促進(jìn)微藻生長的基因及促進(jìn)微藻生長的方法
【專利摘要】本案提供促進(jìn)微藻生長的基因及促進(jìn)微藻生長的方法。更具體地，本案提供促進(jìn)微藻生長的新穎核苷酸序列，選自SEQ?ID?NO.1、SEQ?ID?NO.2、SEQ?ID?NO.3、及前述一種以上的組合，以及包含該核苷酸序列的表達(dá)載體與包含該表達(dá)載體的微藻。
【專利說明】促進(jìn)微藻生長的基因及促進(jìn)微藻生長的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明關(guān)于一種促進(jìn)微藻生長的核苷酸序列，以及包含該核苷酸序列的表達(dá)載體與包含該表達(dá)載體的微藻。
【背景技術(shù)】
[0002]為了抑制全球暖化的問題，世界各國無不積極投入溫室氣體減量之相關(guān)議題。在生質(zhì)能源的料源中，微藻類能將二氧化碳吸收固定，并將太陽能轉(zhuǎn)換成化學(xué)能，微藻的生物量，除了含有油或淀粉可被用來制造或轉(zhuǎn)化為生物燃料之外，也含有高附加價(jià)值的產(chǎn)物，例如長鏈未飽和脂肪酸、天然色素以及維他命等。相較于植物，微藻具有高光合效率、較短的生長周期且生長速率快等特性，并且生長環(huán)境不受地域之影響。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]為了進(jìn)一步提升微藻的生產(chǎn)力及縮短生產(chǎn)時(shí)程以提高微藻的產(chǎn)業(yè)利用性，發(fā)明人等積極地研究促進(jìn)微藻生長的相關(guān)基因群及其特性，進(jìn)而完成本案發(fā)明。
[0004]本發(fā)明一實(shí)施形態(tài)，提供一種促進(jìn)微藻生長的核苷酸序列，選自由下列所述核苷酸序列所組成的群組:SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3、及前述一種以上的組合。
[0005]本發(fā)明另一實(shí)施形態(tài)，提供一種表達(dá)載體，包括SEQ ID N0.K SEQ ID N0.2、SEQID N0.3、或前述一種以上的組合的促進(jìn)微藻生長的核苷酸序列，以及與前述核苷酸序列操作性連結(jié)(operable linked)的啟動(dòng)子。
[0006]本發(fā)明的另一實(shí)施形態(tài)，提供一種轉(zhuǎn)基因微藻，包含上述的表達(dá)載體。
[0007]本發(fā)明的再一實(shí)施形態(tài)，提供一種促進(jìn)微藻生長的方法，包括將上述表達(dá)載體轉(zhuǎn)基因于微藻中，以及培養(yǎng)該微藻使該表達(dá)載體表達(dá)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0008]圖1為本發(fā)明一實(shí)施型態(tài)之質(zhì)粒示意圖。
[0009]圖2顯示含ictB、AtHSDl及VHb的轉(zhuǎn)基因微藻各別的基因表達(dá)(Λ Ct)。
[0010]圖3顯示含ictB、AtHSDl、VHb的轉(zhuǎn)基因微藻及野生型綠藻各別的有效量子產(chǎn)率。
[0011]圖4顯示含ictB、AtHSDl、VHb的轉(zhuǎn)基因微藻及野生型綠藻各別的電子傳遞速率。
【具體實(shí)施方式】
[0012]本發(fā)明一實(shí)施形態(tài)，提供新穎的核苷酸序列，包括SEQ ID N0.K SEQ ID N0.2及SEQ ID N0.3。本發(fā)明所述的核苷酸序列分別來自已知的細(xì)菌性血紅蛋白(Vitreoscillahemoglobin; VHb) (SEQ ID N0.16)、果糖-1，6/景天庚酮糖-1，7-二憐酸酶(fructose-1, 6/sedoheptulose-1, 7-bisphosphatase; ictB) (SEQ ID N0.17)、及羥基類固醇脫氧酶基因(hydroxysteroid dehydrogenase gene;AtHSDl)(SEQ ID N0.18)的核苷酸序列。