專利名稱：人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的提取和培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的提取和培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是一種來源于中胚層和外胚層的多潛能干細(xì)胞，屬于成體干細(xì)胞。間充質(zhì)干細(xì)胞具有自我更新的能力，并具有多向分化潛能，在特定誘導(dǎo)條件下能分化為骨骼、軟骨、脂肪、神經(jīng)、心肌等多種組織細(xì)胞。間充質(zhì)干細(xì)胞存在于多種組織中，目前已經(jīng)從骨髓、脂肪、肌肉等組織中成功獲得了間充質(zhì)干細(xì)胞。來源于成體組織中的間充質(zhì)干細(xì)胞由于數(shù)量有限，且受患者年齡、疾病等因素 的影響，限制了其在臨床上的應(yīng)用。臍帶以及臍帶血以其非侵入式的獲得方式，對捐獻者不會造成任何損害而成為一種理想的間充質(zhì)干細(xì)胞來源。而與臍帶血相比，臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞更易于獲得和培養(yǎng)。每條臍帶的間充質(zhì)干細(xì)胞的數(shù)目為4X105個，密度為10-15X IO3個/cm，而每份臍帶血中的數(shù)目為1-5 X IO3骨髓中的數(shù)目為每IO6個單個核細(xì)胞含有1-10個間充質(zhì)干細(xì)胞。臍帶的結(jié)構(gòu)從外到內(nèi)依次為臍帶上皮、羊膜下基質(zhì)、裂隙、血管間基質(zhì)(華通膠)、血管周圍基質(zhì)、血管(兩動脈一靜脈)。目前從臍帶的不同組織部位都獲得了間充質(zhì)干細(xì)胞，而其主要來源是血管間的華通膠基質(zhì)。臍帶組織包含豐富的間充質(zhì)干細(xì)胞，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞具有以下特點(1)增殖能力強體外培養(yǎng)第7代后可擴增300倍，且無明顯衰老跡象。
(2)免疫原性低臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞可劑量依賴性的抑制激活T淋巴細(xì)胞增殖，同時可維持和促進調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞擴增。臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞抑制免疫細(xì)胞的增殖，不會引起同種異源或異種免疫細(xì)胞的增殖，具有免疫調(diào)節(jié)作用和較低的免疫原性。(3)致腫瘤風(fēng)險低臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞具有穩(wěn)定的端粒酶活性，培養(yǎng)多代也不會喪失錨定依賴性和血清依賴性，在維持其增殖性的同時不具有致腫瘤性。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種能長期維持人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞活性的提取和培養(yǎng)方法。使用本發(fā)明提取和培養(yǎng)的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞在傳至10代后仍能維持干細(xì)胞的活性，保持干細(xì)胞的增殖和多項分化潛能。技術(shù)方案為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明公開了一種人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的提取和培養(yǎng)方法，該方法包括如下步驟步驟I :取健康胎兒臍帶切去動脈和靜脈，剪碎；步驟2 :用I型膠原酶消化臍帶；步驟3 :磷酸鹽緩沖液清洗組織塊；步驟4 :組織塊移入培養(yǎng)瓶中，加入培養(yǎng)基；步驟5 :培養(yǎng)瓶放入培養(yǎng)箱中持續(xù)傳代培養(yǎng)。優(yōu)選的,步驟I中，臍帶去除兩天臍動脈和一條臍靜脈，并剪碎至0. 5mm3-2mm3。
優(yōu)選的，步驟2中，臍帶使用I型膠原酶消化，I型膠原酶的質(zhì)量體積比為
0.2%_1%，每克臍帶組織使用0. 5-2毫升I型膠原酶消化，消化時間為1-3小時。優(yōu)選的，步驟4中使用的培養(yǎng)基成分包括胎牛血清，人成纖維生長因子，人上皮細(xì)胞生長因子，細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子，膽固醇。優(yōu)選的，培養(yǎng)基的成分配比為胎牛血清5%_10%，人成纖維生長因子5-10ng/ml，人上皮細(xì)胞生長因子5-10ng/ml，細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子l_5ng/ml，膽固醇10_20ng/ml。優(yōu)選的，培養(yǎng)基使用低糖DMEM培養(yǎng)基，并且加入了質(zhì)量體積比0. 5%-2%的青霉素和鏈霉素。有益效果本發(fā)明提供的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的提取和培養(yǎng)方法能快速獲得大量 臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，并且能長時間維持臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖和分化能力，在傳代至第10代后獲得的細(xì)胞仍然具有干細(xì)胞活性。


