專(zhuān)利名稱(chēng)：生物樣品中待檢物的夾心免疫pcr檢測(cè)方法和試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物樣品中待檢物的檢測(cè)技術(shù)，尤其涉及一種生物樣品中待檢物的夾心免疫PCR檢測(cè)方法和試劑盒。
背景技術(shù)：
Y干擾素是一種具有多種功能的免疫活性蛋白，具有抗病毒、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)和控制細(xì)胞凋亡等作用。干擾素及相關(guān)細(xì)胞因子的作用一直是生物醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)。然而干擾素體內(nèi)生物學(xué)作用很大但含量非常低，正常人血液內(nèi)每毫升只有幾個(gè)皮克，甚至更低。因此，研究發(fā)明一種高效、便捷、準(zhǔn)確、成本低的監(jiān)測(cè)手段顯得非常重要。目前，常用的檢測(cè)Y 干擾素的方法有儀器分析法和免疫檢測(cè)法。
儀器分析法主要包括高效液相色譜法(HPLC)和質(zhì)譜，靈敏度很高，但它需要昂貴的儀器設(shè)備，耗材要求高及樣本預(yù)處理，在專(zhuān)業(yè)人員的操作下才能進(jìn)行。這類(lèi)儀器分析法已經(jīng)不能達(dá)到現(xiàn)代檢測(cè)對(duì)快速、方便、成本低的要求。
免疫分析方法通常是指通過(guò)抗體與抗原的特異性特點(diǎn)用抗體(或抗原)來(lái)檢測(cè)抗原(或抗體)的檢測(cè)方法。這種特異性相互識(shí)別不限于抗原與抗體，受體與配體，酶與底物， 凝集素與多糖也適用。免疫檢測(cè)的經(jīng)典方法是酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)。傳統(tǒng)ELISA通過(guò)抗原非特異地結(jié)合到固相支持物上，實(shí)現(xiàn)了被檢抗原從溶液中轉(zhuǎn)移。洗滌去除多余的(未結(jié)合的)抗原后，封閉板孔。然而，在固相支持物上，固定的抗原與抗體連接形成一個(gè)免疫復(fù)合物，洗滌去除未結(jié)合的抗體，酶可以直接連接到抗體上，再通過(guò)酶聯(lián)檢測(cè)一抗?；蛘咛砑与S后與板連接的二抗。連接到固相支持物的酶活性與固定在固相支持上的抗原呈一定的比例關(guān)系，例如，可以通過(guò)一種顯色基質(zhì)和酶的作用，計(jì)算支持物上抗原的含量。該方法簡(jiǎn)單，經(jīng)濟(jì)，專(zhuān)一性好，而且已廣泛采用自動(dòng)化操作。但其檢測(cè)靈敏度低，對(duì)干擾素和細(xì)胞因子的常規(guī)檢出效果很差。
而聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction縮略詞為PCR)技術(shù)有很高的檢測(cè)靈敏度，為了增強(qiáng)ELISA的靈敏度，免疫PCR運(yùn)用而生。免疫PCR(Immun0-PCR，IPCR) 最早是由Sano等人提出，與間接ELISA類(lèi)似，不同的是免疫PCR使用一段DNA鏈作為檢測(cè)分子替代了 ELISA反應(yīng)中的酶。文獻(xiàn)顯示Sano等人通過(guò)BSA與抗BSA抗體反應(yīng)證實(shí)了免疫組化的效果，其通過(guò)蛋白A-親和素連接系統(tǒng)將生物素標(biāo)記的質(zhì)粒DNA標(biāo)記到一抗上，隨后PCR擴(kuò)增與抗原連接的DNA分子，擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)，EB染色，接著凝膠電泳分析。此方法與ELISA比，免疫PCR顯著提高了檢測(cè)靈敏度。這靈敏度可以通過(guò)純化系統(tǒng)來(lái)驗(yàn)證，但由于其存在過(guò)程繁瑣，步驟多的特點(diǎn)，很難在實(shí)際的醫(yī)學(xué)研究中運(yùn)用。
