專利名稱：一種用固定化酶生產(chǎn)糖基化葛根素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及糖基化葛根素的制備，具體地說是一種用固定化酶生產(chǎn)糖基化葛根素的方法。
背景技術(shù)：
葛根素(puerarin),8-C- β -D-葡萄糖基-7，4' 二輕基-異黃酮(8-C- β -D-Glucopyranosyl-7, 4' -hydroxy-1soflavone)。葛根素毒性小、安全范圍廣、療效好，具有廣泛的 藥理作用，臨床上主要應(yīng)用于心腦血管系統(tǒng)疾病、糖尿病、眼底疾病、突發(fā)性耳聾、急性酒精中毒、擬菊酯類農(nóng)藥中毒及腫瘤的治療。但是臨床使用中葛根素存在如下缺點(diǎn)(1)體內(nèi)消除速率快，臨床使用劑量較大，口服生物利用度低；(2)葛根素水溶解度低，僅為6. 24g/L，因此臨床使用的注射劑中需加入助溶劑，以提高溶解度。因此對葛根素進(jìn)行修飾改造，改善其水溶性和脂溶性，提高其生物利用度及選擇性，最終增強(qiáng)其藥理活性，是一種行之有效的開發(fā)新藥途徑，也是當(dāng)前葛根素研究的熱點(diǎn)。研究表明，氧化微桿菌(Microbacterium oxydans CGMCC 1788)通過靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化或細(xì)胞粗酶提取液轉(zhuǎn)化，可以將葛根素轉(zhuǎn)化為葛根素-7-0-葡萄糖苷。與葛根素相比，葛根素-7-0-葡萄糖苷水溶解度提高18倍，有較長的半衰期及平均滯留時間，能在血液中維持較高的血藥濃度，舒張血管作用也略優(yōu)于天然葛根素。同時，采用TritonX-100處理氧化微桿菌，破壞其細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，增加細(xì)胞滲透性，可以將葛根素轉(zhuǎn)化為葛根素-7-0-果糖苷。但是由于細(xì)胞膜的屏障作用，靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化積累產(chǎn)物耗費(fèi)的時間較長，副產(chǎn)物較多；細(xì)胞反復(fù)回收利用，細(xì)胞逐漸自溶，轉(zhuǎn)化活性降低，不利于規(guī)?；a(chǎn)；細(xì)胞粗酶提取液在反應(yīng)過程中極易受pH、溫度等外界環(huán)境影響而變性失活；粗酶提取液不能回收再利用，也不易長期保存；酶純化過程異常復(fù)雜繁瑣，耗時長、得率低；因此細(xì)胞轉(zhuǎn)化和細(xì)胞粗酶提取液轉(zhuǎn)化效率低，周期長，不利于工業(yè)化生產(chǎn)。固定化酶將為工業(yè)化生產(chǎn)糖基化葛根素提供新技術(shù)。固定化酶是指固定在適合載體上并在一定空間范圍內(nèi)能連續(xù)進(jìn)行催化反應(yīng)的酶。固定化酶不僅保持了酶的催化特性，而且克服了游離酶的不足，具有增加酶的穩(wěn)定性，酶可反復(fù)或連續(xù)使用以及酶和反應(yīng)產(chǎn)物易于分離的優(yōu)點(diǎn)，因而效率高、成本低。自從20世紀(jì)60年代日本首次固定化氨基酰化酶工業(yè)化連續(xù)生產(chǎn)L-氨基酸以來，固定化酶技術(shù)為酶的工業(yè)化運(yùn)用開辟了廣闊的發(fā)展空間。但至今，固定化酶在生產(chǎn)糖基化葛根素方面的應(yīng)用尚未見相關(guān)專利和報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種酶可以回收并重復(fù)利用的用固定化酶轉(zhuǎn)化葛根素生產(chǎn)糖基化葛根素的方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為用固定化酶生產(chǎn)糖基化葛根素包括如下操作步驟(I)粗酶液的制備
將氧化微桿菌(Microbacteriumoxydans CGMCC 1788)培養(yǎng)至 OD6tltlL O—3. O,離心收集菌體，加預(yù)冷PH8. O的磷酸緩沖液重懸，破碎兩次，離心得粗酶液。測定粗酶液蛋白濃度。
