專利名稱：：一對(duì)特異識(shí)別肌肉生長(zhǎng)抑制素基因的多肽及其編碼基因和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一對(duì)特異識(shí)別肌肉生長(zhǎng)抑制素基因的多肽及其編碼基因和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：肌肉生長(zhǎng)抑制素(MSTN)是骨骼肌生長(zhǎng)的負(fù)調(diào)控因子，在其活力消失后，動(dòng)物會(huì)出現(xiàn)肌肉過(guò)度發(fā)育的癥狀，其肌肉纖維會(huì)增粗或數(shù)目增加，表現(xiàn)為出雙肌臀癥狀。由于它是能決定肌肉器官大小的調(diào)控因子之一，因此在畜牧生產(chǎn)上有很好的應(yīng)用價(jià)值和應(yīng)用前景。很多科學(xué)家在豬上對(duì)該基因進(jìn)行了深入的研究，期望通過(guò)在豬上對(duì)MSTN進(jìn)行敲除或改造以獲得優(yōu)質(zhì)聞瘦肉率的豬種。尋找一種能靶向修飾MSTN基因的技術(shù)相當(dāng)重要。傳統(tǒng)的打靶技術(shù)效率非常的低，其主要是依賴細(xì)胞內(nèi)部的同源重組隨機(jī)交換完成的，效率非常低。近年來(lái)發(fā)展的主要方法為依托序列特異的核酸酶進(jìn)行基因的精確修飾。序列特異的核酸酶主要由一個(gè)DNA識(shí)別域與一個(gè)能非特異性切割DNA的內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域連接而成。其主要原理為先由DNA識(shí)別域識(shí)別并結(jié)合到需要改造的DNA片段上，然后由與DNA相連的非特異性內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域?qū)NA進(jìn)行切割，造成DNA的雙鏈斷裂(Double-strandbreak，DSB),DSB會(huì)激活DNA的自我修復(fù)而引起基因的突變從而促進(jìn)該位點(diǎn)的同源重組。鋅指核酸酶技術(shù)(ZincFingerNuclease,ZFN)就是前一段所述的基因精確修飾技術(shù)，由一個(gè)特異性的DNA識(shí)別域和一個(gè)非特異性核酸內(nèi)切酶構(gòu)成。在ZFN識(shí)別結(jié)構(gòu)域中，一個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)可以特異識(shí)別多個(gè)(通常是3個(gè))連續(xù)的堿基，多個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)能夠識(shí)別一連串的堿基。所以，在ZFN的設(shè)計(jì)過(guò)程中，鋅指識(shí)別結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列是重點(diǎn)，特別是設(shè)計(jì)如何將多個(gè)賴氨酸2-組氨酸2(Cys2-His2)鋅指蛋白串聯(lián)，以及如何通過(guò)改變?chǔ)谅菪?6氨基酸殘基決定每個(gè)鋅指蛋白識(shí)別的特定三聯(lián)體堿基。ZFN技術(shù)在基因靶向修飾方面的可行性使得其廣泛應(yīng)用于個(gè)體水平和細(xì)胞水平的基因修飾。首先人們通過(guò)利用ZFN技術(shù)實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞水平的基因定向修飾。如Sangamo公司于2005年首次在人類培養(yǎng)細(xì)胞系中實(shí)現(xiàn)ZFN介導(dǎo)的基因打靶，2007年應(yīng)用同樣的ZFN通過(guò)同源重組基因?qū)崿F(xiàn)了基因定點(diǎn)插入。最近，人們利用ZFN分別在人的iPS和ES細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)了基因的靶向突變。ZFN已經(jīng)成功用于植物、斑馬魚、昆蟲以及多種哺育動(dòng)物的基因操作，但是仍然有很多問(wèn)題有待解決，主要包括以下幾個(gè)方面=(I)ZFN的制備過(guò)程繁瑣、復(fù)雜、耗時(shí)長(zhǎng)、價(jià)格昂貴(Sigma公司的一對(duì)ZFNs20萬(wàn)元人民幣，制備出I對(duì)ZFN通常需要2個(gè)月)；(2)不能保證所有的基因都能采用ZFN進(jìn)行敲除，因?yàn)殇\指庫(kù)里的基因數(shù)目有限；(3)ZFN的細(xì)胞毒性，主要是非特異切割(脫靶切割)所帶來(lái)的副作用。