采用‘夾心’式的方法執(zhí)行免疫PCR，即包被抗體在固相支持物上如微孔板、磁珠顆粒，捕獲樣品中的抗原，緊接著添加檢測(cè)抗體，檢測(cè)抗體上標(biāo)記有報(bào)告分子如放射性同位素、熒光素、DNA和酶，這產(chǎn)生 了一個(gè)特殊的免疫復(fù)合物(抗體-抗原-抗體復(fù)合物)固定在固相支持物表面，反復(fù)洗滌固相支持物表面，去除未結(jié)合的抗原-抗體。在洗滌步驟中， 保持免疫復(fù)合物的完整性很重要，以致使信號(hào)強(qiáng)度最大化，由此最大限度的降低背景。在洗滌后，通過(guò)檢測(cè)報(bào)告分子來(lái)定量這個(gè)固定的‘檢測(cè)’抗體。報(bào)告分子的量能顯示出抗原的存在量。當(dāng)這個(gè)檢測(cè)系統(tǒng)是足夠靈敏時(shí)，系統(tǒng)的最低靈敏度通常由游離‘檢測(cè)’抗體非特異結(jié)合所產(chǎn)生背景的程度決定的。
在診斷和生物科學(xué)領(lǐng)域，需要一個(gè)強(qiáng)有力的檢測(cè)方法去分析一些低水平(低濃度) 存在的物質(zhì)，且隨著人類(lèi)基因組測(cè)序和分析的完成，這種需求變得越來(lái)越迫切。這些蛋白應(yīng)該被分析和定性，但是使用當(dāng)前的檢測(cè)技術(shù)不能量化這些蛋白。免疫PCR做為一種高靈敏度的檢測(cè)方法，為物質(zhì)高靈敏檢測(cè)提供了一個(gè)保證，但目前為止，傳統(tǒng)ELISA存在靈敏度低，傳統(tǒng)免疫PCR操作復(fù)雜且背景偏高，導(dǎo)致只能檢測(cè)一部分物質(zhì)，因此，很有必要開(kāi)發(fā)新的技術(shù)來(lái)解決這些問(wèn)題。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是，提供一種生物樣品中待檢物的夾心免疫PCR檢測(cè)方法和試劑盒，提高檢測(cè)靈敏度，降低操作要求。
本發(fā)明的技術(shù)問(wèn)題通過(guò)以下技術(shù)手段予以解決一種生物樣品中待檢物的夾心免疫PCR檢測(cè)方法，其特征在于，包括以下步驟1)第一抗體或受體的固定在支持物上連接生物樣品中待檢物的第一抗體或受體；2)特異性捕捉生物樣品使生物樣品中的待檢物通過(guò)一個(gè)連接位點(diǎn)與所述第一抗體或受體結(jié)合；3)連接第二抗體或受體將待檢物的第二抗體或受體連接到所述待檢物的另一個(gè)連接位點(diǎn)上，其中，所述第二抗體或受體標(biāo)記有第一核苷酸序列；4)雜交將與所述第一核苷酸序列具有互補(bǔ)的第二核苷酸序列與所述第一核苷酸序列雜交； 5)轉(zhuǎn)移采用置換或酶切核酸的方法從所述支持物上洗脫所述第二核苷酸序列并轉(zhuǎn)移到PCR管中；6)檢測(cè)定量PCR檢測(cè)所述PCR管中第二核苷酸序列的含量，該含量反應(yīng)了所述生物樣品中待檢物的含量。
優(yōu)選地所述第一核苷酸序列具有序列表SEQ ID NO.1所示的序列5 ; -aagctcgatatcagagga aggaggagggac-3 '；所述第二核苷酸序列具有序列表SEQ ID NO. 2所示的序列5' -tccttcctctgatatcga gettggcgtaatcagggtcatagctgtttcctgtgtgaaattgttatccgctcacaattccacacaacatacgagccg gaagcataaagtgtaaagcctgaagtgcctaatgagtg-3 } 0
所述步驟5)中采用置換方法從所述支持物上洗脫所述第二核苷酸序列包括采用與所述第一核苷酸序列互補(bǔ)的置換核酸分子與所述第二核苷酸序列進(jìn)行置換，所述置換核酸分子為具有序列表SEQ ID NO. 5所不序列的DNA序列或所述置換核酸分子為具有序列表SEQ ID NO. 6所示序列的肽核酸,序列表SEQ ID NO. 5所示序列為5 ' -gtccctcctccttc ctctgatatcgagctt-3 ',序列表 SEQ ID NO. 6 所不序列為5 ' -tccttcctctgatatcgagctt -3丨;或者所述第一核苷酸序列和所述第二核苷酸序列中均包含酶切位點(diǎn)，所述步驟5)中采用酶切方法從所述支持物上洗脫所述第二核苷酸序列采用限制性?xún)?nèi)切酶進(jìn)行洗脫。
