專利名稱：一種高純度甘油三酯型pufa的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種高純度甘油三酯型PUFA的制備方法。
背景技術(shù)：
多不飽和脂肪酸(PUFA) —般是指含有兩個(gè)或兩個(gè)以上雙鍵且碳鏈長(zhǎng)度為18 22個(gè)碳原子的直鏈脂肪酸。重要的PUFA包括二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳六烯酸(DHA)、二十碳五烯酸(DPA)、花生四烯酸(AA)、十八碳四烯酸(SDA)、α -亞麻酸(ALA)、Y -亞麻酸(GLA)。PUFA因具有獨(dú)特的生物活性，已經(jīng)進(jìn)入生物制藥和營(yíng)養(yǎng)保健品領(lǐng)域。這些PUFA多來源于海產(chǎn)魚油和植物，在過去二十年中人們?cè)絹碓蕉嗟匾庾R(shí)到PUFA的缺乏與某些疾病相關(guān)，除了其潛在的制藥應(yīng)用以外，PUFA在食物源中的存在和公眾 對(duì)健康食品的重視，而使這些化合物引起消費(fèi)者的廣泛關(guān)注。PUFA產(chǎn)品按活性成分不同的存在形式可以分為非甘油酯型(主要是乙酯型和游離脂肪酸型)和甘油酯型兩種。研究表明PUFA乙酯型不是人體吸收PUFA的有效形式，PUFA乙酯型在人體中消化和吸收比較困難，而且可能存在安全隱患；游離型PUFA雖然易于消化和吸收，但是容易氧化，而且有明顯的脂肪酸味，口感差，直接作為食用難以被人們接受。甘油三酯型PUFA性質(zhì)穩(wěn)定，易被人體消化吸收，而且是PUFA的天然存在形式，因此甘油三酯型PUFA是保健品和藥品的最佳產(chǎn)品形式。本課題組的研究表明，現(xiàn)有的PUFA甘油酯產(chǎn)品的合成方法中存在嚴(yán)重的缺陷；因?yàn)槊阜磻?yīng)或者化學(xué)反應(yīng)均存在反應(yīng)平衡點(diǎn)，使得PUFA甘油酯產(chǎn)品中含有大量的甘油二酯和單甘油酯，而且PUFA的甘油二酯和單甘油酯與甘油三酯很難通過現(xiàn)有方法進(jìn)行有效分離，導(dǎo)致產(chǎn)品中PUFA甘油三酯的含量不高，這是我們所不期望的。專利CN102277237A提供了一種高純度甘油酯型魚油的制備方法，該方法利用氮?dú)獗Ｗo(hù)在180°C以上以鋅粉為催化劑催化魚油脂肪酸與甘油酯化反應(yīng)合成甘油酯，所得甘油酯中的甘油三酯含量可以達(dá)到60%以上，其他的為甘油二酯和甘油單酯。專利EP0558112提供了一種快速去除油脂中DAG的方法，在反應(yīng)體系中控制甘油和水分的含量，并且通過高速剪切攪拌的方式使得液滴的直徑均小于ΙΟΟμπι，可以將反應(yīng)時(shí)間縮短到5 30min。盡管該方法改善了酶法水解偏甘油酯的反應(yīng)速度，但由于反應(yīng)體系中需要添加相對(duì)偏甘油酯質(zhì)量100%，相對(duì)于油脂混合物質(zhì)量8%的甘油，這就為后續(xù)的分離工藝增加了負(fù)擔(dān)，而且由于大量甘油的存在，MAG難以有效去除。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)現(xiàn)有合成方法得到的PUFA甘油酯產(chǎn)品中甘油三酯純度不高的缺點(diǎn)，本發(fā)明的目的是提供一種高純度甘油三酯型PUFA的制備方法。在本發(fā)明中，通過偏甘油酯脂肪酶選擇性地將PUFA甘油酯中的DAG和MAG轉(zhuǎn)化成非甘油酯成分，產(chǎn)品經(jīng)分離回收后得到的甘油三酯型PUFA產(chǎn)品不僅保持了原有PUFA組成，而且甘油三酯的含量最高可以達(dá)到95%以上。本發(fā)明為實(shí)現(xiàn)上述目的，通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)
一種高純度甘油三酯型PUFA的制備方法，包括如下步驟(I)以脂肪酶NOVOZym435為催化劑，PUFA的酰基供體與甘油進(jìn)行反應(yīng)，然后除去催化劑和剩余的甘油，得到甘油三酯型PUFA和偏甘油酯型PUFA的混合物；(2)再經(jīng)偏甘油酯脂肪酶Lipase SMGl在不高于5°C時(shí)催化混合物中的偏甘油酯型PUFA與羥基供體進(jìn)行水解或醇解反應(yīng)；(3)分離反應(yīng)產(chǎn)物，回收油相，最后對(duì)油相進(jìn)行純化，獲得高純度的甘油三酯型PUFA0優(yōu)選地，步驟(2)所述水解或醇解反應(yīng)的溫度為(T5°C。優(yōu)選地，所述羥基供體為水或低碳鏈的一元醇。