相比之下，轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子核酸酶(transcriptionactivator-1ikeeffectornucleases,TALEN)有更多優(yōu)勢(shì)，它是繼鋒指核酸酶技術(shù)以來(lái)的另一種能夠?qū)蚪M進(jìn)行高效定點(diǎn)修飾的新技術(shù)。轉(zhuǎn)錄因子激活效應(yīng)物家族中有一種蛋白(TALEs)能夠識(shí)別、結(jié)合DNA。TALE與DNA序列特異性結(jié)合主要是由TAL結(jié)構(gòu)內(nèi)34個(gè)恒定氨基酸序列介導(dǎo)。將TALEs與FokI核酸內(nèi)切酶的切割域相連接，形成TALEN，從而可以實(shí)現(xiàn)對(duì)基因組DNA雙鏈在特定位點(diǎn)進(jìn)行修飾。在TALE的中央存在著一個(gè)重復(fù)區(qū)域，這個(gè)區(qū)域通常是由33-35個(gè)氨基酸的數(shù)量可變的重復(fù)單元構(gòu)成。重復(fù)序列結(jié)構(gòu)域(RepeatDomain)負(fù)責(zé)識(shí)別特異性的DNA序列。每個(gè)重復(fù)序列基本上都是一樣的，除了兩個(gè)可變的氨基酸，即重復(fù)序列可變的雙氨基酸殘基(Repeat-VariableDiresidues,RVD)。TALE識(shí)別DNA的機(jī)制在于一個(gè)重復(fù)序列上的RVD能夠識(shí)別DNA靶點(diǎn)上的一個(gè)核苷酸，再融合FokI核酸內(nèi)切酶，組合成TALEN。TALEN是一種異源二聚體分子(兩單位的TALEDNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域融合到一單位的催化性結(jié)構(gòu)域)，能夠切割兩個(gè)相隔較近的序列，從而使得特異性增強(qiáng)。該酶的效率高，毒性小，制備周期短，成本低等優(yōu)勢(shì)越來(lái)越明顯
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一對(duì)特異識(shí)別肌肉生長(zhǎng)抑制素基因的多肽及其編碼基因和應(yīng)用。本發(fā)明提供了一對(duì)特異識(shí)別肌肉生長(zhǎng)抑制素基因的多肽(命名為特異多肽對(duì))，由多肽甲和多肽乙組成；所述多肽甲由16個(gè)TAL核酸識(shí)別單元組成，每個(gè)TAL核酸識(shí)別單元中具有兩個(gè)雙連氨基酸；所述多肽乙由17個(gè)TAL核酸識(shí)別單元組成，每個(gè)TAL核酸識(shí)別單元中具有兩個(gè)雙連氨基酸；所述多肽甲中的16個(gè)雙連氨基酸依次如下序列表的序列3自N末端第2-3位氨基酸殘基、第36-37位氨基酸殘基、第70-71位氨基酸殘基、第104-105位氨基酸殘基、第138-139位氨基酸殘基、第172-173位氨基酸殘基、第206-207位氨基酸殘基、第240-241位氨基酸殘基、第274-275位氨基酸殘基、第308-309位氨基酸殘基、第342-343位氨基酸殘基、第376-377位氨基酸殘基、第410-411位氨基酸殘基、第444-445位氨基酸殘基、第478-479位氨基酸殘基和第512-513位氨基酸殘基；所述多肽乙中的17個(gè)雙連氨基酸依次如下序列表的序列5自N末端第2-3位氨基酸殘基、第36-37位氨基酸殘基、第70-71位氨基酸殘基、第104-105位氨基酸殘基、第138-139位氨基酸殘基、第172-173位氨基酸殘基、第206-207位氨基酸殘基、第240-241位氨基酸殘基、第274-275位氨基酸殘基、第308-309位氨基酸殘基、第342-343位氨基酸殘基、第376-377位氨基酸殘基、第410-411位氨基酸殘基、第444-445位氨基酸殘基、第478-479位氨基酸殘基、第512-513位氨基酸殘基和第546-547位氨基酸殘基。所述多肽甲具體可如序列表的序列3所示。所述多肽乙具體可如序列表的序列5所示。本發(fā)明還保護(hù)一對(duì)DNA分子(命名為特異DNA分子對(duì))，由編碼所述多肽甲的DNA分子甲和編碼所述多肽乙的DNA分子乙組成。所述DNA分子甲中，編碼所述多肽甲的16個(gè)雙連氨基酸的核苷酸依次如下序列表的序列2自5’末端第4-9位核苷酸、第106-111位核苷酸、第208-213位核苷酸、第310-315位核苷酸、第412-417位核苷酸、第514-519位核苷酸、第616-621位核苷酸、第718-723位核苷酸、第820-825位核苷酸、第922-927位核苷酸、第1024-1029位核苷酸、第1126-1131位核苷酸、第1228-1233位核苷酸、第1330-1335位核苷酸、第1432-1437位核苷酸和第1534-1539位核苷酸。