高待測(cè)miRNA的檢測(cè)高靈敏。發(fā)夾探針的打開(kāi)，使熒光基團(tuán)發(fā)出熒光信號(hào)，根據(jù)熒光信號(hào)的強(qiáng)弱實(shí)現(xiàn)對(duì)待測(cè)miRNA的檢測(cè)。
[0032]本發(fā)明的miRNA擴(kuò)增檢測(cè)方法可滿足不同的檢測(cè)需求:
[0033]第一，可用于目標(biāo)miRNA的快速篩查，根據(jù)目標(biāo)miRNA設(shè)計(jì)線性模版和發(fā)夾探針，可對(duì)樣品進(jìn)行快速篩查，能夠發(fā)出熒光信號(hào)表明樣品中存在了目標(biāo)miRNA;沒(méi)有發(fā)出熒光信號(hào)表明樣品中不存在目標(biāo)miRNA。
[0034]第二，可用于目標(biāo)miRNA樣品進(jìn)行定量檢測(cè)，根據(jù)目標(biāo)miRNA設(shè)計(jì)線性模版和發(fā)夾探針，配置目標(biāo)miRNA標(biāo)準(zhǔn)樣品，根據(jù)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)樣品的擴(kuò)增檢測(cè)所得的熒光信號(hào)強(qiáng)度值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，再將實(shí)際樣品中的miRNA熒光強(qiáng)度值，再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出實(shí)際樣品中miRNA的含量。
[0035]本發(fā)明的有益效果在于，本發(fā)明提供的線性模版和發(fā)夾探針易于設(shè)計(jì)；本發(fā)明的miRNA擴(kuò)增檢測(cè)方法的擴(kuò)增效率較高，miRNA的檢測(cè)靈敏度較高。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0036]圖1是本發(fā)明的miRNA擴(kuò)增檢測(cè)方法的工作原理圖。
[0037]圖2是本發(fā)明的miRNA擴(kuò)增檢測(cè)方法中線性模版擴(kuò)增的熒光曲線圖。
[0038]圖3是本發(fā)明的miRNA擴(kuò)增檢測(cè)方法中線性模版擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖。
[0039]圖4是本發(fā)明的miRNA擴(kuò)增檢測(cè)方法熒光曲線圖。
[0040]圖5是不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)miRNA樣品的熒光曲線圖。[0041]圖6是不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)miRNA樣品的拐點(diǎn)變化圖。
[0042]圖7是不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)miRNA樣品的拐點(diǎn)與濃度負(fù)對(duì)數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
[0043]圖8是本發(fā)明的miRNA擴(kuò)增檢測(cè)方法特異性檢測(cè)結(jié)果圖。
[0044]圖9是本發(fā)明的miRNA擴(kuò)增檢測(cè)方法對(duì)臨床樣品的檢測(cè)結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0045]為了使本領(lǐng)域的技術(shù)人員更好的理解本申請(qǐng)的技術(shù)方案，下面將結(jié)合本申請(qǐng)實(shí)施例中的附圖，對(duì)本申請(qǐng)實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整的描述。
[0046]本發(fā)明的方案包括線性模版和發(fā)夾探針，用于miRNA的擴(kuò)增檢測(cè)，本發(fā)明提供的線性模版，包括三個(gè)部分，從3’端到5’端依次為:靠近3’端的第一結(jié)合位點(diǎn)，位于中間的是切刻內(nèi)切酶識(shí)別序列的互補(bǔ)序列，靠近5’端的第一擴(kuò)增區(qū)域；所述的第一結(jié)合位點(diǎn)與待測(cè)miRNA具有互補(bǔ)配對(duì)序列；所述的第一擴(kuò)增區(qū)域含有15-25個(gè)核苷酸，所述第一擴(kuò)增區(qū)域的互補(bǔ)序列可以作為引物引發(fā)延伸反應(yīng)。