所述待檢物為人Y干擾素。
—種生物樣品中待檢物的夾心免疫PCR檢測(cè)試劑盒，其特征在于包括支持物；待檢物的第一抗體或受體；待檢物的第二抗體或受體，該第二抗體或受體標(biāo)記有第一核苷酸序列；單鏈DNA片段，該單鏈DNA片段具有與所述第一核苷酸具有互補(bǔ)的第二核苷酸序列； 以及酶切試劑或與所述第一核苷酸序列互補(bǔ)的置換核酸分子；所述酶切試劑包括酶解反應(yīng)液和酶解反應(yīng)終止液優(yōu)選地所述第一核苷酸序列具有序列表SEQ ID NO.1所示的序列；所述第二核苷酸序列具有序列表SEQ ID NO. 2所示的序列。
所述置換核酸分子為具有序列表SEQ ID NO. 5所示序列的DNA序列或所述置換核酸分子為具有序列表SEQ ID NO. 6所示序列的肽核酸。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明在生物樣品中待檢物的免疫PCR檢測(cè)過(guò)程中采用DNA雜交、復(fù)合物轉(zhuǎn)移技術(shù)，通過(guò)將雜交的單鏈DNA片段釋放出來(lái)，而非特異性結(jié)合的單鏈DNA片段依舊留著原有支持物上，顯著降低了實(shí)驗(yàn)背景，大幅提高了人Y干擾素檢測(cè)的靈敏度， 傳統(tǒng)ELISA方法最低檢測(cè)限量一般在5pg/mL左右，線(xiàn)性范圍l(Tl000pg/mL，而本發(fā)明方法和試劑盒的最低檢測(cè)量可達(dá)到O. 01pg/mL，線(xiàn)性范圍更寬，在O. 05 1000pg/mL之間。
優(yōu)選的第一核苷酸序列和第二核苷酸序列在實(shí)踐中表現(xiàn)出優(yōu)良的抗干擾性能，能夠進(jìn)一步提聞檢測(cè)的準(zhǔn)確性。
優(yōu)選方案所采用特定的置換核酸分子，能夠有利于第二核苷酸序列與置換核酸分子的置換，同時(shí)減少或去除非特異性結(jié)合物的洗脫。


圖1是本發(fā)明具體實(shí)施例的方法在雜交步驟所形成的復(fù)合物的結(jié)構(gòu)原理圖；圖2是采用本發(fā)明具體實(shí)施例的人Y干擾素實(shí)時(shí)定量PCR分析結(jié)果的典型示例；圖3是本發(fā)明具體實(shí)施例的免疫PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)；圖4是現(xiàn)有技術(shù)的傳統(tǒng)ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。
具體實(shí)施方式
下面對(duì)照附圖并結(jié)合優(yōu)選的實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。
一種生物樣品中待檢物的夾心免疫PCR檢測(cè)方法，主要包括以下步驟1.在支持物上連接一個(gè)待檢物的抗體或受體，稱(chēng)為第一抗體或受體的固定，支持物優(yōu)選采用固相支持物；2.第一抗體特異性捕捉待檢物使待檢物通過(guò)一個(gè)連接位點(diǎn)結(jié)合到第一抗體或受體上；3.將第二抗體或受體連接到待檢物的另一個(gè)位點(diǎn)上，此處第二抗體或受體已標(biāo)記特定的一小段核苷酸序列(第一核苷酸序列)；其中，本實(shí)施例的標(biāo)記特定一小段核苷酸序列的第二抗體或受體為第二抗體偶聯(lián)寡核苷酸，該寡核苷酸序列為序列表SEQ ID NO.1所示的序列5 ' -aagctcgatatcagaggaaggaggagggac-3 ' 0
4.將具有與前述一小段核苷酸序列互補(bǔ)序列的一長(zhǎng)段核苷酸(第二核苷酸序列， 即模板DNA分子)雜交結(jié)合到第二受體復(fù)合物(步驟3的產(chǎn)物)上；參見(jiàn)序列表SEQ ID NO. 2 所示的序列，本實(shí)施例的模板DNA分子為單鏈DNA片段5 ' -tccttcctctgatatcgagcttggc gtaatcagggtcatagctgtttcctgtgtgaaattgttatccgctcacaattccacacaacatacgagccggaagcataaagtgtaaagcctgaagtgcctaatgagtg-3 } 0