所述DNA分子乙中，編碼所述多肽乙的17個(gè)雙連氨基酸的核苷酸依次如下序列表的序列4自5’末端第4-9位核苷酸、第106-111位核苷酸、第208-213位核苷酸、第310-315位核苷酸、第412-417位核苷酸、第514-519位核苷酸、第616-621位核苷酸、第718-723位核苷酸、第820-825位核苷酸、第922-927位核苷酸、第1024-1029位核苷酸、第1126-1131位核苷酸、第1228-1233位核苷酸、第1330-1335位核苷酸、第1432-1437位核苷酸、第1534-1539位核苷酸和第1636-1641位核苷酸。所述DNA分子甲具體可如序列表的序列2所示。所述DNA分子乙具體可如序列表的序列4所示。本發(fā)明還保護(hù)一對(duì)質(zhì)粒(命名為特異質(zhì)粒對(duì))，由具有所述DNA分子甲的質(zhì)粒甲和具有所述DNA分子乙的質(zhì)粒乙組成。所述質(zhì)粒甲具體可為在pCS2_FokI載體(PEAS型)的多克隆位點(diǎn)(如NheI酶切位點(diǎn))插入所述DNA分子甲得到的重組質(zhì)粒。所述質(zhì)粒乙具體可為在pCS2_FokI載體(PERR型)的多克隆位點(diǎn)(如NheI酶切位點(diǎn))插入所述DNA分子乙得到的重組質(zhì)粒。本發(fā)明還保護(hù)所述特異多肽對(duì)在特異識(shí)別肌肉生長(zhǎng)抑制素基因中的應(yīng)用。所述肌肉生長(zhǎng)抑制素基因可為豬的肌肉生長(zhǎng)抑制素基因，具體可如序列表的序列I所示。本發(fā)明還保護(hù)所述特異質(zhì)粒對(duì)在特異切割肌肉生長(zhǎng)抑制素基因中的應(yīng)用。所述肌肉生長(zhǎng)抑制素基因可為豬的肌肉生長(zhǎng)抑制素基因，具體可如序列表的序列I所示。本發(fā)明還保護(hù)所述特異質(zhì)粒對(duì)在構(gòu)建肌肉生長(zhǎng)抑制素基因突變庫(kù)中的應(yīng)用。所述肌肉生長(zhǎng)抑制素基因可為豬的肌肉生長(zhǎng)抑制素基因，具體可如序列表的序列I所示。本發(fā)明提供了特異識(shí)別肌肉生長(zhǎng)抑制素基因的多肽對(duì)，并提供了該多肽對(duì)的編碼基因。本發(fā)明同時(shí)提供了用于基因工程的質(zhì)粒對(duì)，該質(zhì)粒對(duì)由兩個(gè)質(zhì)粒組成，其中一個(gè)質(zhì)粒表達(dá)一條多肽和PEAS型FokI核酸內(nèi)切酶的融合蛋白，另一個(gè)質(zhì)粒表達(dá)另一條多肽和FokI核酸內(nèi)切酶(PERR型)的融合蛋白。將所述質(zhì)粒對(duì)導(dǎo)入含有目的基因的細(xì)胞，可以使細(xì)胞中的目的基因被特異切割，在細(xì)胞自身修復(fù)系統(tǒng)的作用下，可以得到目的基因的突變庫(kù)。本發(fā)明對(duì)于在豬上對(duì)MSTN進(jìn)行敲除或改造以獲得優(yōu)質(zhì)高瘦肉率的豬種具有重大應(yīng)用價(jià)值。圖I為四種質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)示意圖和工作原理示意圖。圖2為重組質(zhì)粒TALE-IL具有的串聯(lián)模塊及其構(gòu)建過(guò)程的示意圖。圖3為重組質(zhì)粒TALE-IR具有的串聯(lián)模塊及其構(gòu)建過(guò)程的示意圖。圖4為重組質(zhì)粒TALE-IL和重組質(zhì)粒TALE-1R的PCR鑒定圖。圖5為重組質(zhì)粒TALE-IL和重組質(zhì)粒TALE-1R的酶切鑒定圖。圖6為重組質(zhì)粒pcs2-TALE-peas-lL和重組質(zhì)粒pcs2-TALE-peas-lR的構(gòu)建流程圖。圖7為重組質(zhì)粒pcs2-TALE-peas_lL和重組質(zhì)粒pcs2-TALE-peas_lR的PCR鑒定圖。圖8為重組質(zhì)粒pcs2-TALE_peas_lL和重組質(zhì)粒pcs2_TALE-peas_lR的酶切鑒定圖。圖9為重組質(zhì)粒pSSA-MSTN的結(jié)構(gòu)示意圖。圖10為重組質(zhì)粒pSSA-MSTN的工作原理示意圖。圖11為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的HindIII酶切圖譜。圖12為重組核酸酶異二聚體識(shí)別靶點(diǎn)序列并切割目標(biāo)DNA示意圖。具體實(shí)施例方式以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為自常規(guī)生化試劑商店購(gòu)買得到的。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。