專(zhuān)利名稱(chēng)：一種低溫β-瓊膠酶及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種低溫β -瓊膠酶及其編碼基因與應(yīng)用，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
瓊膠酶是一種重要的海洋生物酶，在生化、臨床、醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域有著廣泛的用途。瓊膠降解菌分布較廣，但主要存在于海洋中，在土壤、淡水中較少，海洋生態(tài)環(huán)境復(fù)雜，特別是極地(南北極)海洋環(huán)境中的微生物由于高鹽度、高輻射、低溫、反復(fù)凍融及特殊的光照特征可能使海洋微生物的遺傳結(jié)構(gòu)和生理習(xí)性發(fā)生適應(yīng)性的改變，能夠產(chǎn)生各種具有特異生理活性的酶系。因而于極地海洋微生物中分離獲得的瓊膠酶可能具有獨(dú)特的降解活性和更高的催化活力，具有潛在的開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景。目前，β -瓊膠酶最適酶活均為常溫或高溫，如中國(guó)專(zhuān)利文獻(xiàn)CN101845447A (申請(qǐng)?zhí)?01010170690. 7)公開(kāi)了一種瓊膠酶及其編碼基因的獲取方法。從海洋細(xì)菌需鈉弧菌(保藏號(hào)CGMCC No. 2428)中首次利用多種PCR方法獲取該瓊膠酶基因aga41，突破了以往通過(guò)構(gòu)建文庫(kù)篩選瓊膠酶基因的傳統(tǒng)方法。該瓊膠酶基因aga41屬于β-瓊膠酶中的GH50家族，全長(zhǎng)2973bp，編碼990個(gè)氨基酸，與已知瓊膠酶序列相似性最高為49%。該β-瓊膠酶的最適酶活溫度為40°C。中國(guó)專(zhuān)利文獻(xiàn)CN102399802A (申請(qǐng)?zhí)?01110128971. O)公開(kāi)了一種β -瓊膠酶AgaXa,是由Catenivulumsp. Χ3的一個(gè)瓊膠酶基因agaXa編碼的一種新型瓊膠酶。本發(fā)明的β -瓊膠酶AgaXa及獨(dú)特之處是在47°C (瓊脂糖凝固的溫度為40°C )時(shí)，酶活性穩(wěn)定且酶活力高，因此本發(fā)明可以應(yīng)用于從瓊脂糖凝膠中回收DNA，且具有優(yōu)勢(shì)。本發(fā)明β-瓊膠酶AgaXa能夠特異的降解瓊脂糖產(chǎn)生聚合度為6-14的新瓊寡糖，能夠應(yīng)用于生產(chǎn)多聚寡糖。上述β -瓊膠酶均需要外加熱源才能達(dá)到最適酶活，因此耗費(fèi)能量，處理成本較聞。 極端(南北極)海洋環(huán)境微生物是開(kāi)發(fā)新型海洋活性物質(zhì)的另一重要來(lái)源，微生物要在這種環(huán)境中得以生存，必須從自身的生理結(jié)構(gòu)、代謝方式及生活行為各方面發(fā)生適應(yīng)性的改變，因此，從這些環(huán)境中篩選得到的微生物，可能具備某些特殊的生理活性，能夠產(chǎn)生某種特殊的代謝產(chǎn)物。南極海洋細(xì)菌中，77%是耐冷型，23%為嗜冷型。低溫微生物具有不易受雜菌污染、作用條件要求簡(jiǎn)單、高酶活力及高催化效率等優(yōu)勢(shì)，可大大縮短處理過(guò)程的時(shí)間并省卻昂貴的加熱及冷卻系統(tǒng)，因而在節(jié)能方面有較大的優(yōu)勢(shì)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種低溫β -瓊膠酶及其編碼基因與應(yīng)用。本發(fā)明技術(shù)方案如下一種低溫β -瓊膠酶NJ21，氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。上述低溫β -瓊膠酶基因NJ21，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。一種重組載體，插入了 SEQ ID NO.1所示核苷酸序列。
一種重組細(xì)胞，轉(zhuǎn)入了上述SEQ ID NO.1所示核苷酸序列或上述重組載體。上述低溫β -瓊膠酶在工業(yè)化降解瓊脂糖中的應(yīng)用。有益效果本發(fā)明從產(chǎn)瓊膠酶的南極菌株中克隆獲得瓊膠酶的基因并可克隆到合適的宿主中實(shí)現(xiàn)異源表達(dá)，最終實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)瓊膠酶，該低溫瓊膠酶NJ21具有較強(qiáng)的低溫耐受力，為后續(xù)的工業(yè)應(yīng)用提供成本低廉的瓊膠酶起始材料。