5)采用置換或酶切核酸的方法從所述支持物上洗脫所述第二核苷酸序列并轉(zhuǎn)移到PCR管中；若采用酶切核酸的方法，所述第一核苷酸序列和所述第二核苷酸序列中均包含限制性酶切位點(diǎn)，例如圖示為EcoRV酶切位點(diǎn)，然后利用限制性?xún)?nèi)切酶如EcoR V,Alu I， EcoR I, Not I，Hind III等，但不限于這些酶來(lái)消化雙鏈的橋鏈，進(jìn)行酶切反應(yīng)從而洗脫第二核苷酸序列；若采用置換核酸的方式，則需采用與所述第一核苷酸序列互補(bǔ)的置換核酸分子與所述第二核苷酸序列進(jìn)行置換，所述置換核酸分子為具有序列表SEQ ID NO. 5所示序列的DNA序列或所述置換核酸分子為具有序列表SEQ ID NO. 6所示序列的肽核酸(PNA)， 序列表 SEQ ID NO. 5 所不序列為5 ' -gtccctcctccttcctctgatatcgagctt-3 ',序列表 SEQ ID NO. 6 所不序列為5 ' -tccttcctctgatatcgagctt _3 '。
6)通過(guò)定量PCR檢測(cè)核酸序列分子，顯示樣品中待檢測(cè)物質(zhì)的存在。
本實(shí)施例還基于上述方法提供一種PCR檢測(cè)試劑盒，其包括支持物，優(yōu)選固相支持物，“固相支持物”是指可用于固定，例如分析物、抗體或一個(gè)復(fù)合物的任何固相載體。此領(lǐng)域眾所周知的合適固相載體，其包括反應(yīng)槽的孔壁，如微孔板、 試管、聚苯乙烯珠、順磁性或無(wú)磁性的珠子、硝化纖維膜、尼龍膜；微粒如乳膠粒、羊(或其他動(dòng)物)的紅血細(xì)胞等。固相載體的典型材料包括聚氯乙烯(PVC)、聚苯乙烯、纖維素、尼龍、 乳膠及其衍生物，但不僅限于這些。
待檢物的第一抗體或受體； 待檢物的第二抗體或受體，該第二抗體或受體已標(biāo)記特定的一小段核苷酸序列；本實(shí)施例采用第二抗體偶聯(lián)寡核苷酸的形式，該寡核苷酸序列為序列表SEQ ID NO.1所示的序列5 ' -aagctcgatatcagaggaaggaggagggac-3 '。
單鏈DNA片段(模板DNA分子)，該單鏈DNA片段具有與所述第一核苷酸具有互補(bǔ)的核苷酸序列。如序列表SEQ ID NO. 2所示,所述單鏈DNA片段為5 ; -tccttcctctgatat cgagcttggcgtaatcagggtcatagctgtttcctgtgtgaaattgttatccgctcacaattccacacaacatacgagccggaagcataaagtgtaaagcctgaagtgcctaatgagtg-3 '酶切試劑或與所述第一核苷酸序列互補(bǔ)的置換核酸分子，其中所述酶切試劑包括酶解反應(yīng)液和酶解反應(yīng)終止液，本發(fā)明的酶解反應(yīng)液可采用現(xiàn)有通用的酶解反應(yīng)液，其組分例如0. lmol/L pH7. 4 Tirs-HCl，lmol/L NaCl，0. 07mol/L MgCl2 ； 本發(fā)明的酶解反應(yīng)終止液也可采用現(xiàn)有通用的酶解反應(yīng)終止液，例如以下兩種組分的酶解反應(yīng)終止液(1)0. lmol/L EDTA Na2, 20%Ficoll 400，適量橙G。(2)O. 25%溴酚藍(lán)，O. 25%二甲苯青FF (或稱(chēng)二甲苯藍(lán))，40%蔗糖水溶液(W/V)(或用30%甘油水溶液)。
本文中所述的生物樣品通常指水劑溶液或來(lái)自生物材料的水重懸液。本發(fā)明分析的樣品，是以物質(zhì)的形式存在，包括細(xì)胞、組織、組織均漿、溶胞產(chǎn)物、提取物、純化的或部分純化的蛋白及其他的一些生物分子混合物。本發(fā)明的方法中的生物樣品的非限制性例子,包括人和動(dòng)物的體液如全血、血清、血漿、尿液、腦脊液等。本文中所述的待檢物可能由蛋白、肽鏈、碳水化合物、脂質(zhì)、細(xì)胞或者抗原物質(zhì)組成。本實(shí)施例以人Y干擾素為例進(jìn)行說(shuō)明，但本發(fā)明不局限于該具體物質(zhì)。