優(yōu)選地，步驟(I)所述?；w為富含PUFA的脂肪酸或脂肪酸短鏈醇酯。所述的選擇性地催化PUFA偏甘油酯轉(zhuǎn)化成非甘油酯型PUFA所使用的偏甘油酯脂肪酶Lipase SMGl可以催化單甘油酯和甘油二酯與羥基供體發(fā)生反應(yīng)，不能催化甘油三酯反應(yīng)。分離過程可以是分子蒸餾、溶劑萃取、堿中和、也可以是一種以上上述分離方法的聯(lián)
口 ο本課題組研究發(fā)現(xiàn)，利用脂肪酶的選擇性可以將PUFA甘油酯產(chǎn)品中的甘油二酯和甘油單酯轉(zhuǎn)化成易分離的非甘油酯型PUFA，經(jīng)過分離可以提高甘油三酯的純度。但是由于PUFA與水等極性物質(zhì)在一起暴露在空氣中長(zhǎng)時(shí)間攪拌時(shí)，非常容易氧化；在真空下反應(yīng)可以隔離空氣避免氧化，但由于水等極性物質(zhì)的沸點(diǎn)較低，使得反應(yīng)不能在真空下進(jìn)行。避免PUFA氧化的另一個(gè)方法是降低反應(yīng)溫度，大量研究表明，溫度是促進(jìn)PUFA氧化的關(guān)鍵因素，降低反應(yīng)溫度可以有效避免反應(yīng)過程中PUFA的氧化。但是偏甘油酯脂肪酶需要在一定的溫度范圍內(nèi)反應(yīng)才能達(dá)到理想的催化效果，而且其催化特異性受溫度的影響非常顯著。如有研究表明，Lipase G在5°C時(shí)只能合成單甘油酯，不能催化脂肪酸合成甘油二酯。本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于其他脂肪酶Lipase SMGl在低溫下可以更有效地催化甘油二酯和單甘油酯與其他底物進(jìn)行水解或酯交換反應(yīng)。將偏甘油酯脂肪酶Lipase SMGl應(yīng)用于催化PUFA偏甘油酯與羥基供體在5°C以下進(jìn)行反應(yīng)時(shí)，可以將單甘油酯和甘油二酯完全地轉(zhuǎn)化為非甘油酯形式，同時(shí)避免PUFA氧化。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果在于(I)本發(fā)明首先合成PUFA甘油酯混合物，其中甘油三酯的含量在60%以上；然后利用偏甘油酯脂肪酶的選擇性將甘油二酯和單甘油酯轉(zhuǎn)化成非甘油酯形式，實(shí)現(xiàn)了高純度甘油三酯型PUFA產(chǎn)品的酶法合成。(2)用本發(fā)明方法制造的甘油酯三酯型PUFA產(chǎn)品中甘油三酯的含量在95 100%之間，與天然來源的PUFA甘油酯形式是一致的。(3)本方法由于使用了偏甘油酯脂肪酶在較低的溫度下選擇性地去除PUFA甘油酯中非甘油三酯組分，避免PUFA產(chǎn)品的氧化，具有更好的經(jīng)濟(jì)性和環(huán)保性。
具體實(shí)施例方式以下通過實(shí)施例更詳細(xì)地介紹本發(fā)明的實(shí)施。在所述實(shí)施例中，所有百分比均以質(zhì)量計(jì)。實(shí)施例1
在反應(yīng)容器中加入甘油100g，PUFA濃縮物IOOOg (來自金槍魚油，PUFA組成為ALA1. 6%, AA 9. 8%, EPA 7. 8%, DPA 16. 4%, DHA 50. 8%)，IOg 脂肪酶 Novozym435，20g 分子篩(除去酯化反應(yīng)生成的水分)，在50°C的恒溫磁力攪拌器中以200rpm的攪拌速度進(jìn)行酯化反應(yīng)。待反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)混合物離心或過濾分離Novozym435,離心去除未反應(yīng)的甘油，回收酯化反應(yīng)產(chǎn)物。經(jīng)液相色譜分析酯化產(chǎn)物中甘油三酯含量為69. 7%,甘油二酯含量為
