專利名稱：嗜水氣單胞菌核酸標(biāo)準(zhǔn)品的制備方法
嗜水氣單胞菌核酸標(biāo)準(zhǔn)品的制備方法技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明主要涉及海產(chǎn)品疾病檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及嗜水氣單胞菌核酸標(biāo)準(zhǔn)品的制備方法。
背景技術(shù)：
我國海域遼闊，自然條件優(yōu)越，海洋資源十分豐富。但目前開發(fā)利用的程度還很低。這也說明我國開發(fā)利用海洋資源的潛力巨大，遼寧海域是中國重要的海洋生物資源、漁業(yè)資源寶庫，其盛產(chǎn)水生動物、扇貝、貽貝、牡蠣和魚、蝦以及藻類等，帶動海洋經(jīng)濟(jì)發(fā)展。加強多邊和雙邊的海洋開發(fā)國際合作，集中集約開發(fā)利用海域及海島資源，合理配置優(yōu)勢海洋產(chǎn)業(yè)，科學(xué)高效開發(fā)海洋資源，積極開展科研與試驗、開發(fā)與利用，海水養(yǎng)殖標(biāo)準(zhǔn)化是合理開發(fā)海水養(yǎng)殖資源的重要手段，研究制定海產(chǎn)品養(yǎng)殖標(biāo)準(zhǔn)，合理開發(fā)海水灘涂養(yǎng)殖資源， 提高養(yǎng)殖海產(chǎn)品疾病是當(dāng)今養(yǎng)殖業(yè)的重點內(nèi)容。海產(chǎn)品養(yǎng)殖是一項高風(fēng)險的養(yǎng)殖業(yè)，傳統(tǒng)的小戶的海產(chǎn)品養(yǎng)殖給養(yǎng)殖戶帶來了巨大的市場和技術(shù)風(fēng)險。為了將養(yǎng)殖戶養(yǎng)殖風(fēng)險降到最低，開展對各類養(yǎng)殖業(yè)，包括魚、蝦、蟹、水生動物、鮑魚、貝類、海藻等各類海產(chǎn)品的疾病防治工作任務(wù)舉足輕重。有報道稱，霍亂弧菌、漂浮弧菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、創(chuàng)傷弧菌等有害細(xì)菌，是引起海產(chǎn)品各種疾病的罪魁禍?zhǔn)住?br> 嗜水氣單胞菌(A. hydrophila)廣泛分布于自然界的各種水體，是多種水生動物的原發(fā)性致病菌，為條件致病菌，是典型的人-獸-魚共患病病原菌。該菌是弧菌科氣單胞菌屬，為革蘭氏陰性短桿菌，極 端單鞭毛，沒有芽胞和莢膜，剛從病灶上分離的病原菌常兩個相連。在普通瓊脂平板培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)形成的菌落園形、邊緣光滑、中央凸起、肉色、灰白色或略帶淡桃紅色有光澤，發(fā)育良好。嗜水氣單胞菌在水溫14. O 40. 5°C范圍內(nèi)都可繁殖，以28. O 30. (TC為最適溫度。PH值在6 11范圍內(nèi)均可生長；最適PH值為7. 27 ;嗜水氣單胞菌可在含鹽量0%。 4%。的水生存，最適鹽度為O. 5%。。嗜水氣單胞菌可以產(chǎn)生毒性很強的外毒素，因嗜水氣單胞菌的變異菌株較多，所以要特別注意療效。發(fā)明內(nèi)容
由背景技術(shù)可見，提高嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)的檢出率,增強其檢測精度是解決多種水生動物病害問題的重要途徑。本研究采用以下技術(shù)方案實現(xiàn)嗜水氣單胞菌核酸標(biāo)準(zhǔn)品的制備其包括下述步驟
(I)增菌從嗜水氣單胞菌標(biāo)準(zhǔn)菌株接種到普通LB培養(yǎng)基中，進(jìn)行發(fā)酵，37°C培養(yǎng)12h制得發(fā)酵產(chǎn)物；將發(fā)酵產(chǎn)物再接入嗜水氣單胞菌培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵，32 37°C培養(yǎng) 24 48h，至菌懸液菌含量的終濃度為IO7 101QCfu/g ；