其中，上述第二抗體偶聯(lián)寡核苷酸的制備步驟如下1.氨基標(biāo)記核苷酸鏈的全基因合成5' -aagctcgatatcagaggaaggaggagggac-3 ' (NH2C7)i1.用過(guò)量硫代琥珀酰亞胺，4甲?；?N-異丙基苯甲酰胺(Sulf0-s-4FB)修飾3’端胺基標(biāo)記寡核苷酸1. 10 0D260的寡核苷酸重懸于IOOPL溶解液中，用200的槍頭反復(fù)吸30次，直至全部溶解。渦旋震蕩60秒，1，000 X g離心10秒收集離心液。
2.檢測(cè)胺基修飾寡核苷酸的濃度。
3.用 25 微升 DMF ( Dimethyl Fumarate，即富馬酸二甲酯)溶解 Sulfo-S_4FB (I X 1.5 mg)，并將其添加到收集寡核苷酸的離心管中，漩渦混勻1000 X g離心10秒鐘，收集離心管下面的全部液體，在室溫孵育兩個(gè)小時(shí)。
4.在離心結(jié)束5分鐘前，預(yù)濕一個(gè)旋轉(zhuǎn)過(guò)濾器。緩沖液更換4FB_01igo。
5.測(cè)量 4FB_01igo 的濃度。
ii1.過(guò)量琥珀酰亞胺，聯(lián)肼尼克酰胺(S-HYNIC)修飾抗體。
1.添加100 μ L稀釋液溶解100 μ g抗Human IFN_r抗體,1，000 x g離心10秒收集瓶?jī)?nèi)的殘留抗體。
2.檢測(cè)抗體濃度3.用35 μ LDMF溶解一管聯(lián)肼尼克酰胺(S-HYNIC)，取2 μ L溶解的聯(lián)肼尼克酰胺到抗體溶液中，混勻。
4.用聯(lián)肼尼克酰胺(S-HYNIC)修飾抗體。
5.當(dāng)S-HYNIC修飾反應(yīng)完成以后，將HyNic/IgG反應(yīng)液添加到旋轉(zhuǎn)柱的樹(shù)脂床上面，擰松旋轉(zhuǎn)柱蓋子，使旋轉(zhuǎn)柱子上的標(biāo)記背離離心機(jī)轉(zhuǎn)軸，1，500 X離心2分鐘。
6.將HyNic-修飾的IgG轉(zhuǎn)移到1. 5mL的離心管中，并檢測(cè)其含量。
本實(shí)施例的檢測(cè)試劑盒的使用方法如下(一)待檢物(本實(shí)施例為人Y干擾素)雙抗體夾心的形成1.用磷酸鹽緩沖液(Phosphate Buffered Saline,縮略詞PBS)稀釋包被抗體(第一抗體)，100μ L/well加入酶標(biāo)板孔(固相支持物)中，4°C過(guò)夜。
i1.用PBS-T (含0. 05%的吐溫20的PBS緩沖液)洗板3-5次。
ii1.加封閉液(含 1%BSA) 200 μ L/well, 37°C 2 小時(shí)。
iv.用PBS-T (含0. 05%的吐溫20的PBS緩沖液)洗板3-5次。
V.加入人Y干擾素陽(yáng)性標(biāo)本100μ L/well，37°C Γ3小時(shí)，本實(shí)施例選2小時(shí)。
v1.用PBS-T (含0. 05%的吐溫20的PBS緩沖液)洗板3-5次。
vi1.加入第二抗體偶聯(lián)寡核苷酸，37°C f 3小時(shí)，本實(shí)施例選2小時(shí)。
vii1.用PBS-T (0. 05%的吐溫20)洗板3-5次，Y干擾素雙抗體夾心的完成。
(二)核苷酸雜交把模板DNA分子(5X IO11c0Pies/μ L)溶解到雜交液中，加入酶標(biāo)孔內(nèi)與第二抗體偶聯(lián)寡核苷酸雜交，37°C孵育Γ2小時(shí)，本實(shí)施例孵育I小時(shí)，雜交后沖洗未結(jié)合的。雜交后的產(chǎn)物結(jié)構(gòu)如圖1所示，其中100為固相支持物；200為第一抗體或受體；300為抗原(即人 Y干擾素);400為第二抗體或受體；500為寡核苷酸；600為酶切位點(diǎn)或置換位置；700為模板DNA分子。
(三)酶切與轉(zhuǎn)移或置換與轉(zhuǎn)移加入酶解反應(yīng)液，37度水浴中，酶解Γ3小時(shí)，本實(shí)施例酶解3小時(shí)。
加入5 10 μ L酶反應(yīng)終止液,本實(shí)施例添加量為10 μ L,混勻以停止酶反應(yīng)。