11.2% ;甘油單酯含量為4. 7% ;剩余的脂肪酸為14. 4%。經(jīng)檢測(cè)，油相的過氧化值為2.1meq/Kgo在酯化產(chǎn)物中添加IOOg水，IOg偏甘油酯脂肪酶Lipase SMGl (Wang ff-f, Li T1QinX-1j Ning Ζ-χ, Yang B, Wang Y-h. Production of lipase SMGl and its applicationin synthesizing diacylglyecrol[J]. Journal of Molecular Catalysis B:Enzymatic 2012:77:87-91 )，在2°C的恒溫磁力攪拌器中以200印111的攪拌速度進(jìn)行水解反應(yīng)。待反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)混合物離心去除水相，回收水解反應(yīng)產(chǎn)物中的油相。經(jīng)檢測(cè)，油相的過氧化值為2. 3meq/Kg。在真空度為IPa，蒸發(fā)溫度為160°C的條件下用分子蒸餾分離除去水解產(chǎn)物中的游離脂肪酸，即得到PUFA甘油酯。經(jīng)液相色譜分析PUFA甘油酯中甘油三酯含量為99. 3%，甘油二酯含量為0. 69%，單甘酯和脂肪酸未檢出。經(jīng)氣相色譜分析甘油三酯的脂肪酸組成為 ALA1. 7%, AA 9. 6%, EPA 7. 9%, DPA 16. 1%，DHA 51. 2%。實(shí)施例2在反應(yīng)容器中加入甘油100g，PUFA濃縮物IOOOg(來自金槍魚油，PUFA組成為ALA
1.6%, AA 9. 8%, EPA 7. 8%, DPA 16. 4%, DHA 50. 8%)，IOg 脂肪酶 Novozym435，20g 分子篩除去反應(yīng)生成的水分，在50°C的恒溫磁力攪拌器中以200rpm的攪拌速度進(jìn)行酯化反應(yīng)。待反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)混合物離心或過濾分離Novozym435,離心去除未反應(yīng)的甘油，回收酯化反應(yīng)產(chǎn)物。經(jīng)液相色譜分析酯化產(chǎn)物中甘油三酯含量為69. 7%，甘油二酯含量為11. 2% ;甘油單酯含量為4. 7% ;剩余的脂肪酸為14. 4%。經(jīng)檢測(cè)，油相的過氧化值為2. lmeq/Kg0在酯化產(chǎn)物中添加IOOg水，IOg偏甘油酯脂肪酶Lipase SMG1，在2°C的恒溫磁力攪拌器中以200rpm的攪拌速度進(jìn)行水解反應(yīng)。待反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)混合物離心去除水相，回收水解反應(yīng)產(chǎn)物中的油相。經(jīng)檢測(cè)，油相的過氧化值為2. 2meq/Kg。水解產(chǎn)物用10%的NaOH溶液堿煉脫酸至酸價(jià)為0. 2mgK0H/g，50°C保溫沉降除去產(chǎn)生的皂，回收中性油脂；經(jīng)液相色譜分析PUFA甘油酯中甘油三酯含量為99. 4%,甘油二酯含量為0. 6%,單甘酯和脂肪酸未檢出。經(jīng)氣相色譜分析甘油三酯的脂肪酸組成為ALA 1.8%，AA 9.7%，EPA 7. 7%, DPA 16. 3%, DHA 50.8%。實(shí)施例3在反應(yīng)容器中加入甘油100g，CLA乙酯濃縮物900g (CLA含量為80. 3%)，IOg脂肪酶Novozym435,在IOOPa的真空度下,50°C的恒溫磁力攪拌器中以200rpm的攪拌速度進(jìn)行酯化反應(yīng)。待反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)混合物離心或過濾分離Novozym435,離心去除未反應(yīng)的甘油，回收酯化反應(yīng)產(chǎn)物。經(jīng)液相色譜分析酯化產(chǎn)物中甘油三酯含量為70. 5% ;甘油二酯含量為11. 5% ;甘油單酯含量為4. 4% ;剩余的脂肪酸為13. 6%。經(jīng)檢測(cè)，油相的過氧化值為