所述的嗜水氣單胞菌培養(yǎng)基，其配制方法如下胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化鈉IOg,葡萄糖5g,無需調(diào)節(jié)pH, 121°C下滅菌20min ;冷卻備用；
(2)洗滌將步驟(I)獲得的菌懸液重復(fù)下述操作2飛次以清洗，以1:10的體積比與PBS緩沖液充分混合，在800(Tl2000rpm條件下離心5 lOmin，收集菌體；
(3)采用CTAB法提取菌懸液DNA ;將提取的DNA用pH8. 0的TE溶液溶解，獲得基因組核酸溶液；其操作步驟參見國家海洋局908專項辦公室編，海洋生物生態(tài)調(diào)查技術(shù)規(guī)程，海洋出版社，2006、4，p23-26。于西林瓶中分裝核酸樣品；(4)冷凍干燥啟動凍干機(jī)，當(dāng)干燥室溫度降至_35°C時開啟冷卻阱；冷卻阱溫度降至_40°C時，將在_80°C預(yù)凍2h的核酸樣品放入干燥室后抽真空；待真空度降至0. 5Torr結(jié)束冷凍；并將樣品于15°C干燥，當(dāng)真空度降至0.1Torr時，取出樣品，蓋緊西林瓶獲得基因組核酸標(biāo)準(zhǔn)樣品，于-20 V中避光貯存。對于以上所述的所有技術(shù)方案中，所述的嗜水氣單胞菌標(biāo)準(zhǔn)菌株為嗜水氣單胞菌ATCC35654和/或嗜水氣單胞菌ATCC 7966 ；對于以上所述的所有技術(shù)方案中，較優(yōu)的條件如下提取的DNA用紫外分光光度計測260nm和280nm處的光密度值，當(dāng)OD260/OD280比值在1. 7 1. 9之間較佳；
本發(fā)明中，上述產(chǎn)品制備方法中，均未限定方法的其他等效條件，因其可根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)確定，也未限定所用試劑的級別，因其對結(jié)果影響小，并可以通過配制或商業(yè)途徑購買獲得，技術(shù)人員可以依據(jù)實施例中所列條件做參考依據(jù)進(jìn)行調(diào)整。這些關(guān)于制劑方式和方法的選擇，相信本領(lǐng)域技術(shù)人員可以從現(xiàn)有技術(shù)中得到充分的啟示，本發(fā)明不再贅述。本發(fā)明的優(yōu)點是適用于水生動物的疾控或檢測；本標(biāo)準(zhǔn)品的處理過程簡單，耗時少；制備成本低于傳統(tǒng)方法，本發(fā)明粉劑保存時間長，不易污染。本發(fā)明對解決水生動物養(yǎng)殖的嗜水氣單胞菌病的防治具有重要的現(xiàn)實意義。
具體實施例方式以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。實施例1嗜水氣單胞菌標(biāo)準(zhǔn)菌株選擇嗜水氣單胞菌ATCC 35654 ；(I)增菌從嗜水氣單胞菌標(biāo)準(zhǔn)菌株接種到LB培養(yǎng)基中，進(jìn)行發(fā)酵，37°C培養(yǎng)12h制得發(fā)酵產(chǎn)物；將發(fā)酵產(chǎn)物再接入嗜水氣單胞菌培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵，37°C培養(yǎng)48h，至菌懸液菌含量的終濃度為109cfu/g ；所述的嗜水氣單胞菌培養(yǎng)基配制方法胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化鈉10g，葡萄糖5g,無需調(diào)節(jié)pH, 121°C下滅菌20min ；(2)洗滌將步驟(I)獲得的菌懸液重復(fù)下述清洗操作3次，以1:10的體積比與PBS緩沖液充分混合,在12000rpm條件下離心5min,收集菌體；(3 )采用CTAB法提取菌懸液DNA取菌體加pH8. 