已知細(xì)菌性血紅蛋白(VHb)及果糖-1,6/景天庚酮糖-1，7-二磷酸酶(ictB)在植物中可提升氧氣的代謝速率、促進(jìn)光合效率(Hoy A J, Robinson H, Kakar S, SmaggheJB, Hargrove S.2007.Plant Hemoglobins:A Molecular Fossil Recordfor the Evolutionof Oxygen Transport.Journal of Molecular Biology371, 168-179.;MiyagawaY,Tamoi M, Shigeoka S2001.0verexpression of cyanobacterial fructose-1, 6/sedoheptulose-1, 7—bisphosphate phosphatase in tobacco enhances photosynthesisand growth.Nature Biotechl9, 965-969.),羥基類固醇脫氧酶基因(AtHSDl)可提升植物的生物質(zhì)量及種子產(chǎn)率(Li F., Asami T., Wu X.z., Tsang ff.T.and Cutler J.2007.APutative Hydroxysteroid Dehydrogenase Involved in Regulating Plant Growth andDevelopment.PlantPhysiologyl45:87-97.)。然而，這些蛋白并未存在于微藻體內(nèi)。
[0013]為了促進(jìn)微藻生長，發(fā)明人等基于小球藻(Chlorella)的遺傳密碼，將上述核苷酸序列優(yōu)化編碼，得到適合于微藻體內(nèi)表達(dá)的核苷酸序列，即本案SEQ ID NOs.1~3.[0014]經(jīng)優(yōu)化編碼的核苷酸序列SEQ ID N0.1表達(dá)細(xì)菌性血紅蛋白(VHb)，如SEQ IDN0.19所示的氨基酸序列。核苷酸序列SEQ ID N0.2表達(dá)果糖-1，6/景天庚酮糖-1，7- 二磷酸酶(ictB)，如SEQ ID N0.20所示的氨基酸序列。核苷酸序列SEQ ID N0.3表達(dá)羥基類固醇脫氫酶基因(AtHSDl)，如SEQ ID N0.21所示的氨基酸序列。
[0015]根據(jù)本發(fā)明所揭示的核苷酸序列，經(jīng)過適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體轉(zhuǎn)基因到微藻體內(nèi)而表現(xiàn)時(shí)，可有效地促進(jìn)微藻的生長。
[0016]本發(fā)明的另一實(shí)施形態(tài)，提供包含上述促進(jìn)微藻生長的表達(dá)載體。本發(fā)明所述的表達(dá)載體，除了包括上述的核苷酸序列以外，可還包含與該核苷酸序列操作性連結(jié)(operable linked)的啟動(dòng)子(promoter)、與該核苷酸序列及該啟動(dòng)子構(gòu)成表達(dá)盒(expression cassette)的篩選標(biāo)記、以及位于該表達(dá)盒兩側(cè)的同源重組DNA片段(homologous recombinant DNA fragment)。
[0017]本發(fā)明所述的啟動(dòng)子為基因表達(dá)時(shí)容許RNA聚合酶連接的核苷酸序列，是轉(zhuǎn)錄作用(transcription)的開始。本案的啟動(dòng)子設(shè)計(jì)，可考量欲表達(dá)的核苷酸序列及表達(dá)載體的性質(zhì)，采用單啟動(dòng)子、雙啟動(dòng)子或多啟動(dòng)子的模式，以提高欲表達(dá)基因的表達(dá)量。在本發(fā)明中，可使用的啟動(dòng)子包括psbA、腺嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶(AMT)啟動(dòng)子、花椰菜葉病毒(CaMV) 35S啟動(dòng)子、1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶小單位(RBCs)啟動(dòng)子、SV40、或前述的組合，但不限于此。