[0047]本發(fā)明提供的發(fā)夾探針，包括四個(gè)部分，從3’端到5’端依次為:靠近3’端的第二結(jié)合位點(diǎn)，第一莖區(qū)域，切刻內(nèi)切酶識(shí)別序列的互補(bǔ)序列，第二擴(kuò)增區(qū)域；所述的第二結(jié)合位點(diǎn)與線性模版的第一擴(kuò)增區(qū)域有部分重復(fù)序列，能夠與所述的第一擴(kuò)增區(qū)域的互補(bǔ)序列進(jìn)行互補(bǔ)配對(duì)；所述的第二擴(kuò)增區(qū)域與待測(cè)miRNA具有互補(bǔ)配對(duì)序列；所述的第一莖區(qū)域與所述第二擴(kuò)增區(qū)域的反向序列有互補(bǔ)配對(duì)序列；所述的第一莖區(qū)域與所述的第二擴(kuò)增區(qū)域通過(guò)發(fā)夾探針序列的自身回折進(jìn)行序列互補(bǔ)配對(duì)形成雙螺旋結(jié)構(gòu)，形成發(fā)夾探針的莖結(jié)構(gòu)；所述的切刻內(nèi)切酶識(shí) 別序列的互補(bǔ)序列形成發(fā)夾探針的環(huán)結(jié)構(gòu)；所述的第二結(jié)合位點(diǎn)形成發(fā)夾探針的3’突出末端。
[0048]本發(fā)明的發(fā)夾探針還可在第二結(jié)合位點(diǎn)5’末端堿基上標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)；在第二擴(kuò)增區(qū)域5’末端堿基上標(biāo)記有熒光基團(tuán)。當(dāng)所述的發(fā)夾探針通過(guò)自身回折形成莖結(jié)構(gòu)時(shí)，淬滅基團(tuán)和熒光基團(tuán)靠近，熒光基團(tuán)發(fā)出的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收，此時(shí)的發(fā)夾探針無(wú)法發(fā)出熒光信號(hào)。
[0049]為了防止線性模版和發(fā)夾探針自身的3’末端發(fā)生延伸反應(yīng)，可將線性模版和發(fā)夾探針的3’末端標(biāo)記氨基或其他基團(tuán)。
[0050]本發(fā)明還提供的miRNA擴(kuò)增檢測(cè)方法，包括以下步驟:
[0051]a、檢測(cè)探針的設(shè)計(jì)
[0052]根據(jù)待測(cè)miRNA序列設(shè)計(jì)上述線性模版和發(fā)夾探針，在發(fā)夾探針第二結(jié)合位點(diǎn)5’末端堿基上標(biāo)記熒光淬滅基團(tuán)，在發(fā)夾探針第二擴(kuò)增區(qū)域5’末端堿基上標(biāo)記熒光基團(tuán)；
[0053]b、線性模版的擴(kuò)增
[0054]將線性模版、dNTPs、待測(cè)miRNA樣品進(jìn)行混合，預(yù)熱后冷卻，得到第一混合溶液；
[0055]將切刻內(nèi)切酶、DNA聚合酶加入到第一混合溶液中，進(jìn)行延伸反應(yīng)，得到第二混合溶液；
[0056]C、發(fā)夾探針的擴(kuò)增
[0057]將發(fā)夾探針加入到步驟b中得到的第二混合溶液中，進(jìn)行熒光定量PCR，并對(duì)熒光信號(hào)的實(shí)時(shí)變化進(jìn)行監(jiān)測(cè)。
[0058]切刻內(nèi)切酶只識(shí)別DNA雙鏈，也就是在單鏈模板擴(kuò)增成為雙鏈之后才能識(shí)別，更重要的是識(shí)別序列也是特定的，若沒(méi)有該特定識(shí)別序列則不會(huì)發(fā)生識(shí)別，在本發(fā)明中線性模版和發(fā)夾探針在擴(kuò)增時(shí)均作為3’到5’方向的模板鏈，在設(shè)計(jì)線性模版和發(fā)夾探針序列時(shí)將切刻內(nèi)切酶識(shí)別序列的互補(bǔ)序列作為其中的一部分，以線性模版和發(fā)夾探針作為3’到5’方向的模板鏈合成的新鏈上有切刻內(nèi)切酶識(shí)別序列，對(duì)切刻內(nèi)切酶識(shí)別序列下游4個(gè)核苷酸處進(jìn)行切刻，使DNA雙鏈產(chǎn)生缺口，切刻內(nèi)切酶可以選用選Nt.BstNBI, Nt.BbvCI或Nt.AlwI,但不限于這三種。