0的TE懸浮，加0. 5mL濃度為100g/L SDS和30 y L濃度為30mg/mL的蛋白酶K，混勻，37°C溫浴Ih ;加2mL濃度為5mol/L NaCl，混勻，加1. 5mL CTAB-NaCl混合溶液，混勻，65°C溫浴 20min ;其中，CTAB-NaCl 混合溶液為 100g/L CTAB 和 0. 7mol/L NaCl ；取上清，加與上清等體積的酚-氯仿-異戊醇混合液，混勻，6000g離心IOmin ;其中，酚-氯仿-異戊醇混合液中酚氯仿異戊醇的體積比為25 24 1 ;取上清，加與上清等體積的氯仿-異戍醇混合液，混勻，6000g離心IOmin ;其中，氯仿-異戍醇混合液中氯仿異戍醇的體積比為24 1 ;取上清，加上清0. 6倍體積的異丙醇，混勻，13000g離心IOmin ;取沉淀，用70%こ醇清洗2次，干燥，將提取的DNA用pH8. 0的TE溶液溶解，提取的樣品DNA用紫外分光光度計測260nm和280nm處的光密度值，取OD26(l/OD28(l比值在1. 8之間的樣品DNA于西林瓶中分裝核酸樣品；(4)冷凍干燥啟動凍干機(jī)，當(dāng)干燥室溫度降至_35°C時開啟冷卻阱；冷卻阱溫度降至_40°C時，將在_80°C預(yù)凍2h的核酸樣品放入干燥室后抽真空；待真空度降至0. 5Torr結(jié)束冷凍；并將樣品于15°C干燥，當(dāng)真空度降至0.1Torr時，取出樣品，蓋緊西林瓶獲得基因組核酸標(biāo)準(zhǔn)樣品，于-20 V中避光貯存。實施例2嗜水氣單胞菌標(biāo)準(zhǔn)菌株選擇嗜水氣單胞菌ATCC 7966 ；(I)增菌從嗜水氣單胞菌標(biāo)準(zhǔn)菌株接種到LB培養(yǎng)基中，進(jìn)行發(fā)酵，37°C培養(yǎng)12h制得發(fā)酵產(chǎn)物；將發(fā)酵產(chǎn)物再接入嗜水氣單胞菌培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵，35°C培養(yǎng)48h，至菌懸液菌含量的終濃度為108cfu/g ；
所述的嗜水氣單胞菌培養(yǎng)基配制方法胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化鈉10g，葡萄糖5g,無需調(diào)節(jié)pH, 121°C下滅菌20min ；(2)洗滌將步驟(I)獲得的菌懸液重復(fù)下述清洗操作2次，以1:10的體積比與PBS緩沖液充分混合,在12000rpm條件下離心IOmin,棄上清,收集菌體；(3 )采用CTAB法提取菌懸液DNA 取菌體加pH8. 0的TE懸浮，加0. 5mL濃度為100g/L SDS和30 y L濃度為30mg/mL的蛋白酶K，混勻，37°C溫浴Ih ;加2mL濃度為5mol/LNaCl，混勻，加1. 5mL CTAB-NaCl混合溶液，混勻，65°C溫浴 20min ;其中，CTAB-NaCl 混合溶液為 100g/L CTAB 和 0. 7mol/L NaCl ；取上清，加與上清等體積的酚-氯仿-異戊醇混合液，混勻，6000g離心IOmin ;其中，酚-氯仿-異戊醇混合液中酚氯仿異戊醇的體積比為25 24 1 ;取上清，加與上清等體積的氯仿-異戍醇混合液，混勻，6000g離心IOmin ;其中，氯仿-異戍醇混合液中氯仿異戍醇的體積比為24 1 ;取上清，加上清0. 6倍體積的異丙醇，混勻，13000g離心IOmin ;取沉淀，用70%乙醇清洗2次，干燥，將提取的DNA用pH8. 0的TE溶液溶解，提取的樣品DNA用紫外分光光度計測260nm和280nm處的光密度值，取0D26(l/0D28(l比值在1. 8之間的樣品DNA于西林瓶中分裝核酸樣品；(4)冷凍干燥啟動凍干機(jī)，當(dāng)干燥室溫度降至_35°C時開啟冷卻阱；冷卻阱溫度降至_40°C時，將在_80°C預(yù)凍2h的核酸樣品放入干燥室后抽真空；待真空度降至0. 