取I 10 μ L轉(zhuǎn)移到PCR管中，PCR反應(yīng)可采用現(xiàn)有通用的技術(shù)，本實(shí)施例PCR反應(yīng)采用的組分包括PCR Master Mix (包括10XPCR緩沖液，MgCl2, dNTP，DNA聚合酶，SYBR Green I 等)12·5μ ,0·5μ 上游引物 5 ; - gcttggcgtaatcagggtca t_3 ;(參見(jiàn)序列表 SEQ ID NO. 3)、O. 5 μ L 下游引物 5 1 - cactcattag gcacttcagg cttt _3 1 (參見(jiàn)序列表SEQ ID NO. 4)，用滅菌超純水補(bǔ)足25 μ L。
酶切方法可采用置換核酸的方法替換，即需采用與所述第一核苷酸序列互補(bǔ)的置換核酸分子與所述第二核苷酸序列進(jìn)行置換，所述置換核酸分子為具有序列表SEQ ID NO. 5所示序列的DNA序列或所述置換核酸分子為具有序列表SEQ ID NO. 6所示序列的肽核酸。
(四)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)取酶切液為模板進(jìn)行定量PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)參數(shù)94°C預(yù)變性 5分鐘；94°C變性 30秒；58°C退火30秒；72°C延伸20秒；35個(gè)循環(huán)；72°C延伸5分鐘。定量PCR分析，得到待測(cè)標(biāo)本中人Y干擾素的含量，定量PCR分析的典型結(jié)果如圖示2。
本實(shí)施例的寡核苷酸序列、單鏈DNA片段、置換核酸分子也可用其他核苷酸序列代替，但本實(shí)施例所選用的寡核苷酸序列、單鏈DNA片段及置換核酸分子具有非常好的抗干擾性能，可提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性。
如圖3、4所示，本實(shí)施例的免疫PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)線(xiàn)性關(guān)系Λ Ct =5. 5714Χ log (conc. )+13. 381，R2=O. 997 ;檢測(cè)范圍 O. 05 1000pg/mL，靈敏度達(dá)到 0. Olpg/ mL。而傳統(tǒng)ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)y=0. 0017x + O. 0975，R2 = O. 997 ;檢測(cè)范圍 15. 6 1000pg/mL， 靈敏度達(dá)到5pg/mL。
以上內(nèi)容是結(jié)合具體的優(yōu)選實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明所作 的進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，不能認(rèn)定本發(fā)明的具體實(shí)施只局限于這些說(shuō)明。對(duì)于本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干等同替代或明顯變型，而且性能或用途相同，都應(yīng)當(dāng)視為屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種生物樣品中待檢物的夾心免疫PCR檢測(cè)方法，其特征在于，包括以下步驟 1)第一抗體或受體的固定在支持物上連接生物樣品中待檢物的第一抗體或受體； 2)特異性捕捉生物樣品使生物樣品中的待檢物通過(guò)一個(gè)連接位點(diǎn)與所述第一抗體或受體結(jié)合； 3)連接第二抗體或受體將待檢物的第二抗體或受體連接到所述待檢物的另一個(gè)連接位點(diǎn)上，其中，所述第二抗體或受體標(biāo)記有第一核苷酸序列； 4)雜交將與所述第一核苷酸序列具有互補(bǔ)的第二核苷酸序列與所述第一核苷酸序列雜交； 5)轉(zhuǎn)移采用置換或酶切核酸的方法從所述支持物上洗脫所述第二核苷酸序列并轉(zhuǎn)移到PCR管中； 