專利名稱：用于肝硬化及肝癌早期診斷的基于微小rna的方法和組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及用于肝纖維化/肝硬化及肝癌早期診斷的基于微小RNA的方法和組合物。
背景技術(shù)：
肝纖維化是肝細胞損傷后的一種修復(fù)機制，一旦發(fā)展成彌漫性伴結(jié)節(jié)性增生，使正常肝組織結(jié)構(gòu)紊亂，就形成了肝硬化。肝硬化是肝癌的主要風險因素。目前，用于肝纖維化/肝硬化的診斷手段包括肝組織病理檢查、臨床評估、血清生化指標、影像學檢查、瞬時彈性波掃描(Fitooscan)、蛋白質(zhì)組學和糖組學技術(shù)。但是，這些手段要么靈敏度、特異度較低，要么費用昂貴，限制了其在臨床上的便捷使用。
肝癌是世界上第五大常見的癌癥，也是死亡率排行第三的癌癥。80%的肝癌常與慢性乙型肝炎病毒和/或丙型肝炎病毒感染有關(guān)。如此高的致死率是因為缺乏敏感而特異的無創(chuàng)性指標來進行早期診斷。由于早期肝癌癥狀不明顯，通常在晚期才得以確診，那時，由于大多存在癌細胞肝內(nèi)或/及肝外轉(zhuǎn)移，病人已經(jīng)喪失了手術(shù)切除病灶的機會。目前，肝癌的診斷主要依賴于影像學上發(fā)現(xiàn)肝內(nèi)腫物，包括超聲、CT、核磁共振(MRI)等，同時結(jié)合血清中的腫瘤標志物如AFP等。但是，這兩種方法的敏感性及特異性都不是十分令人滿意。
miRNA是一類小的非編碼的RNA，它們在細胞的增殖、分化及凋亡過程中發(fā)揮了重要的作用。miRNA通過結(jié)合在靶mRNA的3’-非編碼區(qū)的特異位點上來抑制翻譯或使靶mRNA 降解。miRNA的失調(diào)可導(dǎo)致內(nèi)環(huán)境的紊亂，最終導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。位于腫瘤相關(guān)的基因區(qū)域或脆性位點的miRNA基因在腫瘤中常常會擴增或缺失，這意味著miRNA在惡變過程中發(fā)揮了重要作用。miRNA可作為癌基因或抑癌基因，幾乎所有的人類腫瘤中都可以發(fā)現(xiàn)miRNA 的失調(diào)。miRNA能以穩(wěn)定的形式在人類的體液如血清、血漿中檢測到，這使它有可能成為無創(chuàng)的檢查指標。
肝纖維化/肝硬化尤其肝癌的早期診斷可以使疾病獲得根治性治療。盡管目前對肝纖維化/肝硬化以及肝癌的相關(guān)診斷投入了很多研究，也取得一定進展，但是目前臨床上肝纖維化/肝硬化及肝癌的血清學早期診斷仍然是瓶頸問題，需要敏感而特異的無創(chuàng)性血清學指標，尤其是基于miRNA的無創(chuàng)性指標。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種診斷受試者是否具有肝纖維化/肝硬化或肝癌的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的另一目的在于提供微小RNA和/或所述微小RNA的檢測引物在制備所述診斷組合物中的應(yīng)用。
本發(fā)明的又一目的在于提供用于檢測肝纖維化/肝硬化或肝癌的診斷組合物。
在本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明提供了一種診斷受試者是否具有肝纖維化/肝硬化或處于肝纖維化/肝硬化的風險中的方法，其包括測定來自所述受試者的受試樣品中的微小RNA的水平，其中相對于對照樣品中的相應(yīng)微小RNA的水平，受試樣品中的微小RNA水平的改變表明受試者具有肝纖維化/肝硬化或處于肝纖維化/肝硬化的風險中。
在一個實施方案中，本發(fā)明提供了微小RNA和/或所述微小RNA的特異性探針/ 檢測引物在制備診斷組合物中的應(yīng)用，其中所述診斷組合物用于通過測定來自所述受試者的受試樣品中的上述微小RNA的水平從而診斷受試者是否具有肝纖維化/肝硬化或處于肝纖維化/肝硬化的風險中，其中相對于對照樣品中的相應(yīng)微小RNA的水平，受試樣品中的所述微小RNA水平的改變表明受試者具有肝纖維化/肝硬化或處于肝纖維化/肝硬化的風險中。
在某些優(yōu)選的實施方案中，所述受試樣品中的微小RNA的水平高于對照樣品中的相應(yīng)微小RNA的水平。