5Torr結(jié)束冷凍；并將樣品于15°C干燥，當(dāng)真空度降至0.1Torr時，取出樣品，蓋緊西林瓶獲得基因組核酸標(biāo)準(zhǔn)樣品，于-20 V中避光貯存。利用本發(fā)明實施例f 2所述方法制得的嗜水氣單胞菌核酸標(biāo)準(zhǔn)品，適用于水生動物的疾病預(yù)防；制備成本低，保存時間長，無污染。對解決大批量水生動物養(yǎng)殖的嗜水氣單胞菌的防治具有重要的現(xiàn)實意義。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明技術(shù)原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種嗜水氣單胞菌核酸標(biāo)準(zhǔn)品的制備方法，其特征在于，其包括下述步驟 (1)增菌從嗜水氣單胞菌標(biāo)準(zhǔn)菌株接種到LB培養(yǎng)基中，進(jìn)行發(fā)酵，37°C培養(yǎng)12h制得發(fā)酵產(chǎn)物；將發(fā)酵產(chǎn)物再接入嗜水氣單胞菌培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵，32 37°C培養(yǎng)24 48h，至菌懸液菌含量的終濃度為IO7 101(lCfu/g ； 所述的嗜水氣單胞菌培養(yǎng)基配制方法胰蛋白胨IOg,酵母提取物5g,氯化鈉IOg,葡萄糖5g,無需調(diào)節(jié)pH, 121°C下滅菌20min ； (2)洗滌將步驟(I)獲得的菌懸液重復(fù)下述清洗操作2飛次，以1:10的體積比與PBS緩沖液充分混合，在8000 12000rpm條件下離心5"l0min,收集菌體； (3)采用CTAB法提取菌懸液DNA，將提取的DNA用pH8.O的TE溶液溶解，于西林瓶中分裝核酸樣品； (4)冷凍干燥啟動凍干機(jī)，當(dāng)干燥室溫度降至-35°C時開啟冷卻阱；冷卻阱溫度降至-40°C時，將在_80°C預(yù)凍2h的核酸樣品放入干燥室后抽真空；待真空度降至O. 5Torr結(jié)束冷凍；并將樣品于15°C干燥，當(dāng)真空度降至O.1Torr時，取出樣品，蓋緊西林瓶獲得基因組核酸標(biāo)準(zhǔn)樣品，于-20 V中避光貯存。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的嗜水氣單胞菌標(biāo)準(zhǔn)菌株為嗜水氣單胞菌ATCC 35654和/或嗜水氣單胞菌ATCC 7966。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，提取的樣品DNA用紫外分光光度計測260nm和280nm處的光密度值，取0D26(l/0D28(l比值在1. 7 1. 9之間的樣品DNA備用。
全文摘要
本發(fā)明公開一種嗜水氣單胞菌核酸標(biāo)準(zhǔn)品的制備方法，其通過將提取的嗜水氣單胞菌ATCC35654和/或ATCC 7966的基因組核酸經(jīng)冷凍干燥后獲得，其中所述的冷凍干燥條件為啟動凍干機(jī)，當(dāng)干燥室溫度降至-35℃時開啟冷卻阱；冷卻阱溫度降至-40℃時，將在-80℃預(yù)凍2h的核酸樣品放入干燥室后抽真空；待真空度降至0.5Torr結(jié)束冷凍；并將樣品于15℃干燥，當(dāng)真空度降至0.1Torr時，取出樣品，蓋緊西林瓶獲得基因組核酸標(biāo)準(zhǔn)樣品，于-20℃中避光貯存。本發(fā)明產(chǎn)品適用于水生動物的疾病預(yù)防；制備成本低，保存時間長，無污染。對解決大批量水生動物養(yǎng)殖的嗜水氣單胞菌的防治具有重要的現(xiàn)實意義。
文檔編號C12N15/10GK103013979SQ20121050122
公開日2013年4月3日 申請日期2012年11月29日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月29日
發(fā)明者王忠舉 申請人:王忠舉