2.0meq/Kg。在酯化產(chǎn)物中添加IOOg水，IOg偏甘油酯脂肪酶Lipase SMG1，在2°C的恒溫磁力攪拌器中以200rpm的攪拌速度進(jìn)行水解反應(yīng)。待反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)混合物離心去除水相，回收水解反應(yīng)產(chǎn)物中的油相。經(jīng)檢測(cè)，油相的過氧化值為2. lmeq/Kg。水解產(chǎn)物用10%的NaOH溶液堿煉脫酸至酸價(jià)為0. 2mgK0H/g，50°C保溫沉降除去產(chǎn)生的皂，回收中性油脂；經(jīng)液相色譜分析CLA甘油酯中甘油三酯含量為99. 3%，甘油二酯含量為0. 7%，單甘酯和脂肪酸乙酯均未檢出。經(jīng)氣相色譜分析甘油三酯脂肪酸組成中CLA的含量為80. 3%。實(shí)施例4在反應(yīng)容器中加入甘油100g，PUFA濃縮物IOOOg(來自金槍魚油，PUFA組成為ALA1. 6%, AA 9. 8%, EPA 7. 8%, DPA 16. 4%, DHA 50. 8%)，IOg 脂肪酶 Novozym435，20g 分子篩除去反應(yīng)生成的水分，在50°C的恒溫磁力攪拌器中以200rpm的攪拌速度進(jìn)行酯化反應(yīng)。待反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)混合物離心或過濾分離Novozym435,離心去除未反應(yīng)的甘油，回收酯化反應(yīng)產(chǎn)物。經(jīng)液相色譜分析酯化產(chǎn)物中甘油三酯含量為69. 7%，甘油二酯含量為11. 2% ;甘油單酯含量為4. 7% ;剩余的脂肪酸為14. 4%。經(jīng)檢測(cè)，油相的過氧化值為2. lmeq/Kg。在酯化產(chǎn)物中添加IOOg水，IOg偏甘油酯脂肪酶Lipase SMG1,在I °C的恒溫磁力攪拌器中以200rpm的攪拌速度進(jìn)行水解反應(yīng)。待反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)混合物離心去除水相，回收水解反應(yīng)產(chǎn)物中的油相。經(jīng)檢測(cè)，油相的過氧化值為2. 3meq/Kg。水解產(chǎn)物用10%的NaOH溶液堿煉脫酸至酸價(jià)為O. 2mgK0H/g，50°C保溫沉降除去產(chǎn)生的皂，回收中性油脂；經(jīng)液相色譜分析PUFA甘油酯中甘油三酯含量為99. 7%，甘油二酯含量為O. 28%，單甘酯和脂肪酸未檢出。經(jīng)氣相色譜分析甘油三酯的脂肪酸組成為ALA 1.7%，AA 9.8%，EPA 7. 9%，DPA 16. 2%, DHA 50.6%。 實(shí)施例5在反應(yīng)容器中加入甘油100g，PUFA濃縮物IOOOg(來自金槍魚油，PUFA組成為ALA1.6%, AA 9. 8%, EPA 7. 8%, DPA 16.4%, DHA 50. 8%)，IOg 脂肪酶 Novozym435，20g 分子篩除去反應(yīng)生成的水分，在50°C的恒溫磁力攪拌器中以200rpm的攪拌速度進(jìn)行酯化反應(yīng)。待反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)混合物離心或過濾分離Novozym435,離心去除未反應(yīng)的甘油，回收酯化反應(yīng)產(chǎn)物。經(jīng)液相色譜分析酯化產(chǎn)物中甘油三酯含量為69. 7%，甘油二酯含量為11. 2% ;甘油單酯含量為4. 7% ;剩余的脂肪酸為14. 4%。經(jīng)檢測(cè)，油相的過氧化值為2. lmeq/Kg ο在酯化產(chǎn)物中添加IOOg乙醇，IOg偏甘油酯脂肪酶Lipase SMGI, Ig蒸餾水，在2°C的恒溫磁力攪拌器中以200rpm的攪拌速度進(jìn)行醇解反應(yīng)。待反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)混合物離心去除脂肪酶，回收水解反應(yīng)產(chǎn)物中的油相經(jīng)檢測(cè)，油相的過氧化值為1.9meq/Kg。。在真空度為IPa，蒸發(fā)溫度為160°C的條件下用分子蒸餾分離除去醇解產(chǎn)物中的非甘油酯組分，即得到PUFA甘油酯。經(jīng)液相色譜分析PUFA甘油酯中甘油三酯含量為99. 5%，甘油二酯含量為O. 47%，單甘酯和脂肪酸未檢出。經(jīng)氣相色譜分析甘油三酯的脂肪酸組成為ALA 1.8%，AA 9.8%，EPA