以下實(shí)施例中，如無(wú)特殊說(shuō)明，均采用低糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞。pTALE-ACWBI0,CatNo.CW22380pTALE-GCffBIOCatNo.CW22390pTALE-CCWBIOCatNo.CW2240。pTALE-T:CWBI0CatNo.CW2241。293T細(xì)胞系CWBI0CatNo.CW2095。pSSA載體(文獻(xiàn)中的名稱為“SSAreporterplasmid”)參考文獻(xiàn)HeritablegenetargetinginzebrafishusingcustomizedTALENs.HuangP,XiaoA,ZhouM,ZhuZ,LinS,ZhangB.NatBiotechnol.201IAug5;29(8):699-700.doi:10.1038/nbt.1939.。Renillaluciferase質(zhì)粒(文獻(xiàn)中的名稱為“Renillaplasmid”)參考文獻(xiàn)HeritablegenetargetinginzebrafishusingcustomizedTALENs.HuangP,XiaoA,ZhouM,ZhuZ,LinS,ZhangB.NatBiotechnol.2011Aug5;29(8):699-700.doi:10.1038/nbt.1939.。實(shí)施例I、TALE靶點(diǎn)識(shí)別模塊的構(gòu)建一、四種模塊以及將模塊進(jìn)行組合的機(jī)理描述TAL的核酸識(shí)別單元為間隔32個(gè)恒定氨基酸序列的雙連氨基酸。雙連氨基酸與A、G、C、T有恒定的對(duì)應(yīng)關(guān)系，即NI識(shí)別A、NG識(shí)別T、HD識(shí)別C、NN識(shí)別G。pTALE-A質(zhì)粒、PTALE-G質(zhì)粒、pTALE-C質(zhì)粒和pTALE_T質(zhì)粒為單模塊載體，為分別具有上述四種TAL的核酸識(shí)別單元的編碼DNA的質(zhì)粒，且在編碼DNA的5’末端具有SpeI酶切識(shí)別序列、3’末端具有連續(xù)的NheI酶切識(shí)別序列和HindIII識(shí)別序列。通過(guò)單模塊載體上的SpeI,NheI和HindIII酶切位點(diǎn)按照靶點(diǎn)序列相對(duì)應(yīng)的TAL單元即可串聯(lián)克隆，其中右側(cè)靶點(diǎn)序列需反向構(gòu)建1旲塊。四種質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)不意圖和工作原理不意圖見圖I。目如，TALEN系統(tǒng)利用FokI的內(nèi)切酶活性打斷目標(biāo)基因，因?yàn)镕okI需形成2聚體方能發(fā)揮活性，在實(shí)際操作中需在目標(biāo)基因中選擇兩處相鄰(間隔14-18堿基)的靶序列(一般十幾個(gè)堿基)分別進(jìn)行TAL識(shí)別模塊構(gòu)建。二、靶點(diǎn)的選擇MSTN基因的部分序列見序列表的序列1，其中自5’末端第615至995位核苷酸為第三外顯子。首先通過(guò)大量序列分析和篩選工作將第三外顯子作為初步選定的靶點(diǎn)，然后通過(guò)進(jìn)一步篩選，將序列表的序列I自5’末端第713至767位核苷酸作為進(jìn)一步選定的靶點(diǎn)，通過(guò)再次的篩選，將序列表的序列I自5’末端第714-729位核苷酸和第750-766位核苷酸作為最終的靶點(diǎn)。三、重組質(zhì)粒TALE-IL(左側(cè)TALE模塊)和重組質(zhì)粒TALE-IR(右側(cè)TALE模塊)的構(gòu)建根據(jù)選定的靶點(diǎn)，用pTALE-A質(zhì)粒、pTALE-G質(zhì)粒、pTALE-C質(zhì)粒和pTALE_T質(zhì)粒構(gòu)建重組質(zhì)粒TALE-IL(具有圖2所示的串聯(lián)模塊)，構(gòu)建過(guò)程見圖2。根據(jù)選定的靶點(diǎn)，用pTALE-A質(zhì)粒、pTALE-G質(zhì)粒、pTALE-C質(zhì)粒和pTALE_T質(zhì)粒構(gòu)建重組質(zhì)粒TALE-IR(具有圖3所示的串聯(lián)模塊)，構(gòu)建過(guò)程見圖3。重組質(zhì)粒TALE-IL識(shí)別16個(gè)核苷酸(CGTTACCCTCTAACTG)，重組質(zhì)粒TALE-1R識(shí)別17個(gè)核苷酸(GCAATAATCCAGTCCCA)。重組質(zhì)粒TALE-IL和重組質(zhì)粒TALE-1R的PCR鑒定圖見圖4。