[0018]本發(fā)明所述的篩選標(biāo)記包括用于特定基因的克隆及報(bào)導(dǎo)的基因，例如卡那霉素(Kanamycin)抗生素基因、遺傳霉素(Geneticin)抗生素基因、氨節(jié)青霉素(Ampicillin)抗生素基因、博萊霉素抗生素基因(Zeocin)、潮霉素抗生素基因(Hygromycin)、編碼紅色熒光蛋白(DsRed)基因、編碼增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)基因、編碼藍(lán)色熒光蛋白(BFP)基因、或類似的基因。篩選標(biāo)記可根據(jù)表達(dá)載體的特性及克隆的基因性質(zhì)適當(dāng)設(shè)計(jì)，沒有特別的限制。
[0019]本發(fā)明所述的表達(dá)盒至少由上述的核苷酸序列、啟動(dòng)子、篩選標(biāo)記所構(gòu)成，以表達(dá)本案所述促進(jìn)微藻生長的核苷酸序列。但表達(dá)盒也可視需要地包含可讀框(open readingframe)、上述核苷酸序列表達(dá)所需的核苷酸序列、或轉(zhuǎn)化于宿主細(xì)胞所需的核苷酸序列等。 [0020]本發(fā)明所述的同源重組DNA片段表示可與同源DNA序列配對進(jìn)行交換之序列片段，透過同源交換的方式，使得欲表達(dá)的核苷酸序列得以嵌入宿主細(xì)胞的遺傳物質(zhì)中而表達(dá)?？膳c植物細(xì)胞的遺傳物質(zhì)同源交換的序列，例如T-DNA序列中的左端(left border ；LB)及右端(right border ;RB),但沒有特別限定。同源重組DNA片段可根據(jù)表達(dá)載體或宿主細(xì)胞的特性等條件以習(xí)知的DNA重組技術(shù)適當(dāng)設(shè)計(jì)、合成。
[0021]為了基因的表達(dá)，本發(fā)明所述的表達(dá)載體可進(jìn)一步包括多克隆位點(diǎn)(multiplecloning site ；MCS);調(diào)控序列(regulatory sequence),例如增強(qiáng)子(enhancer);報(bào)導(dǎo)基因(reporter gene),例如編碼突光蛋白質(zhì)的核苷酸序列等。
[0022]本發(fā)明一實(shí)施例如圖1所示,此實(shí)施例所建構(gòu)的表達(dá)載體包括由欲表達(dá)的核苷酸序列、啟動(dòng)子及作為篩選標(biāo)記的遺傳霉素抗生素基因(Geneticin)所構(gòu)成的表達(dá)盒、位于表達(dá)盒兩側(cè)的同源重組DNA (LB、RB)、RNA復(fù)制起始點(diǎn)(IncW or1、pMBlori)、以及另一個(gè)篩選標(biāo)記氨芐青霉素抗生素基因(AmpK)，其中，啟動(dòng)子與欲表達(dá)的基因具有多克隆位點(diǎn)(MCS)，以克隆于該表達(dá)載體內(nèi)。
[0023]本發(fā)明另一實(shí)施形態(tài)為具有上述表達(dá)載體的轉(zhuǎn)基因微藻。由于表達(dá)載體具有上述促進(jìn)微藻生長的核苷酸序列并于轉(zhuǎn)基因微藻體中表現(xiàn)，因此可促進(jìn)該轉(zhuǎn)基因微藻的生長，提高該微藻的生產(chǎn)力。
[0024]本發(fā)明再一實(shí)施形態(tài)，提供一種促進(jìn)微藻生長的方法，包含使上述表達(dá)載體轉(zhuǎn)基因于微藻中，以及培養(yǎng)該轉(zhuǎn)基因微藻以表達(dá)上述促進(jìn)微藻生長的核苷酸序列，藉此達(dá)到促進(jìn)微藻生長的目的。將表達(dá)載體轉(zhuǎn)基因于微藻的方法，可使用電穿孔(electroporation)、轉(zhuǎn)染法(transfection)、脂轉(zhuǎn)染(Iipofection)、或類似的方法。
[0025]培養(yǎng)微藻的培養(yǎng)基組成、培養(yǎng)條件等沒有特別限制，可依轉(zhuǎn)基因微藻的生長特性來決定，例如可使用習(xí)知的TAP培養(yǎng)基、F/2培養(yǎng)基等，或者視需要改良培養(yǎng)基組成。
[0026]本案所述之“微·藻”泛指微型生物，更具體地說，包括小球藻(Chlorella sp.)、微星藻(Micractinium sp.)、群星藻(Actinastrum sp.)、空星藻(Didymogenes sp.)、杜氏藻(Dunaliella sp.)、擬球藻(Nannochloropsis sp.)、雨生血紅藻(Haematococcus sp.)、柵藻(Scenedesmussp.)、或這些藻類的組合。