在本發(fā)明的第二方面，本發(fā)明提供了一種診斷受試者是否具有肝癌或處于肝癌的風險中的方法，其包括測定來自所述受試者的受試樣品中的微小RNA的水平，其中相對于對照樣品中的相應(yīng)微小RNA的水平，受試樣品中的微小RNA水平的改變表明受試者具有肝癌或處于肝癌的風險中。
在一個實施方案中，本發(fā)明提供了微小RNA和/或所述微小RNA的特異性探針/ 檢測引物在制備診斷組合物中的應(yīng)用，其中所述診斷組合物用于通過測定來自所述受試者的受試樣品中的上述微小RNA的水平從而診斷受試者是否具有肝癌或處于肝癌的風險中， 其中相對于對照樣品中的相應(yīng)微小RNA的水平，受試樣品中的所述微小RNA水平的改變表明受試者具有肝癌或處于肝癌的風險中。
在某些優(yōu)選的實施方案中，所述受試樣品中的微小RNA的水平低于對照樣品中的相應(yīng)微小RNA的水平。
在某些優(yōu)選的實施方案中，所述受試者是肝纖維化/肝硬化患者。
在某些優(yōu)選的實施方案中，所述受試者是乙肝陽性受試者，優(yōu)選地，所述受試者是乙肝表面抗原(HBsAg)陽性受試者，更優(yōu)選地，所述受試者是乙肝表面抗原陽性的肝炎患者，最優(yōu)選地，所述受試者是乙肝表面抗原陽性的肝纖維化/肝硬化患者。
在本發(fā)明的第三方面，本發(fā)明提供了一種用于檢測肝纖維化/肝硬化或肝癌的診斷組合物，其中所述診斷組合物包含微小RNA的特異性探針/檢測引物。
在本發(fā)明某些優(yōu)選的實施方案中，所述微小RNA為miRNA-101，優(yōu)選地，所述微小 RNA 選自 miRNA-101-1、miRNA-101_2、miRNA-101-5p 和 miRNA-101_3p 中的一種或更多種， 更優(yōu)選地，所述微小RNA為miRNA-101-5p。
在本發(fā)明某些優(yōu)選的實施方案中，所述受試樣品來自受試者的體液，優(yōu)選地，來自血液，更優(yōu)選地，來自血清。
在本發(fā)明某些優(yōu)選的實施方案中，所述特異性探針/檢測引物的核酸序列包含 SEQ ID NO:5。
在本文中，術(shù)語“微小RNA”、“miRNA”和“miR”可交換地使用，指來自miR基因的未加工的或加工的RNA轉(zhuǎn)錄物。未加工的miR基因轉(zhuǎn)錄物也稱作“miR前體”并且通常包括長度約70-100個核苷酸的RNA轉(zhuǎn)錄物，通過RNA酶(例如Dicer或RNAase III，如大腸桿菌的RNAase III)消化將miR前體加工成長度約18-26個核苷酸的活性RNA分子。該長度約18-26個核苷酸的活性RNA分子也稱作“加工的”miR基因轉(zhuǎn)錄物或“成熟”miRNA。應(yīng)當理解的是本文所用術(shù)語“微小RNA”、“miRNA”或“miR”包括一種或多種miR-寡核苷酸，包括成熟miR、前-miR (pre_miR)、原-miR (pri_miR)和它們的變體。在某些實施方案中,還可使用各種miR核酸的混合物。
在本文中，術(shù)語“miRNA-ΙΟ ”或“miR-ΙΟ ” 指目前包括 miRNA-101-l、 miRNA-101-2、miRNA-101-5p、miRNA-101-3p 的 miRNA家族。術(shù)語“miRNA-ΙΟ ”或“miR-ΙΟ ” 也包括任何迄今未鑒定的miRNA-ΙΟ 家族的成員。用于本發(fā)明中的“miRNA-ΙΟ ”或 “miR-ΙΟ ”的特征如表I所示。在本發(fā)明某些優(yōu)選的實施方案中，可使用各種miR-ΙΟ 核酸的混合物，例如 miRNA-101-l、miRNA-101-2、miRNA-101-5p 和 miRNA-101_3p 的各種組合所獲得的混合物。
表I.用于本發(fā)明中的miRNA-ΙΟ 的特征
權(quán)利要求
1.一種診斷受試者是否具有肝纖維化/肝硬化或處于肝纖維化/肝硬化的風險中的方法，其包括測定來自所述受試者的受試樣品中的微小RNA的水平，其中相對于對照樣品中的相應(yīng)微小RNA的水平，受試樣品中的微小RNA水平的改變表明受試者具有肝纖維化/肝硬化或處于肝纖維化/肝硬化的風險中。