PCR鑒定采用的引物對(duì)為對(duì)應(yīng)載體骨架的M13-47和RV-M(M13_47:5，-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’;RV_M:5’-AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3’)。圖4中，泳道8為重組質(zhì)粒TALE-1L，泳道16為重組質(zhì)粒TALE-1R，泳道M5為Trans5KMarker(5k、3k、2k、I.5k、lk、800bp、500bp、300bp)。重組質(zhì)粒TALE-IL的預(yù)期條帶為1788bp左右，重組質(zhì)粒TALE-IR的預(yù)期條帶為1890bp左右，兩個(gè)質(zhì)粒均顯示預(yù)期條帶。重組質(zhì)粒TALE-IL和重組質(zhì)粒TALE-1R的酶切鑒定圖見圖5(SpeI和NheI雙酶切)。圖5中，I和2為重組質(zhì)粒TALE-IR(預(yù)期條帶為I.7k左右)，3為重組質(zhì)粒TALE-IL(預(yù)期條帶為I.6k左右)，M2為Trans2KplusMarker(5k、3k、2k、lk、750bp、500bp、250bp、IOObp)ο重組質(zhì)粒TALE-IL和重組質(zhì)粒TALE-IR的檢測(cè)結(jié)果均呈陽(yáng)性。重組質(zhì)粒TALE-IL和重組質(zhì)粒TALE-IR統(tǒng)稱重組質(zhì)粒TALE。四、重組質(zhì)粒pcs2-TALE_peas_lL和重組質(zhì)粒pcs2_TALE-peas_lR的構(gòu)建pCS2-FokI載體CWBI0，CatNo.CW2273;包括一對(duì)結(jié)構(gòu)基本相同的質(zhì)粒，pCS2-FokI載體(PEAS型)和pCS2_FokI載體(PERR型)，pCS2_FokI載體(PEAS型)又稱PEAS型pCS2-FokI載體，pCS2_FokI載體(PERR型)又稱PERR型pCS2_FokI載體，pCS2-FokI載體(PEAS型)和pCS2_FokI載體(PERR型)的差異僅在于pCS2_FokI載體(PEAS型)具有編碼FokI核酸內(nèi)切酶(PEAS型)的DNA序列，pCS2_FokI載體(PERR型)具有編碼FokI核酸內(nèi)切酶(PERR型)的DNA序列；質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)為具有由sCMV啟動(dòng)子控制的、除目標(biāo)基因靶點(diǎn)識(shí)別域外的TALEN必需元件、編碼FokI核酸內(nèi)切酶(PEAS型或PERR型)的DNA序列，在編碼TALEO.5單元模塊(RVDNG,識(shí)別T堿基)的DNA序列的5’端嵌有限制性內(nèi)切酶NheIDNA的識(shí)別序列。FokI核酸內(nèi)切酶(PEAS型)和FokI核酸內(nèi)切酶(PERR型)形成2聚體后發(fā)揮內(nèi)切酶的功能。重組質(zhì)粒pcs2_TALE-peas_lL和重組質(zhì)粒pcs2_TALE-peas_lR統(tǒng)稱pcs2_TALEN，構(gòu)建流程圖見圖6。I、用限制性內(nèi)切酶SpeI和NheI雙酶切重組質(zhì)粒TALE-1L，回收約1600bp的DNA片段。2、用限制性內(nèi)切酶NheI酶切pCS2_FokI載體(PEAS型)，回收約5500bp的載體骨架。3、將步驟I得到的DNA片段和步驟2得到的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒pcs2-TALE-peas-lL(左側(cè)表達(dá)質(zhì)粒)。根據(jù)測(cè)序結(jié)果，對(duì)重組質(zhì)粒pcs2_TALE-peas_lL進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下在pCS2-FokI載體(PEAS型)的NheI酶切位點(diǎn)插入了序列表的序列2所不的雙鏈DNA分子(序列表的序列2所不的DNA分子編碼序列表的序列3所不的蛋白質(zhì)；序列3中的雙連氨基酸分別為第2-3位氨基酸殘基、第36-37位氨基酸殘基、第70-71位氨基酸殘基、第104-105位氨基酸殘基、第138-139位氨基酸殘基、第172-173位氨基酸殘基、第206-207位氨基酸殘基、第240-241位氨基酸殘基、第274-275位氨基酸殘基、第308-309位氨基酸殘基、第342-343位氨基酸殘基、第376-377位氨基酸殘基、第410-411位氨基酸殘基、第444-445位氨基酸殘基、第478-479位氨基酸殘基、第512-513位氨基酸殘基)；重組質(zhì)粒pcs2-TALE-peas-lL中，在CMV啟動(dòng)子的作用下,表達(dá)序列3所示蛋白質(zhì)與FokI內(nèi)切酶單體的融合蛋白(命名為融合蛋白-L)，該融合蛋白中，序列3所示蛋白質(zhì)位于N末端。