[0059]本發(fā)明中所使用的DNA聚合酶優(yōu)選高保真的耐熱DNA聚合酶，這樣的DNA聚合酶具有3’到5’方向核酸外切酶校讀活性,如可選用DNA聚合酶Vent (exo_)等。
[0060]對(duì)于擴(kuò)增的溫度，選擇接近于切刻內(nèi)切酶反應(yīng)最適溫度，保證切刻內(nèi)切酶的活性。
[0061]以發(fā)夾探針為模板進(jìn)行延伸反應(yīng)，該延伸反應(yīng)使發(fā)夾探針打開(kāi)，熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)分離而使其熒光基團(tuán)的熒光信號(hào)得以恢復(fù)，此擴(kuò)增是由線性模版擴(kuò)增產(chǎn)生的第一寡核苷酸序列引發(fā)的，也就是說(shuō)，只有在目標(biāo)miRNA存在時(shí)，才會(huì)引發(fā)線性模版擴(kuò)增，繼而引發(fā)發(fā)夾探針擴(kuò)增，產(chǎn)生熒光信號(hào)。
[0062]線性模板的擴(kuò)增和發(fā)夾探針的擴(kuò)增這兩個(gè)過(guò)程串聯(lián)起來(lái)，構(gòu)成了擴(kuò)增檢測(cè)miRNA的循環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)，擴(kuò)增反應(yīng)的放大效應(yīng)較強(qiáng)，miRNA的檢測(cè)高靈敏高。當(dāng)miRNA濃度低時(shí)，線性模板擴(kuò)增的效率低，熒光信號(hào)出現(xiàn)晚，熒光信號(hào)強(qiáng)度低；當(dāng)miRNA濃度高時(shí)，線性模板擴(kuò)增的效率高，熒光信號(hào)出現(xiàn)早，熒光信號(hào)強(qiáng)度高。也就是說(shuō)，不同濃度的miRNA樣品的熒光信號(hào)的強(qiáng)弱變化過(guò)程不同。配置一定濃度梯度的miRNA標(biāo)準(zhǔn)液，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)液的熒光信號(hào)強(qiáng)度值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，再將實(shí)際樣品中的miRNA熒光強(qiáng)度值，再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出實(shí)際樣品中miRNA的含量，實(shí)現(xiàn)miRNA的定量檢測(cè)。
[0063]下述實(shí)施例中所 使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。
[0064]下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0065]實(shí)施例
[0066]試劑配制
[0067]溶液1:濃度為5mol / L的線性模版；
[0068]溶液2:濃度為2.5mol / L的dNTPs (四種脫氧核糖核苷酸的混合物)二
[0069]溶液3:10X切刻內(nèi)切酶Nt.BstNBI反應(yīng)緩沖液(0.5mol / L的三氨基甲烷鹽酸，調(diào)節(jié)pH7.9 ；0.1mol / L的氯化鎂；lmol / L的氯化鈉；0.01mol / L的二硫蘇糖醇)；
[0070]溶液4:40單位/ μ L的核糖核酸酶抑制劑；
[0071]溶液5:10單位/ μ L的切刻內(nèi)切酶Nt.BstNBI ；
[0072]溶液6:2 單位 / μ LDNA 聚合酶 Vent (exo_)；
[0073]溶液7:10X聚合酶Vent(eX0-)反應(yīng)緩沖液(0.2mol / L的三氨基甲烷鹽酸，pH8.8 ；0.1mol / L的硫酸銨,0.1mol / L的氯化鉀,0.02mol / L的硫酸鎂，1%聚乙二醇
辛基苯基醚)；
[0074]溶液8 =DEPC (焦碳酸二乙酯)處理的水；
[0075]溶液9:不同濃度的let_7a ；