圖Ia為第I代人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)；圖Ib為第5代人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)；圖Ic為第7代人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)；圖Id為第10代人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)；圖2為第3代、第7代、第10代的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞生長曲線；圖3a為人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞表面抗原⑶29表達(dá)；圖3b為人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞表面抗原⑶44表達(dá)；圖3c為人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞表面抗原⑶105表達(dá)；圖3d為人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞表面抗原⑶34表達(dá)；圖3e為人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞表面抗原⑶45表達(dá)；圖3f為人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞表面抗原HLA-DR表達(dá)。
具體實施例方式下面結(jié)合附圖，對本發(fā)明做進一步說明。本發(fā)明提供的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的提取和培養(yǎng)方法，該方法包括如下步驟步驟I :取健康胎兒臍帶切去動脈和靜脈，剪碎；步驟2 :用I型膠原酶消化臍帶；步驟3 :磷酸鹽緩沖液清洗組織塊；步驟4 :組織塊移入培養(yǎng)瓶中，加入培養(yǎng)基；步驟5 :培養(yǎng)瓶放入培養(yǎng)箱中持續(xù)傳代培養(yǎng)。步驟I中,臍帶去除兩天臍動脈和一條臍靜脈,并剪碎至0. 5mm3-2mm3。步驟2中，臍帶使用I型膠原酶消化，I型膠原酶的質(zhì)量體積比為0. 2%_1%，每克臍帶組織使用0. 5-2毫升I型膠原酶消化，消化時間為1-3小時。步驟4中使用的培養(yǎng)基成分包括胎牛血清，人成纖維生長因子，人上皮細(xì)胞生長因子，細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子，膽固醇。培養(yǎng)基的成分配比為胎牛血清5%_10%，人成纖維生長因子5-10ng/ml，人上皮細(xì)胞生長因子5-10ng/ml,細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子l_5ng/ml,膽固醇10_20ng/ml。培養(yǎng)基使用低糖DMEM培養(yǎng)基，并且加入了質(zhì)量體積比0. 5%_2%的青霉素和鏈霉素。實施例I :人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基配制在500ml低糖培養(yǎng)基中加入25ml胎牛血清、
2.5 U g人成纖維生長因子、2. 5 U g上皮細(xì)胞生長因子、0. 5 U g細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子、5 ii g膽固醇、5ml抗生素，0. 22 um濾器過濾除菌，4°C儲存?zhèn)溆?。人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞提取與培養(yǎng) I、取健康、自然順產(chǎn)的胎兒臍帶首先剪為3cm的片段，然后用PBS清洗數(shù)次洗掉殘留血液，去除兩條動脈和一條靜脈，剪碎至Imm3左右的小塊。2、加入PBS清洗，800rmp離心5分鐘去除上清，重復(fù)清洗兩遍。3、加入20ml I型膠原酶消化2h，消化過程中間斷混勻組織塊以促進消化。4、消化完成后800rmp離心5min去除上清,加入PBS清洗,800rmp離心5min清洗兩遍。5、消化后的組織塊移到3瓶含5ml培養(yǎng)基的25ml培養(yǎng)瓶中放入培養(yǎng)箱37 0C，5%C02條件下培養(yǎng)。6、培養(yǎng)瓶前3天不要移動以使組織塊貼壁，第4天半量換液，第7天全量換液，第12天傳代，一瓶傳3瓶。實施例2 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基配制在500ml低糖培養(yǎng)基中加入50ml胎牛血清、5 U g人成纖維生長因子、5 ii g上皮細(xì)胞生長因子、I U g細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子、10 u g膽固醇、5ml抗生素，0. 22 m濾器過濾除菌，4°C儲存?zhèn)溆?。人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞提取與培養(yǎng)I、取健康、自然順產(chǎn)的胎兒臍帶9cm首先剪為3節(jié)各3cm的片段，然后用PBS清洗數(shù)次洗掉殘留血液，去除兩條動脈和一條靜脈，剪碎至Imm3左右的小塊。2、加入PBS清洗,800rmp離心5分鐘去除上清,重復(fù)清洗兩遍。3、加入20ml I型膠原酶消化2h，消化過程中間斷混勻組織塊以促進消化。4、消化完成后800rmp離心5min去除上清,加入PBS清洗,800rmp離心5min清洗兩遍。5、消化后的組織塊移到3瓶含5ml培養(yǎng)基的25ml培養(yǎng)瓶中放入培養(yǎng)箱37 0C，5%C02條件下培養(yǎng)。6、培養(yǎng)瓶前3天不要移動以使組織塊貼壁，第4天半量換液，第7天全量換液，第12天傳代，一瓶傳3瓶。(圖I)實施例3 細(xì)胞增殖能力檢測I、取第3代、第7代和第10代培養(yǎng)的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，各加入Iml 0. 25%的
胰酶消化細(xì)胞。2、用血球計數(shù)板對細(xì)胞計數(shù)，稀釋細(xì)胞懸液至I X IO5個/ml。3、用3塊12孔細(xì)胞培養(yǎng)板，在第一塊培養(yǎng)板的第一排四個孔接種第3代細(xì)胞I X IO5個/ml，第二排接種第7代細(xì)胞I X IO5個/ml，第三排接種第10代細(xì)胞I X IO5個/ml，每孔加入2ml細(xì)胞懸液，其它2塊培養(yǎng)板使用相同操作。4、24h后，取出第I塊培養(yǎng)板，計數(shù)每種細(xì)胞的4個孔中的細(xì)胞數(shù)。5、36h后取出第2塊培養(yǎng)板，計數(shù)每種細(xì)胞的4個孔中的細(xì)胞數(shù)。 6、72h后，取出第3塊培養(yǎng)板，計數(shù)每種細(xì)胞的4個孔中的細(xì)胞數(shù)。圖2結(jié)果顯示人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞在培養(yǎng)至第10代后增殖能力沒有明顯變化，72h后細(xì)胞數(shù)達(dá)到8. 