4、用限制性內(nèi)切酶SpeI和NheI雙酶切重組質(zhì)粒TALE-1R，回收約1700bp的DNA片段。5、用限制性內(nèi)切酶NheI酶切pCS2_FokI載體(PERR型)，回收約5500bp的載體骨架。6、將步驟4得到的DNA片段和步驟5得到的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒pcs2-TALE-peas-lR(右側(cè)表達(dá)質(zhì)粒)。根據(jù)測(cè)序結(jié)果,對(duì)重組質(zhì)粒pcs2_TALE-peas_lR進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下在pCS2-FokI載體(PERR型)的NheI酶切位點(diǎn)之間插入了序列表的序列4所不的DNA分子(序列表的序列4所不的DNA分子編碼序列表的序列5所不的蛋白質(zhì)；序列5中的雙連氨基酸分別為第2-3位氨基酸殘基、第36-37位氨基酸殘基、第70-71位氨基酸殘基、第104-105位氨基酸殘基、第138-139位氨基酸殘基、第172-173位氨基酸殘基、第206-207位氨基酸殘基、第240-241位氨基酸殘基、第274-275位氨基酸殘基、第308-309位氨基酸殘基、第342-343位氨基酸殘基、第376-377位氨基酸殘基、第410-411位氨基酸殘基、第444-445位氨基酸殘基、第478-479位氨基酸殘基、第512-513位氨基酸殘基、第546-547位氨基酸殘基)；重組質(zhì)粒pcs2-TALE-peas-lR中，在CMV啟動(dòng)子的作用下，表達(dá)序列5所示蛋白質(zhì)與FokI內(nèi)切酶單體的融合蛋白(命名為融合蛋白-R)，該融合蛋白中，序列5所示蛋白質(zhì)位于N末端。重組質(zhì)粒pcs2-TALE_peas_lL和重組質(zhì)粒pcs2_TALE-peas_lR的PCR鑒定圖見圖7。PCR鑒定重組質(zhì)粒pcs2-TALE-peas-lL采用的引物對(duì)為對(duì)應(yīng)載體骨架的GNNFor和63dn(GNNFor:5，-AGTAACAATGGCAAACA-3，；63dn:5，-GGATCCGGCAACGCGATGGGATGTG-3，)。PCR鑒定重組質(zhì)粒pcs2-TALE-peas-lR采用的引物對(duì)為對(duì)應(yīng)載體骨架的AFor和63dn(AFor:5’-AGTAATATTGGTGGCAAACA-3’；63dn:5’-GGATCCGGCAACGCGATGGGATGTG-3’)。圖7中，泳道8為重組質(zhì)粒pcs2-TALE-peas-lL，泳道15為重組質(zhì)粒pcs2-TALE-peas_lR，泳道Ml為TransIKMarker(700bp600bp500bp400bp300bp200bpIOObp),泳道M2為Trans2KplusMarker(5k3k2kIk750bp500bp250bplOObp)。重組質(zhì)粒pcs2_TALE-peas_lL的預(yù)期條帶為350bp左右,重組質(zhì)粒pcs2-TALE-perr-lR的預(yù)期條帶為350bp左右,兩個(gè)質(zhì)粒均顯示預(yù)期條帶。重組質(zhì)粒pcs2-TALE-peas_lL和重組質(zhì)粒pcs2_TALE-peas_lR的酶切鑒定圖見圖8(KpnI和NheI雙酶切)。圖8中，3為重組質(zhì)粒pcs2-TALE-peas-lL(預(yù)期條帶為5.5k左右+2k左右)，5為重組質(zhì)粒pcs2-TALE-peas-lR(預(yù)期條帶為5.5k左右+2.Ik左右)，M2為Trans2KplusMarker(5k、3k、2k、lk、750bp、500bp、250bp、IOObp),泳道M5為Trans5KMarker(5k、3k、2k、l.5k、lk、800bp、500bp、300bp)。重組質(zhì)粒pcs2_TALE-peas_lL和重組質(zhì)粒pcs2-TALE-peas-lR的檢測(cè)結(jié)果均呈陽(yáng)性。實(shí)施例2、報(bào)告質(zhì)粒的構(gòu)建I、合成序列表的序列6所示的雙鏈DNA分子(靶點(diǎn)片段)。2、以步驟I合成的雙鏈DNA分子為模板,用mstnssaup和mstnssadn組成的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。mstnssaup:5，-AGTAGATCTGTGATTCAGGATCTATTGCTAC-3，；mstnssadn:5，-AGTCTCGAGGCAGTAATTGGCCTTATATCT-3，。3、用限制性內(nèi)切酶BglII和XhoI雙酶切步驟2的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物。