圖1為不同pH條件對(duì)β -瓊膠酶活性的影響曲線；圖2為不同溫度條件對(duì)β -瓊膠酶活性的影響曲線；圖3為經(jīng)SDS-PAGE電泳獲得的電泳圖；圖4為低溫β -瓊膠酶NJ21酶液4°C置于固體平板培養(yǎng)基上7天后的照片。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合說(shuō)明書(shū)附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步說(shuō)明，但本發(fā)明所保護(hù)范圍不限于此。 培養(yǎng)基分離培養(yǎng)基(又名Zobell 2216E海水培養(yǎng)基)組分如下蛋白胨5g，酵母粉lg，用過(guò)濾后的陳海水定容至1000ml, 121°C下高壓濕熱滅菌20min。分離平板培養(yǎng)基組分如下蛋白胨5g，酵母粉lg，瓊脂15g，用過(guò)濾后的陳海水定容至1000ml, 121°C下高壓濕熱滅菌20min。LB液體培養(yǎng)基組分如下蛋白胨IOg,酵母粉5g,氯化鈉IOg,用去離子水定容至1000ml, 121°C下高壓濕熱滅菌20min。LB平板培養(yǎng)基組分如下蛋白胨IOg,酵母粉5g,氯化鈉IOg,瓊脂15g,用去離子水定容至1000ml, 121°C下高壓濕熱滅菌20min。微生物材料的獲得微生物樣品采自于中國(guó)第24次南極科學(xué)考察采集的海冰樣品，采用分離平板培養(yǎng)基在溫度為10°C的條件下，經(jīng)3次劃線培養(yǎng)挑取單克隆，制得菌株NJ-21，經(jīng)16S DNA鑒定確定該菌為交替假單胞菌(Pseudoalteromonas)屬。將純化的菌株加入含30wt%的甘油溶液中，保存于_80°C超低溫冰箱中。實(shí)施例1 :產(chǎn)β -瓊膠酶南極菌株的基因組文庫(kù)的構(gòu)建( I)制備目的DNA片段將交替假單胞菌(Pseudoalteromonas) NJ-21種子液接種于Zobell 2216Ε海水培養(yǎng)基中，于10°C、150rpm的振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3d后，用細(xì)菌基因組提取試劑盒(購(gòu)自Tiangen公司，DP302-02)提取染色體DNA，檢測(cè)其電泳DNA濃度，DNA長(zhǎng)度大于40kb，符合建庫(kù)要求。(2)基因組DNA的部分消化交替假單胞菌(Pseudoalteromonas) NJ-21染色體DNA經(jīng)Sau3AI內(nèi)切酶部分消化，Sau3AI內(nèi)切酶酶切60min后，制得插入片段。酶切60min后，染色體DNA剛好酶切完全，適用于構(gòu)建基因組文庫(kù)；當(dāng)酶切時(shí)間超過(guò)SOmin后，酶切過(guò)度，各片段不是平均分布，而多為小片段，不利于建庫(kù)。因此選酶切60min作為菌株NJ-21染色體DNA的不完全酶切時(shí)間。(3)基因組文庫(kù)的構(gòu)建按照pET22b載體(購(gòu)自Novagen公司)和插入片段約1:3的摩爾比作連接反應(yīng)。反應(yīng)體系于16°C連接過(guò)夜，濃縮連接產(chǎn)物至3μ 1，分別取Iy I轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞E. coliDH5a，培養(yǎng)后涂布與含有氨芐青霉素(50 μ g/ml)、IPTG (20 μ g/ml)和X-Gal (40 μ g/ml)的LB平板培養(yǎng)基上，于37°C靜置培養(yǎng)過(guò)夜至可見(jiàn)菌落，根據(jù)菌落藍(lán)白斑反應(yīng)篩選轉(zhuǎn)化子。