7.6%, DPA 16. 3%, DHA 50. 7%。對(duì)比實(shí)施例1在反應(yīng)容器中加入甘油100g，PUFA濃縮物IOOOg(來自金槍魚油，PUFA組成為ALA1.6%, AA 9. 8%, EPA 7. 8%, DPA 16. 4%, DHA 50. 8%)，IOg 脂肪酶 Novozym435，20g 分子篩除去反應(yīng)生成的水分，在50°C的恒溫磁力攪拌器中以200rpm的攪拌速度進(jìn)行酯化反應(yīng)。待反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)混合物離心或過濾分離Novozym435,離心去除未反應(yīng)的甘油，回收酯化反應(yīng)產(chǎn)物。經(jīng)液相色譜分析酯化產(chǎn)物中甘油三酯含量為69. 7%，甘油二酯含量為11. 2% ;甘油單酯含量為4. 7% ;剩余的脂肪酸為14. 4%。經(jīng)檢測(cè)，油相的過氧化值為2. lmeq/Kg。在酯化產(chǎn)物中添加IOOg水，IOg偏甘油酯脂肪酶Lipase SMG1，在30°C的恒溫磁力攪拌器中以200rpm的攪拌速度進(jìn)行水解反應(yīng)。待反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)混合物離心去除水相，回收水解反應(yīng)產(chǎn)物中的油相。經(jīng)檢測(cè)，油相的過氧化值為9. 5meq/Kg。水解產(chǎn)物用10%的NaOH溶液堿煉脫酸至酸價(jià)為O. 2mgK0H/g，50°C保溫沉降除去產(chǎn)生的皂，回收中性油脂；經(jīng)液相色譜分析PUFA甘油酯中甘油三酯含量為99. 7%，甘油二酯含量為O. 28%，單甘酯和脂肪酸未檢出。經(jīng)氣相色譜分析甘油三酯的脂肪酸組成 為ALA 1.7%，AA 9.8%，EPA 7. 9%，DPA 16. 2%，DHA50. 6%。
權(quán)利要求
1.一種高純度甘油三酯型PUFA的制備方法，其特征在于，包括如下步驟(O以脂肪酶NOVOZym435為催化劑，PUFA的?；w與甘油進(jìn)行反應(yīng)，然后除去催化劑和剩余的甘油，得到甘油三酯型PUFA和偏甘油酯型PUFA的混合物；(2)再經(jīng)偏甘油酯脂肪酶LipaseSMGl在不高于5°C時(shí)催化混合物中的偏甘油酯型 PUFA與羥基供體進(jìn)行水解或醇解反應(yīng)；(3)分離反應(yīng)產(chǎn)物，回收油相,最后對(duì)油相進(jìn)行純化,獲得高純度的甘油三酯型PUFA。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(2)所述水解或醇解反應(yīng)的溫度為 0^5 0C ο
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的制備方法，其特征在于，所述羥基供體為水或低碳鏈的一元醇。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的制備方法，其特征在于，步驟(I)所述?；w為富含 PUFA的脂肪酸或脂肪酸短鏈醇酯。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種高純度甘油三酯型PUFA的制備方法，包括如下步驟(1)以脂肪酶Novozym435為催化劑，PUFA的?；w與甘油進(jìn)行反應(yīng)，然后除去催化劑和剩余的甘油，得到甘油三酯型PUFA和偏甘油酯型PUFA的混合物；(2)再經(jīng)偏甘油酯脂肪酶Lipase SMG1在不高于5℃時(shí)催化混合物中的偏甘油酯型PUFA與羥基供體進(jìn)行水解或醇解反應(yīng)；(3)分離反應(yīng)產(chǎn)物，回收油相，最后對(duì)油相進(jìn)行純化，獲得高純度的甘油三酯型PUFA。本方法由于使用了偏甘油酯脂肪酶在較低的溫度下選擇性地去除PUFA甘油酯中非甘油三酯組分，可以獲得過氧化值低，甘油三酯含量在95~100%的PUFA甘油酯產(chǎn)品，具有更好的經(jīng)濟(jì)性和環(huán)保性。
文檔編號(hào)C12P7/64GK102994580SQ20121050684
公開日2013年3月27日 申請(qǐng)日期2012年11月30日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月30日
發(fā)明者王永華, 王衛(wèi)飛, 楊博, 藍(lán)東明, 李志剛 申請(qǐng)人:華南理工大學(xué)