4、用限制性內(nèi)切酶BglII和XhoI雙酶切pSSA載體，回收約6500bp的載體骨架。5、將步驟3的酶切產(chǎn)物和步驟4的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒pSSA-MSTN(報(bào)告質(zhì)粒)。根據(jù)測(cè)序結(jié)果,對(duì)重組質(zhì)粒pSSA-MSTN進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下在pSSA載體的BglII和XhoI酶切位點(diǎn)之間插入了序列表的序列6所示的DNA分子(MSTN片段)。重組質(zhì)粒pSSA-MSTN的結(jié)構(gòu)示意圖見圖9，由CMV啟動(dòng)子控制的SSA報(bào)告基因(FireflyLuciferase，中文名稱為螢火蟲熒光素酶)被終止密碼子和靶點(diǎn)片段分割兩個(gè)870bp左右的片段(自上游至下游依次命名為片段甲和片段乙，片段甲的下游和片段乙的上游為同源臂)。將重組質(zhì)粒pSSA-MSTN導(dǎo)入細(xì)胞后，因?yàn)槠渭缀推我抑g具有終止密碼子和靶點(diǎn)片段組成的間隔區(qū)，只能顯示很弱的FireflyLuciferase熒光信號(hào)。將重組質(zhì)粒pSSA-MSTN導(dǎo)入細(xì)胞后，如果間隔區(qū)的DNA片段被敲除，片段甲和片段乙可以借助同源臂發(fā)生同源重組并形成有活性的FireflyLuciferase,使得FireflyLuciferase突光信號(hào)顯著增加，工作原理示意圖見圖10。實(shí)施例3、通過(guò)熒光素酶報(bào)告基因法驗(yàn)證實(shí)施例I構(gòu)建的質(zhì)粒的TALEN活性分別進(jìn)行如下2組實(shí)驗(yàn)處理(每個(gè)實(shí)驗(yàn)處理進(jìn)行三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，每次重復(fù)實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)處理，結(jié)果取三個(gè)重復(fù)處理的平均值；轉(zhuǎn)染試劑均為DNAFectTransfectionReagentDNA轉(zhuǎn)染試劑，CWBI0、CatNo.CW0860，每個(gè)處理中轉(zhuǎn)染試劑的加入量為6ul，并按照說(shuō)明書進(jìn)行操作)第I組將O.4ugRenillaluciferase質(zhì)粒(參考對(duì)照質(zhì)粒)和2.Oug重組質(zhì)粒pSSA-MSTN共轉(zhuǎn)染IX106293T細(xì)胞；第2組將O.4ugRenillaluciferase質(zhì)粒(參考對(duì)照質(zhì)粒)、2·Oug重組質(zhì)粒pSSA_MSTN、4ug重組質(zhì)粒pcs2_TALE-peas_lL和4ug重組質(zhì)粒pcs2_TALE-peas_lR共轉(zhuǎn)染1X106293T細(xì)胞；轉(zhuǎn)染24小時(shí)后取各組的細(xì)胞進(jìn)行裂解并檢測(cè)熒光素酶的熒光信號(hào)(儀器為L(zhǎng)uminometer,DLReady,型號(hào)是TD-20/20),結(jié)果見表I。表I各組處理的突光信號(hào)(突光強(qiáng)度)I第I組丨第2組權(quán)利要求1.一對(duì)多肽，由多肽甲和多肽乙組成；所述多肽甲由16個(gè)TAL核酸識(shí)別單元組成，每個(gè)TAL核酸識(shí)別單元中具有兩個(gè)雙連氨基酸；所述多肽乙由17個(gè)TAL核酸識(shí)別單元組成，每個(gè)TAL核酸識(shí)別單元中具有兩個(gè)雙連氨基酸；所述多肽甲中的16個(gè)雙連氨基酸依次如下序列表的序列3自N末端第2-3位氨基酸殘基、第36-37位氨基酸殘基、第70-71位氨基酸殘基、第104-105位氨基酸殘基、第138-139位氨基酸殘基、第172-173位氨基酸殘基、第206-207位氨基酸殘基、第240-241位氨基酸殘基、第274-275位氨基酸殘基、第308-309位氨基酸殘基、第342-343位氨基酸殘基、第376-377位氨基酸殘基、第410-411位氨基酸殘基、第444-445位氨基酸殘基、第478-479位氨基酸殘基和第512-513位氨基酸殘基；所述多肽乙中的17個(gè)雙連氨基酸依次如下序列表的序列5自N末端第2-3位氨基酸殘基、第36-37位氨基酸殘基、第70-71位氨基酸殘基、第104-105位氨基酸殘基、第138-139位氨基酸殘基、第172-173位氨基酸殘基、第206-207位氨基酸殘基、第240-241位氨基酸殘基、第274-275位氨基酸殘基、第308-309位氨基酸殘基、第342-343位氨基酸殘基、第376-377位氨基酸殘基、第410-411位氨基酸殘基、第444-445位氨基酸殘基、第478-479位氨基酸殘基、第512-513位氨基酸殘基和第546-547位氨基酸殘基。