[0076]溶液10:帶有熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)的發(fā)夾探針采用稀釋緩沖液(IOmrnol / L的三氨基甲烷鹽酸；1.5mmol / L氯化鎂，調(diào)節(jié)pH8.0)稀釋至5 μ M，用95°C恒溫孵育5min，再緩慢冷卻至室溫，使其充分折疊形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。[0077]A 液:0.4μ L 的溶液 I, I μ L 溶液 2,0.5 μ L 溶液 3,1 μ L 溶液 9,1.1 μ L 溶液 8 ；
[0078]B 液:0.2yL 溶液 4，0.4yL 溶液 5，0.25yL 溶液 6，0.7yL 溶液 7 以及 1.45 μ L溶液8 ;
[0079]C 液:0.5 μ L 溶液 10，0.4 μ L 溶液 5，0.25 μ L 溶液 6，0.3 μ L 溶液 7 以及 1.55 μ L
溶液8。
[0080]實(shí)施例1
[0081]以人miRNA let_7a為待測(cè)miRNA，用切刻內(nèi)切酶Nt.BstNBI的識(shí)別序列設(shè)計(jì)線性模版和發(fā)夾探針，線性模版的序列為SEQ ID N0.1，發(fā)夾探針的序列為SEQ ID N0.2，在發(fā)夾探針第二結(jié)合位點(diǎn)5’末端堿基上標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)；在發(fā)夾探針第二擴(kuò)增區(qū)域5’末端喊基上標(biāo)記有突光基團(tuán)，標(biāo)記后的發(fā)夾探針的。
[0082]miRNA的擴(kuò)增檢測(cè)方法:
[0083]a、線性模版的擴(kuò)增
[0084]A液在95°C下孵育3min，然后冷卻至55°C，再加入B液，使二者在55°C下反應(yīng)30min,得到第一混合溶液；
[0085]b、發(fā)夾探針的擴(kuò)增
[0086]將第一混合溶液與C液混合后立即放入羅氏480實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增系統(tǒng)，在52°C條件下恒溫反應(yīng)lOOmin，其熒光信號(hào)的實(shí)時(shí)變化情況可通過(guò)該儀器進(jìn)行監(jiān)測(cè)。
[0087]線性模版的擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)
[0088]在線性模版的擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)中不加入發(fā)夾探針:
[0089]將線性模版、dNTPs、let-7a樣品進(jìn)行混合，預(yù)熱后冷卻，得到第一混合溶液:
[0090]將切刻內(nèi)切酶、DNA聚合酶、核酸染料SYBR Green I加入到第一混合溶液中，進(jìn)行延伸反應(yīng)，得到第二混合溶液；并對(duì)熒光信號(hào)進(jìn)行監(jiān)測(cè)。設(shè)置不加入let_7a樣品的空白對(duì)照組。
[0091]結(jié)果如圖2所示，空白對(duì)照組(a曲線)熒光信號(hào)維持很低的水平，而樣品組(b曲線)的熒光信號(hào)強(qiáng)度呈逐漸上升趨勢(shì)，表明目標(biāo)miRNA引發(fā)了線性模版擴(kuò)增反應(yīng)。圖3為擴(kuò)增產(chǎn)物的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳圖，空白對(duì)照組電泳道(左邊起第二道)僅能分辨出未擴(kuò)增的單鏈模板，而樣品組電泳道(左邊起第三道)則可清晰地分辨出擴(kuò)增后的雙鏈模板以及擴(kuò)增所產(chǎn)生的寡核苷酸片段。
[0092]miRNA的擴(kuò)增檢測(cè)實(shí)駘
[0093]按照實(shí)施例1中的miRNA的擴(kuò)增檢測(cè)方法對(duì)miRNA樣品進(jìn)行檢測(cè)。
[0094]設(shè)置不加入let_7a樣品的空白對(duì)照組。