5X IO5個/ml,與第3代(9. IX IO5個/ml)和第7代(7. 9X IO5個/ml)沒有明顯差異，仍然維持較高的增殖能力。實施例4 免疫表型檢測I、取第3代和第10代細(xì)胞分別用胰酶消化后移入I. 5ml離心管，1500rmp離心5min去除上清。2、每管加入Iml PBS重懸，1500rmp離心5min去除上清。3、加入PBS重懸細(xì)胞，計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為I X IO6個/ml。4、將細(xì)胞懸液分為每管500li I。5、加入流式抗體，4°C避光孵育30min。6、1500rmp 離心 5min 去除上清。7、加入Iml PBS重懸，1500rmp離心5min去除上清。8、加入500 ill PBS重懸細(xì)胞。9、流式細(xì)胞儀檢測樣品。圖3經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測，使用本發(fā)明方法培養(yǎng)的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞均高表達(dá)⑶29、⑶44、⑶73，而⑶34、⑶45、HLA-DR呈陰性，表明經(jīng)培養(yǎng)第10代后細(xì)胞仍表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)志抗原，細(xì)胞仍保持干細(xì)胞特征。由以上實施例得，使用本發(fā)明提取和培養(yǎng)的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞內(nèi)長期維持干細(xì)胞活性，對傳至10代的間充質(zhì)干細(xì)胞進行增殖能力檢測和免疫表型分析均無明顯變化。這一發(fā)明能有效用于人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的科學(xué)研究和進一步臨床應(yīng)用。以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施方式，本發(fā)明的保護范圍并不以上述實施方式為限，但凡本領(lǐng)域普通技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明所揭示內(nèi)容所作的等效修飾或變化，皆應(yīng)納入權(quán)利要求書中記載的保護范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的提取和培養(yǎng)方法，其特征在于該方法包括如下步驟 步驟I:取健康胎兒臍帶切去動脈和靜脈，剪碎； 步驟2 :用I型膠原酶消化臍帶； 步驟3 :磷酸鹽緩沖液清洗組織塊； 步驟4 :組織塊移入培養(yǎng)瓶中，加入培養(yǎng)基； 步驟5 :培養(yǎng)瓶放入培養(yǎng)箱中持續(xù)傳代培養(yǎng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的提取和培養(yǎng)方法，其特征在于步驟I中，臍帶去除兩天臍動脈和一條臍靜脈，并剪碎至0. 5mm3-2mm3。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的提取和培養(yǎng)方法，其特征在于步驟 2中，臍帶使用I型膠原酶消化，I型膠原酶的質(zhì)量體積比為0. 2%-1%，每克臍帶組織使用0.5-2毫升I型膠原酶消化，消化時間為1-3小時。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的提取和培養(yǎng)方法，其特征在于步驟4中使用的培養(yǎng)基成分包括胎牛血清，人成纖維生長因子，人上皮細(xì)胞生長因子，細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子，膽固醇。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的提取和培養(yǎng)方法，其特征在于培養(yǎng)基的成分配比為胎牛血清5%-10%，人成纖維生長因子5-10ng/ml，人上皮細(xì)胞生長因子5-10ng/ml,細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子 l_5ng/ml,膽固醇 10_20ng/ml。
6.根據(jù)權(quán)利要求I的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的提取和培養(yǎng)方法，其特征在于培養(yǎng)基使用低糖DMEM培養(yǎng)基，并且加入了質(zhì)量體積比0. 5%-2%的青霉素和鏈霉素。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的提取和培養(yǎng)方法。臍帶組織切碎后經(jīng)I型膠原酶消化后移入含培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中持續(xù)培養(yǎng)。所用培養(yǎng)基為低糖DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基并且添加了胎牛血清、成纖維生長因子、上皮細(xì)胞生長因子、細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子、膽固醇。使用本發(fā)明的提取和培養(yǎng)方法可以長期培養(yǎng)人的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，并且維持干細(xì)胞活性。本發(fā)明解決了目前人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)中細(xì)胞衰老過快以及分化問題，能夠長期獲得具有干細(xì)胞特性的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。
文檔編號C12N5/0775GK102965338SQ201210510379
公開日2013年3月13日 申請日期2012年12月4日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月4日
發(fā)明者肖忠黨, 孟憲會, 孫博, 胡飛虎, 梁高峰 申請人:東南大學(xué)