2.如權(quán)利要求I所述的多肽對(duì)，其特征在于所述多肽甲如序列表的序列3所示；所述多肽乙如序列表的序列5所示。3.一對(duì)DNA分子，由編碼權(quán)利要求I中的所述多肽甲的DNA分子甲和編碼權(quán)利要求I中的所述多肽乙的DNA分子乙組成。4.如權(quán)利要求3所述的一對(duì)DNA分子，其特征在于所述DNA分子甲中，編碼所述多肽甲的16個(gè)雙連氨基酸的核苷酸依次如下序列表的序列2自5’末端第4-9位核苷酸、第106-111位核苷酸、第208-213位核苷酸、第310-315位核苷酸、第412-417位核苷酸、第514-519位核苷酸、第616-621位核苷酸、第718-723位核苷酸、第820-825位核苷酸、第922-927位核苷酸、第1024-1029位核苷酸、第1126-1131位核苷酸、第1228-1233位核苷酸、第1330-1335位核苷酸、第1432-1437位核苷酸和第1534-1539位核苷酸。所述DNA分子乙中，編碼所述多肽乙的17個(gè)雙連氨基酸的核苷酸依次如下序列表的序列4自5’末端第4-9位核苷酸、第106-111位核苷酸、第208-213位核苷酸、第310-315位核苷酸、第412-417位核苷酸、第514-519位核苷酸、第616-621位核苷酸、第718-723位核苷酸、第820-825位核苷酸、第922-927位核苷酸、第1024-1029位核苷酸、第1126-1131位核苷酸、第1228-1233位核苷酸、第1330-1335位核苷酸、第1432-1437位核苷酸、第1534-1539位核苷酸和第1636-1641位核苷酸。5.如權(quán)利要求4所述的一對(duì)DNA分子，其特征在于所述DNA分子甲如序列表的序列2所示；所述DNA分子乙如序列表的序列4所示。6.一對(duì)質(zhì)粒，由質(zhì)粒甲和質(zhì)粒乙組成；所述質(zhì)粒甲為具有權(quán)利要求3或4或5中所述的DNA分子甲的質(zhì)粒；所述質(zhì)粒乙為具有權(quán)利要求3或4或5中所述的質(zhì)粒乙的質(zhì)粒。7.如權(quán)利要求6所述的一對(duì)質(zhì)粒，其特征在于所述質(zhì)粒甲是在PEAS型pCS2-FokI載體的多克隆位點(diǎn)插入所述DNA分子甲得到的重組質(zhì)粒；所述質(zhì)粒乙是在PERR型pCS2-FokI載體的多克隆位點(diǎn)插入所述DNA分子乙得到的重組質(zhì)粒。8.權(quán)利要求I所述的一對(duì)多肽在特異識(shí)別肌肉生長(zhǎng)抑制素基因中的應(yīng)用。9.權(quán)利要求7所述的一對(duì)質(zhì)粒在特異切割肌肉生長(zhǎng)抑制素基因中的應(yīng)用。10.權(quán)利要求7所述的一對(duì)質(zhì)粒在構(gòu)建肌肉生長(zhǎng)抑制素基因突變庫(kù)中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開了一對(duì)特異識(shí)別肌肉生長(zhǎng)抑制素基因的多肽及其編碼基因和應(yīng)用。本發(fā)明提供的多肽對(duì)，由多肽甲和多肽乙組成；多肽甲中雙連氨基酸依次如下序列3的2-3、36-37、70-71、104-105、138-139、172-173、206-207、240-241、274-275、308-309、342-343、376-377、410-411、444-445、478-479和512-513；多肽乙中雙連氨基酸依次如下序列5的2-3、36-37、70-71、104-105、138-139、172-173、206-207、240-241、274-275、308-309、342-343、376-377、410-411、444-445、478-479、512-513和546-547。本發(fā)明提供的多肽對(duì)可以特異識(shí)別肌肉生長(zhǎng)抑制素基因，對(duì)于在豬上對(duì)MSTN進(jìn)行敲除或改造以獲得優(yōu)質(zhì)高瘦肉率的豬種具有重大應(yīng)用價(jià)值。文檔編號(hào)C12N15/63GK102964431SQ20121051089公開日2013年3月13日申請(qǐng)日期2012年12月3日優(yōu)先權(quán)日2012年12月3日發(fā)明者李奎,阮進(jìn)學(xué),吳添文,劉楠,楊述林,牟玉蓮申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所