[0095]結(jié)果如圖4所示。由圖可以看出目標(biāo)管(d曲線)的熒光信號(hào)迅速上升，很快達(dá)到平臺(tái)期，表明循環(huán)擴(kuò)增的效率高；而空白對(duì)照管(c曲線)的熒光信號(hào)在擴(kuò)增80分鐘之后才會(huì)顯著上升，這種非特異擴(kuò)增屬于等溫指數(shù)擴(kuò)增中的正常現(xiàn)象，與由酶引發(fā)的不依賴于模板的擴(kuò)增有關(guān)。但這種非特異擴(kuò)增很晚才升起，它并不會(huì)干擾到目標(biāo)miRNA引起的特異性擴(kuò)增?？傊?，整個(gè)miRNA循環(huán)擴(kuò)增能夠清晰的區(qū)分目標(biāo)信號(hào)與空白對(duì)照信號(hào)，本發(fā)明技術(shù)方案具有可行性。
[0096]miRNA擴(kuò)增檢測(cè)的定暈檢測(cè)及靈敏度實(shí)驗(yàn)
[0097]為了評(píng)估本技術(shù)方案在檢測(cè)目標(biāo)miRNA方面的靈敏性，對(duì)濃度為IOnmol / L、Inmol / L、IOOpmol / L、IOpmol / L、lpmol/L 的目標(biāo) miRNA 進(jìn)行了檢測(cè)分析,結(jié)果如圖 5所示，不同濃度目標(biāo)miRNA的實(shí)時(shí)擴(kuò)增曲線具有差異，表明本發(fā)明的miRNA擴(kuò)增檢測(cè)方法對(duì)不同濃度的目標(biāo)miRNA具有很好的區(qū)分度。為了評(píng)估其定量分析能力，采用熒光信號(hào)強(qiáng)度曲線的最大斜率所對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增時(shí)間(定義為拐點(diǎn))作為評(píng)估參數(shù)，拐點(diǎn)隨目標(biāo)miRNA濃度的變化曲線如圖6所示，拐點(diǎn)隨目標(biāo)miRNA濃度的增加而降低。用拐點(diǎn)對(duì)目標(biāo)miRNA濃度的負(fù)對(duì)數(shù)做圖，結(jié)果如圖7所示，拐點(diǎn)與目標(biāo)miRNA濃度的負(fù)對(duì)數(shù)呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，其線性方程為 POI = -117.72-16.421og10C(R2 為 0.9961)。
[0098]經(jīng)過(guò)計(jì)算，本發(fā)明的擴(kuò)增檢測(cè)方法的檢測(cè)限可達(dá)到3.8X10_13mol / L，本發(fā)明的擴(kuò)增檢測(cè)方法具有較高的靈敏度。
[0099]miRNA擴(kuò)增檢測(cè)的特異件實(shí)駘[0100]為了評(píng)估m(xù)iRNA的特異性，以let_7a為檢測(cè)目標(biāo)miRNA，選用let_7家族的另外兩個(gè)成員let_7b，let_7c進(jìn)行了對(duì)比檢測(cè)分析，其中l(wèi)et_7c與let_7a相比僅有一個(gè)堿基差異，let-7b與let-7a相比僅有兩個(gè)堿基差異，檢測(cè)結(jié)果如圖8所示，目標(biāo)miRNAlet_7a與let-7b, let-7c的區(qū)別顯著，let_7b, let_7c與背景信號(hào)區(qū)分微弱,本發(fā)明的miRNA擴(kuò)增檢測(cè)方法具有特異性。
[0101]臨床樣本檢測(cè)
[0102]應(yīng)用例1:用實(shí)施例1中miRNA擴(kuò)增檢測(cè)方法檢測(cè)人腦總RNA中l(wèi)et_7a的含量。首先將人腦總RNA樣本稀釋至200ng / μ L，再取I μ L(即200ng)進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)，結(jié)果如圖9所示，可以看出，與對(duì)照管相比，200ng人腦總RNA樣本(Yl)呈現(xiàn)出明顯的熒光信號(hào)，根據(jù)該曲線計(jì)算出拐點(diǎn)，再代入圖6的標(biāo)準(zhǔn)曲線，可計(jì)算出200ng人腦總RNA樣本含有
10.93 X I(T1V)I 的 let-7a。
[0103]應(yīng)用例2:將20 X I(TicW)I的let-7a摻入到應(yīng)用例I中的I μ L總RNA樣本中，混合成新的樣品(Υ2)，再對(duì)新樣品進(jìn)行檢測(cè)分析，經(jīng)過(guò)計(jì)算，新樣本含有33.95Χ I(T1V)I的let_7a。