2.微小RNA和/或所述微小RNA的特異性探針/檢測引物在制備診斷組合物中的應(yīng)用，其中所述診斷組合物用于通過測定來自所述受試者的受試樣品中的上述微小RNA的水平從而診斷受試者是否具有肝纖維化/肝硬化或處于肝纖維化/肝硬化的風險中，其中相對于對照樣品中的相應(yīng)微小RNA的水平，受試樣品中的所述微小RNA水平的改變表明受試者具有肝纖維化/肝硬化或處于肝纖維化/肝硬化的風險中。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2的方法/應(yīng)用，其中受試樣品中的微小RNA的水平高于對照樣品中的相應(yīng)微小RNA的水平。
4.一種診斷受試者是否具有肝癌或處于肝癌的風險中的方法，其包括測定來自所述受試者的受試樣品中的微小RNA的水平，其中相對于對照樣品中的相應(yīng)微小RNA的水平，受試樣品中的微小RNA水平的改變表明受試者具有肝癌或處于肝癌的風險中。
5.微小RNA和/或所述微小RNA的特異性探針/檢測引物在制備診斷組合物中的應(yīng)用，其中所述診斷組合物用于通過測定來自所述受試者的受試樣品中的上述微小RNA的水平從而診斷受試者是否具有肝癌或處于肝癌的風險中，其中相對于對照樣品中的相應(yīng)微小 RNA的水平，受試樣品中的所述微小RNA水平的改變表明受試者具有肝癌或處于肝癌的風險中。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5的方法/應(yīng)用，其中受試樣品中的微小RNA的水平低于對照樣品中的相應(yīng)微小RNA的水平。
7.根據(jù)權(quán)利要求4-6任一項的方法/應(yīng)用，其中所述受試者是肝纖維化/肝硬化患者。
8.根據(jù)權(quán)利要求4-6任一項的方法/應(yīng)用，其中所述受試者是乙肝陽性受試者，優(yōu)選地，所述受試者是乙肝表面抗原(HBsAg)陽性受試者，更優(yōu)選地，所述受試者是乙肝表面抗原陽性的肝炎患者，最優(yōu)選地，所述受試者是乙肝表面抗原陽性的肝纖維化/肝硬化患者。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8任一項的方法/應(yīng)用，其中所述微小RNA為miRNA-101，優(yōu)選地， 所述微小 RNA 選自 miRNA-101-l、miRNA-101-2、miRNA-101-5p 和 miRNA-101_3p 中的一種或更多種，更優(yōu)選地，所述微小RNA為miRNA-101-5p。
10.權(quán)利要求1-9任一項的方法/應(yīng)用，其中所述受試樣品來自體液，優(yōu)選地，來自血液，更優(yōu)選地，來自血清。
11.一種用于檢測肝纖維化/肝硬化或肝癌的診斷組合物，其中所述診斷組合物包含微小RNA的特異性探針/檢測引物。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的診斷組合物，其中所述微小RNA為miRNA-101，優(yōu)選地，所述微小 RNA 選自 miRNA-101-1、miRNA-101_2、miRNA-101-5p 和 miRNA-101_3p 中的一種或更多種，更優(yōu)選地，所述微小RNA為miRNA-101-5p。
13.根據(jù)權(quán)利要求2-3和5-10任一項的應(yīng)用，或根據(jù)權(quán)利要求11或12的診斷組合物， 其中所述特異性探針/檢測引物的核酸序列包含SEQ ID N0:5。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于肝纖維化/肝硬化及肝癌早期診斷的基于微小RNA的方法和組合物。本發(fā)明還提供了微小RNA和/或所述微小RNA的檢測引物在制備肝纖維化/肝硬化及肝癌診斷用組合物中的應(yīng)用。本發(fā)明首次揭示并證明了血清miRNA-101-5p水平可以作為一個潛在的無創(chuàng)的早期診斷乙肝/肝硬化相關(guān)性肝癌的指標，同時也可以作為一個與肝纖維化/肝硬化診斷相關(guān)的指標。
文檔編號C12Q1/68GK102936629SQ20121049510
公開日2013年2月20日 申請日期2012年11月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月28日
發(fā)明者閭軍, 謝云, 郭佳, 田洲 申請人:首都醫(yī)科大學附屬北京佑安醫(yī)院