6)檢測(cè)定量PCR檢測(cè)所述PCR管中第二核苷酸序列的含量，該含量反應(yīng)了所述生物樣品中待檢物的含量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物樣品中待檢物的夾心免疫PCR檢測(cè)方法，其特征在于， 所述第一核苷酸序列具有序列表SEQ ID NO.1所示的序列； 所述第二核苷酸序列具有序列表SEQ ID NO. 2所示的序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的生物樣品中待檢物的夾心免疫PCR檢測(cè)方法，其特征在于，所述步驟5)中采用置換核酸方法從所述支持物上洗脫所述第二核苷酸序列包括采用與所述第一核苷酸序列互補(bǔ)的置換核酸分子與所述第二核苷酸序列進(jìn)行置換，所述置換核酸分子為具有序列表SEQ ID NO. 5所不序列的DNA序列或所述置換核酸分子為具有序列表SEQ ID NO. 6所示序列的肽核酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物樣品中待檢物的夾心免疫PCR檢測(cè)方法，其特征在于，所述第一核苷酸序列和所述第二核苷酸序列中均包含酶切位點(diǎn)，所述步驟5)中采用酶切核酸方法從所述支持物上洗脫所述第二核苷酸序列采用限制性?xún)?nèi)切酶進(jìn)行洗脫。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物樣品中待檢物的夾心免疫PCR檢測(cè)方法，其特征在于所述待檢物為人Y干擾素。
6.—種生物樣品中待檢物的夾心免疫PCR檢測(cè)試劑盒，其特征在于包括 支持物； 待檢物的第一抗體或受體； 待檢物的第二抗體或受體，該第二抗體或受體標(biāo)記有第一核苷酸序列； 單鏈DNA片段，該單鏈DNA片段具有與所述第一核苷酸具有互補(bǔ)的第二核苷酸序列； 以及酶切試劑或與所述第一核苷酸序列互補(bǔ)的置換核酸分子； 所述酶切試劑包括酶解反應(yīng)液和酶解反應(yīng)終止液。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的生物樣品中待檢物的夾心免疫PCR檢測(cè)試劑盒，其特征在于 所述第一核苷酸序列具有序列表SEQ ID NO.1所示的序列； 所述第二核苷酸序列具有序列表SEQ ID NO. 2所示的序列。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的生物樣品中待檢物的夾心免疫PCR檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述置換核酸分子為具有序列表SEQ ID NO. 5所不序列的DNA序列或所述置換核酸分子為具有序列表SEQ ID NO. 6所示序列的肽核酸。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種生物樣品中待檢物的夾心免疫PCR檢測(cè)方法和試劑盒，所述方法包括以下步驟1)第一抗體或受體的固定；2)特異性捕捉樣品中的待檢物；3)連接第二抗體或受體，其中，所述第二抗體或受體標(biāo)記有第一核苷酸序列；4)雜交將與所述第一核苷酸序列具有互補(bǔ)的第二核苷酸序列與所述第一核苷酸序列雜交；5)轉(zhuǎn)移采用酶切或置換核酸的方法，將所述第二核苷酸序列分離并轉(zhuǎn)移到PCR管中；6)檢測(cè)定量PCR檢測(cè)所述PCR管中第二核苷酸序列的含量，該含量反應(yīng)了所述待檢物的含量。所述試劑盒包含所述檢測(cè)方法所涉及的主要成分。本發(fā)明具有操作簡(jiǎn)單，檢測(cè)準(zhǔn)確性高的有益效果。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102994638SQ20121049809
公開(kāi)日2013年3月27日 申請(qǐng)日期2012年11月29日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月29日
發(fā)明者吳慶軍, 周翔, 陽(yáng)云 申請(qǐng)人:深圳市達(dá)科為生物工程有限公司