[0027]本發(fā)明之具體實(shí)施詳細(xì)說明如下，然而以下的實(shí)施例僅用于進(jìn)一步揭露本發(fā)明之技術(shù)內(nèi)容，不應(yīng)藉以限制本案的發(fā)明范疇。
[0028]實(shí)施例
[0029][實(shí)施例1]質(zhì)粒的建構(gòu)及微藻的轉(zhuǎn)基因
[0030]基因的選擇與基因全合成
[0031]選取果糖-1，6/景天庚酮糖-1，7- 二磷酸酶(ictB) (SEQ ID N0.17)、血紅蛋白基因(VHb) (SEQ ID N0.16)及羥基類固醇脫氫酶基因(AtHSDl) (SEQ ID N0.18)，以小球藻(Chlorella)常用的遺傳密碼為主，進(jìn)行基因全編碼，得到相同于小球藻(Chlorella)的氨基酸序列，以增加ictB、VHb及AtHSDl基因于藻類中之辨識度。
[0032]基因全編碼合成具體實(shí)施方法，分別根據(jù)VHb、ictB、AtHSDl的基因序列利用剪接重疊延伸聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Splicing by overlapping extension polymerase chainreaction, S0E-PCR)的方式，每次分段各合成長度50個(gè)核苷酸的引物，再將前20個(gè)核酸與前段重迭，后20個(gè)核酸與后段重迭，重復(fù)此步驟數(shù)次，最終分別利用合成整段的VHb、ictB、AtHSDl 基因(SEQ ID NO s.1~3)的順向與反向引物(VHb, SEQ ID N0.10-11) (ictB, SEQ IDN0.12-13) (AtHSDl, SEQ ID N0.14-15)，進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，利用DNA體外擴(kuò)增技術(shù)，在體外利用模板DNA、特定的寡聚核苷酸引物和DNA聚合酶，通過DNA變性、復(fù)性和延伸過程合成一條互補(bǔ)的DNA鏈。反復(fù)重復(fù)這一過程，模板DNA就可得到大量擴(kuò)增，即可將全長的基因全部包含在內(nèi)，完成ictB、VHb及AtHSDl等基因全合成。
[0033]質(zhì)粒的律構(gòu)
[0034]取卡那霉素(Kanamycin)抗生素基因，以I~5 μ g/ml的pPIC9K (Novagen)作為模板，進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR) (PCR條件:95°C /30sec ；56°C /30sec ；72°C /lmin ;循環(huán)次數(shù) 30 次(GeneAmp PCR System9700))。
[0035]另一方面，將pUC195y g/ml與上述擴(kuò)增的卡那霉素抗生素基因2~10 μ g/ml分別與KasI限制酶(New England Biolabs, NEB) IU混合反應(yīng)6小時(shí)后，將經(jīng)KasI限制酶切割的pUC19及卡那霉素抗生素基因混合5~10分鐘，使卡那霉素抗生素基因接合至PUC19的KasI限制酶切位上。
[0036]之后，根據(jù)文獻(xiàn)(Lei Young and Qihan Dong, Two-step total gene synthesismethod, Nucleic Acids Research, 2004, Vol.32, N0.7p59)以基因合成法合成土壤桿菌屬的種(Agrobacterim sp.)的基因復(fù)制起點(diǎn)IncW ori基因2~10 μ g/ml。將IncW ori基因及上述接合卡那霉素抗生素基因的PUC19分別以DraII限制酶切割后混合，使IncW ori基因接合至上述接合卡那霉素抗生素基因的PUC19的DraII限制酶切位上。
[0037]之后將基因合成法合成腺嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶(AMT)啟動(dòng)子(2_10yg/ml)與上述pUC19質(zhì)粒5 μ g/ml與NarI限制酶混合5~10分鐘,使合成啟動(dòng)子接合至上述pUC19質(zhì)粒。
[0038]之后將基因合成法合成左端(left border;LB)或右端(right border;RB)的序列。之后，使LB或RB的序列2-10μ g與上述重組pUC195y g以IU的NdeI或AlfIII限制酶切割，使該LB或RB的序列接合至上述pUC19，`完成如圖1所示之表現(xiàn)質(zhì)粒之構(gòu)筑。