[0104]本發(fā)明的miRNA擴(kuò)增檢測(cè)方法可滿足不同的檢測(cè)需求:
[0105]第一，可用于目標(biāo)miRNA的快速篩查，根據(jù)目標(biāo)miRNA設(shè)計(jì)線性模版和發(fā)夾探針，可對(duì)樣品進(jìn)行快速篩查，能夠發(fā)出熒光信號(hào)表明樣品中存在了目標(biāo)miRNA;沒(méi)有發(fā)出熒光信號(hào)表明樣品中不存在目標(biāo)miRNA。
[0106]第二，可用于目標(biāo)miRNA樣品進(jìn)行定量檢測(cè)，根據(jù)目標(biāo)miRNA設(shè)計(jì)線性模版和發(fā)夾探針，配置目標(biāo)miRNA標(biāo)準(zhǔn)樣品，根據(jù)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)樣品的擴(kuò)增檢測(cè)所得的熒光信號(hào)強(qiáng)度值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用熒光信號(hào)強(qiáng)度曲線的最大斜率所對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增時(shí)間(定義為拐點(diǎn))對(duì)miRNA標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度的負(fù)對(duì)數(shù)作圖(以miRNA標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度的負(fù)對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，以拐點(diǎn)為縱坐標(biāo))，再對(duì)實(shí)際樣品中的miRNA熒光強(qiáng)度值進(jìn)行檢測(cè)，繪制熒光信號(hào)強(qiáng)度曲線，根據(jù)曲線計(jì)算得到實(shí)際樣品的拐點(diǎn)，再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(將實(shí)際樣品的拐點(diǎn)代入到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程中)計(jì)算出實(shí)際樣品中miRNA的含量。
[0107]雖然本發(fā)明參照當(dāng)前的較佳實(shí)施方式進(jìn)行了描述，但本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)能理解，上述較佳實(shí)施方式僅用來(lái)說(shuō)明本發(fā)明，并非用來(lái)限定本發(fā)明的保護(hù)范圍，任何在本發(fā)明的精神和原則范圍之內(nèi)，所做的任何修飾、等效替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的權(quán)利保護(hù)范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種線性模版，用于miRNA檢測(cè)，包括三個(gè)部分，從3’端到5’端依次為:第一結(jié)合位點(diǎn)，切刻內(nèi)切酶識(shí)別序列的互補(bǔ)序列，第一擴(kuò)增區(qū)域； 所述的第一結(jié)合位點(diǎn)與待測(cè)miRNA具有互補(bǔ)配對(duì)序列； 所述的第一擴(kuò)增區(qū)域含有15-25個(gè)核苷酸，所述第一擴(kuò)增區(qū)域的互補(bǔ)序列作為引物引發(fā)延伸反應(yīng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的線性模版，其特征在于，具有序列表中SEQIDN0.1所示的核苷酸序列。