隨機(jī)挑取約20000個(gè)菌落作為基因組文庫(kù)的克隆保存，從平板中隨機(jī)挑選16個(gè)白色單菌落，提取質(zhì)粒，用BcaBEST Primer M13-47和BcaBEST Primer RV-M經(jīng)PCR擴(kuò)增目的片斷，引物序列如下BcaBEST Primer M13-47 :5’ -CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’BcaBEST Primer RV-M :5’ -GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3’PCR 反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性 5min ;95°C變性 30s，55°C退火 30s，72°C延伸 240s，30個(gè)循環(huán)；72°C延伸lOmin。經(jīng)檢測(cè)每個(gè)克隆均有外源DNA,最小插入片段為800bp左右,最大插入片段6kb左右，平均插入片段大小約為4kb左右。實(shí)施例2 低溫β -瓊膠酶NJ21全序列的獲取從基因組文庫(kù)中篩選一個(gè)周?chē)忻黠@水解圈的克隆。提取重組質(zhì)粒，提取重組質(zhì)粒并測(cè)序，獲得低溫β -瓊膠酶NJ21完整的ORF。ORF的完整長(zhǎng)度為2382bp，共編碼794個(gè)氨基酸，計(jì)算其理論分子量為88kDal。實(shí)施例3低溫β -瓊膠酶NJ21的重組表達(dá)質(zhì)粒和重組菌株的構(gòu)建將本發(fā)明獲得的低溫β -瓊膠酶基因NJ21克隆到表達(dá)載體上，構(gòu)建重組表達(dá)菌株。首先基于全長(zhǎng)序列，設(shè)計(jì)擴(kuò)增全基因的引物上游引物F-ACGCGTCGACATGAACGCCAGTAAAAAGCTTTTGT ；下游引物R-CCGCTCGAGTTATTTTGAACCGAAACGACGCTCG ；PCR擴(kuò)增確認(rèn)基因全長(zhǎng)序列。采用酶切克隆的方法構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒，即用Xho I內(nèi)切酶和Sal I內(nèi)切酶雙酶切PCR產(chǎn)物，切膠回收酶切后的片段，和同樣經(jīng)過(guò)Xho I內(nèi)切酶和Sal I內(nèi)切酶雙酶切的質(zhì)粒pET22b連接，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌TOPlO中，氨芐青霉素抗性篩選陽(yáng)性克隆。采用質(zhì)粒抽提試劑盒(購(gòu)自Tiangen公司)提取陽(yáng)性克隆的質(zhì)粒，經(jīng)檢測(cè)，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，命名為低溫β -瓊膠酶基因NJ21 ;該基因編碼793氨基酸，氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。將上述制得的陽(yáng)性克隆的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21 (DE3)表達(dá)菌株中，構(gòu)建表達(dá)重組菌株；具體過(guò)程如下取_80°C保存的BL21，于冰上融化，以預(yù)冷的 移液管槍尖吸取10 μ I重組質(zhì)粒，加入剛剛?cè)诨腂L21 ;輕搖混勻，冰浴放置30min，迅速轉(zhuǎn)移到42°C水浴中，準(zhǔn)確放置90秒；迅速轉(zhuǎn)移到冰上，冷卻2min ;然后加入800 μ I LB液體培養(yǎng)基，于37°C，150rpm，45min ;涂布含氨芐青霉素100 μ g/mL的LB平板培養(yǎng)基過(guò)夜培養(yǎng)。實(shí)施例4利用重組表達(dá)菌株表達(dá)低溫瓊膠酶NJ21將實(shí)施例3構(gòu)建好的表達(dá)重組菌株轉(zhuǎn)接到IOOml含有氨芐青霉素100 μ g/mL的LB液體培養(yǎng)基中，37 °C擴(kuò)大培養(yǎng)直至菌液0D_值達(dá)O. 5時(shí)，15°C冷卻30min，加入異丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)使其終濃度為O. 5mmol/L, 15°C搖床培養(yǎng)24h。低溫離心收集上清，濃縮凍干。然后進(jìn)行Ni2+親和層析，由于表達(dá)的重組蛋白N端含有6XHis tag,能親和吸附到層析柱中，經(jīng)不同濃度的咪唑溶液梯度洗脫后，收集洗脫液。