[0039]之后針對遺傳密碼子優(yōu)化基因VHb (SEQ ID N0.1)、ictB (SEQ ID N0.2)、及AtHSDl (SEQ ID N0.3)，分別利用EcoRI限切酶切割，以及下述之PCR反應(yīng)條件，完成基因過表達(dá)質(zhì)粒之構(gòu)筑。
[0040]PCR反應(yīng)溶液
【權(quán)利要求】
1.一種促進(jìn)微藻生長的核苷酸序列，其為選自由下列所述核苷酸序列所組成的群組:SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3、及前述一種以上的組合。
2.—種表達(dá)載體,包括: 促進(jìn)微藻生長的核苷酸序列，其選自由下列所述核苷酸序列所組成的群組:SEQ IDN0.1、SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3、及前述一種以上的組合；及 與前述核苷酸序列操作性連結(jié)的啟動(dòng)子。
3.如權(quán)利要求2所述的表達(dá)載體,還包括篩選標(biāo)記,與前述核苷酸序列及啟動(dòng)子構(gòu)成表達(dá)盒，以及位于上述表達(dá)盒兩側(cè)的同源重組的DNA片段。
4.如權(quán)利要求2所述的表達(dá)載體，其中該啟動(dòng)子包括psbA、腺嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶(AMT)啟動(dòng)子、花椰菜葉病毒(CaMV) 35S啟動(dòng)子、1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶小單位(RBCs)啟動(dòng)子、SV40、或前述的組合。
5.一種轉(zhuǎn)基因微藻，包括如權(quán)利要求2~4任一項(xiàng)所述的表達(dá)載體。
6.—種促進(jìn)微藻生長的方法,包括: 將一表達(dá)載體轉(zhuǎn)基因于微藻中，以及培養(yǎng)該微藻使該表達(dá)載體表達(dá)，其中，該表達(dá)載體包括選自由下列所述核苷酸序列所組成的群組中的核苷酸序列:SEQ ID N0.1、SEQ IDN0.2、SEQ ID N0.3、及前述一種以上的組合。
7.如權(quán)利要求6所述的促進(jìn)微藻生長的方法，其中，該表達(dá)載體還包括與該核苷酸序列操作性連結(jié)的啟動(dòng)子?！?br> 8.如權(quán)利要求7所述的促進(jìn)微藻生長的方法，其中，該啟動(dòng)子包括psbA、腺嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶(AMT)啟動(dòng)子、花椰菜葉病毒(CaMV) 35S啟動(dòng)子、1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶小單位(RBCs)啟動(dòng)子、SV40、或前述的組合。
9.如權(quán)利要求61任一項(xiàng)所述的促進(jìn)微藻生長的方法，其中，該表達(dá)載體還包括篩選標(biāo)記及至少兩個(gè)同源重組的DNA片段，該篩選標(biāo)記與前述核苷酸序列及啟動(dòng)子構(gòu)成表達(dá)盒，該同源重組的DNA片段位于上述表達(dá)盒的兩側(cè)。
10.如權(quán)利要求6所述的促進(jìn)微藻生長的方法,其中，該微藻包括小球藻(Chlorellasp.)、微星藻(Micractinium sp.)、群星藻(Actinastrum sp.)、空星藻(Didymogenessp.)、杜氏藻(Dunaliella sp.)、擬球藻(Nannochloropsis sp.)、雨生血紅藻(Haematococcus sp.)、棚藻(Scenedesmus sp.)。
【文檔編號】C12N1/13GK103849628SQ201210506246
【公開日】2014年6月11日 申請日期:2012年11月30日 優(yōu)先權(quán)日:2012年11月30日
【發(fā)明者】簡良榮, 謝欣如 申請人:財(cái)團(tuán)法人工業(yè)技術(shù)研究院