3.一種發(fā)夾探針，用于miRNA檢測(cè)，包括四個(gè)部分，從3’端到5’端依次為:第二結(jié)合位點(diǎn)，第一莖區(qū)域，切刻內(nèi)切酶識(shí)別序列的互補(bǔ)序列，第二擴(kuò)增區(qū)域； 所述的第二結(jié)合位點(diǎn)與權(quán)利要求1的線性模版的第一擴(kuò)增區(qū)域有部分重復(fù)序列，與所述的第一擴(kuò)增區(qū)域的互補(bǔ)序列進(jìn)行互補(bǔ)配對(duì)； 所述的第二擴(kuò)增區(qū)域與待測(cè)miRNA具有互補(bǔ)配對(duì)序列； 所述的第一莖區(qū)域與所述第二擴(kuò)增區(qū)域的反向序列有互補(bǔ)配對(duì)序列； 所述的第一莖區(qū)域與所述的第二擴(kuò)增區(qū)域通過(guò)發(fā)夾探針序列的自身回折進(jìn)行序列互補(bǔ)配對(duì)形成雙螺旋結(jié)構(gòu)，形成發(fā)夾探針的莖結(jié)構(gòu)；所述的切刻內(nèi)切酶識(shí)別序列的互補(bǔ)序列形成發(fā)夾探針的環(huán)結(jié)構(gòu)；所述的第二結(jié)合位點(diǎn)形成發(fā)夾探針的3’突出末端。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的發(fā)夾探針，其特征在于，所述的第二結(jié)合位點(diǎn)5’末端堿基上標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)；所述的第二擴(kuò)增區(qū)域5’末端堿基上標(biāo)記有熒光基團(tuán)。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的發(fā)夾探針，其特征在于，具有序列表中SEQIDN0.2所示的核苷酸序列。
6.一種利用權(quán)利要求1所述的線性模版和權(quán)利要求3所述的發(fā)夾探針進(jìn)行miRNA擴(kuò)增檢測(cè)的方法，包括以下步驟: a、檢測(cè)探針的設(shè)計(jì) 根據(jù)待測(cè)miRNA序列設(shè)計(jì)權(quán)利要求1所述的線性模版，以及權(quán)利要求3所述的發(fā)夾探針，在第二結(jié)合位點(diǎn)5’末端堿基上標(biāo)記熒光淬滅基團(tuán)，在第二擴(kuò)增區(qū)域5’末端堿基上標(biāo)記熒光基團(tuán)； b、線性模版的擴(kuò)增 將線性模版、dNTPs、待測(cè)miRNA樣品進(jìn)行混合，預(yù)熱后冷卻，得到第一混合溶液； 將切刻內(nèi)切酶、DNA聚合酶加入到第一混合溶液中，進(jìn)行延伸反應(yīng)，得到第二混合溶液； C、發(fā)夾探針的擴(kuò)增 將發(fā)夾探針加入到步驟b中得到的第二混合溶液中，進(jìn)行熒光定量PCR，并對(duì)熒光信號(hào)的實(shí)時(shí)變化進(jìn)行監(jiān)測(cè)。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的miRNA擴(kuò)增檢測(cè)方法，其特征在于，所述.的DNA聚合酶為高保真的耐熱DNA聚合酶。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的miRNA擴(kuò)增檢測(cè)方法，其特征在于，所述的DNA聚合酶具有3’到5’方向核酸外切酶校讀活性。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的miRNA擴(kuò)增檢測(cè)方法，其特征在于，所述的切刻內(nèi)切酶選自Nt.BstNB1、Nt.BbvCI 或 Nt.AlwI。
10.根據(jù)權(quán)利要求6所述的miRNA擴(kuò)增檢測(cè)方法，其特征在于，所述的線性模版的擴(kuò)增中預(yù)熱溫度為95°C。
11.根據(jù)權(quán)利要求6所述的miRNA擴(kuò)增檢測(cè)方法，其特征在于，所述的線性模版的擴(kuò)增中冷卻溫度為55°C。
12.根據(jù)權(quán)利要求6所述的miRNA擴(kuò)增檢測(cè)方法，其特征在于，所述的發(fā)夾探針的擴(kuò)增的溫度為52°C。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103834719SQ201210492810
【公開(kāi)日】2014年6月4日 申請(qǐng)日期:2012年11月28日 優(yōu)先權(quán)日:2012年11月28日
【發(fā)明者】張春陽(yáng), 王國(guó)磊 申請(qǐng)人:深圳先進(jìn)技術(shù)研究院