經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測(cè)，如圖3所示，切膠分離得到低溫β-瓊膠酶NJ21。實(shí)施例5低溫β -瓊膠酶NJ21的活性檢測(cè)和酶特性分析利用DNS (3，5- 二硝基水楊酸)方法測(cè)定實(shí)施例4制得的低溫β -瓊膠酶NJ21活性。具體操作如下分別取ImL滅活的與沒(méi)滅活的低溫β -瓊膠酶NJ21酶液和2mL底物溶液(含有O. 25wt%的瓊脂糖)于30°C溫度恒溫水浴反應(yīng)30min，取ImL反應(yīng)產(chǎn)物加入到1. 5mL DNS溶液中，沸水浴5min。而后迅速冷卻至室溫,加蒸懼水至25mL,混勻在520nm波長(zhǎng)下測(cè)OD值。測(cè)得的瓊膠酶活性為1200U/ml。另外，將實(shí)施例4制得的低溫β -瓊膠酶NJ21酶液直接滴于固體平板培養(yǎng)基上，在4°C放置7天后，可以觀察到明顯的凹陷，用碘`液染色后可以看到透明圈，表明低溫β-瓊膠酶NJ21是具有瓊膠降解活性的，為后續(xù)的研究和應(yīng)用提供了良好材料。為測(cè)定不同溫度對(duì)低溫瓊膠酶NJ21活力的影響，分別在5°C、10°C、15°C、20°C、25°C、30°C、35°C、40°C、45°C、50°C、55°C、60°C、65°C進(jìn)行酶促反應(yīng) 30min，DNS 法測(cè)定低溫β -瓊膠酶NJ21的酶活。以酶活最高值為100%計(jì)算其相對(duì)酶活力。為測(cè)定不同pH對(duì)低溫β -瓊膠酶NJ21活力的影響，分別用不同的pH的PBS緩沖液(ρΗ5· 0、5· 5、6· 0、6· 5、7· O)、Tris - HCl 緩沖液(pH 7. 0、7· 5、8· 0、8· 5、9· 0、9· 5)配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的瓊脂糖溶液作為底物，30°C進(jìn)行酶促反應(yīng)30min用DNS法測(cè)定低溫β -瓊膠酶NJ21的酶活。以最高酶活力為100%計(jì)算其相對(duì)酶活力。經(jīng)測(cè)定，低溫β -瓊膠酶NJ21的最適pH為7. 5 (圖1)，最適反應(yīng)溫度為30°C (如圖2)，在溫度為5°C的條件下，該酶仍具有40%左右的酶活，較現(xiàn)有β -瓊膠酶具有明顯的低溫耐受性特性。
權(quán)利要求
1.一種低溫^ -瓊膠酶NJ21，氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
2.一種低溫P -瓊膠酶基因NJ21，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
3.一種重組載體，插入了 SEQ ID NO.1所示核苷酸序列。
4.一種重組細(xì)胞，轉(zhuǎn)入了 SEQ ID NO.1所示核苷酸序列或權(quán)利要求3所述的重組載體。
5.權(quán)利要求1所述的低溫￠-瓊膠酶NJ21在工業(yè)化降解瓊脂糖中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種低溫β-瓊膠酶及其編碼基因與應(yīng)用。該低溫β-瓊膠酶基因NJ21，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；低溫β-瓊膠酶NJ21，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本發(fā)明還涉及低溫β-瓊膠酶NJ21在工業(yè)化降解瓊脂糖中的應(yīng)用。本發(fā)明從產(chǎn)瓊膠酶的南極菌株中克隆獲得瓊膠酶的基因并可克隆到合適的宿主中實(shí)現(xiàn)異源表達(dá)，最終實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)瓊膠酶，該低溫β-瓊膠酶NJ21具有較強(qiáng)的低溫耐受力，為后續(xù)的工業(yè)應(yīng)用提供成本低廉的瓊膠酶起始材料。
文檔編號(hào)C12P19/14GK103045563SQ20121049681
公開(kāi)日2013年4月17日 申請(qǐng)日期2012年11月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月28日
發(fā)明者李江 申請(qǐng)人:國(guó)家海洋局第一海洋研究所