所述菌種培養(yǎng)過程為將菌種劃線于LB平板，30°C培養(yǎng)至出現(xiàn)單菌落，用牙簽挑取單菌落于種子培養(yǎng)基(20mL LB/100mL錐形瓶)，30°C、220rpm振蕩培養(yǎng)24h，以1%的接種量接入擴(kuò)大培養(yǎng)基(IL LB/3L錐形瓶)，30°C、220rpm培養(yǎng)12h ；
所述菌液離心條件為8000rpm，4°C，離心lOmin。菌體破碎后離心條件為 8000-12000rpm，O-1OO，離心 10_30min ；
所述蛋白濃度測定方法為bradford法(1970)。
(2)固定化酶的制備
稱取一定量纖維素，預(yù)處理后與粗酶液于磷酸緩沖液中進(jìn)行反應(yīng)，使酶固定在纖維素表面，制備得到固定化酶，測定其活力。
所述纖維素為DEAE—纖維素、CM—纖維素或DEAE—纖維素與戊二醛交聯(lián)載體。預(yù)處理方法分別為=DEAE-纖維素預(yù)處理，加入適量去離子水浸泡攪拌過夜后，經(jīng)布氏漏斗抽濾掉去離子水。加入適量0. 5mol/L HCl處理Ih后，抽濾掉多余HC1，去 離子水反復(fù)清洗至中性。隨后加入適量0. 5mol/LNa0H處理Ih后，抽濾掉多余NaOH，去離子水反復(fù)清洗至中性； CM-纖維素預(yù)處理，加入適量去離子水浸泡攪拌過夜后，經(jīng)布氏漏斗抽濾掉去離子水。加入適量0. 5mol/L NaOH處理Ih后，抽濾掉多余NaOH，去離子水反復(fù)清洗至中性。隨后加入適量 0. 5mol/L HCl處理Ih后，抽濾掉多余HC1，去離子水反復(fù)清洗至中性；稱取0. 5g DEAE-纖維素，加入25ml戊二醛(濃度分別為1%、3%、6%)，于30°C、220rpm下交聯(lián)6h。離心去除上清， 并用去離子水反復(fù)清洗至無戊二醛殘留，去除多余去離子水，制得交聯(lián)載體；
所述反應(yīng)條件為ρΗ3·0-8·0，反應(yīng)溫度0-25°C，反應(yīng)時間2_12h，酶的量為2_15mg 酶/g濕重纖維素；
所述酶活力測定方法如下
游離酶活力測定5ml游離酶中加入5ml濃度為8mg/ml葛根素轉(zhuǎn)化液(ρΗ8· 0)，于 30°C、220rpm下反應(yīng)12h，HPLC分析測定酶活。
固定化酶活力測定固定化酶中加入IOml濃度為4mg/ml葛根素轉(zhuǎn)化液(pH8. 0), 于30°C、220rpm下反應(yīng)12h，HPLC分析測定酶活。
+ 粗_活力-上清中酶活力-洗液中酶活力 W 疋化率=-1! *-X100
,丁固定化_總活力ιηΛ活力_收牟=加入酶總活力1X100
固定化酶相對活力是指在同組試驗(yàn)中以活性最高的為100，其余固定化酶之比值，以百分?jǐn)?shù)表示。酶活力定義每小時催化產(chǎn)生Iumol糖基化葛根素所需酶量定義為一個酶活力單位(IU)。
(3)糖基化葛根素的制備
在攪拌條件下，將葛根素溶于緩沖液中，與步驟(2)制備的固定化酶進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)，處理轉(zhuǎn)化液。
所述轉(zhuǎn)化反應(yīng)體系的條件為pH3. 0-8. 0，溫度5_50°C，時間1_24小時；所述轉(zhuǎn)化液處理方法為轉(zhuǎn)化液于8000rpm下離心lOmin，取上清，100°C恒溫加熱IOmin后，于12000rpm下離心IOmin,取上清。(4)糖基化葛根素的純化 采用普通濕法裝柱，將預(yù)處理好大孔樹脂填充至層析柱。將步驟(3)制備的轉(zhuǎn)化液經(jīng)層析系統(tǒng)分離，洗脫液經(jīng)HPLC檢測，將糖基化葛根素檢測純度大于95%的洗脫液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，再經(jīng)冷凍干燥獲得高純度的糖基化葛根素。所述大孔樹脂預(yù)處理過程為層析柱內(nèi)加入相當(dāng)于裝填樹脂體積O. Γ0. 5倍的乙醇或甲醇，然后將新樹脂投入層析柱中。使其液面高于樹脂層約O. 3m處，并浸泡24h。用兩倍體積的乙醇或甲醇，以2倍體積/小時的流速通過樹脂層，并浸泡4 5h。用乙醇或甲醇，以2倍體積/小時的流速通過樹脂層，洗至流出液加水不呈白色混濁止。并以水以同樣流速洗凈乙醇或甲醇。用2倍體積的5%HC1溶液，以4 6倍體積/小時的流速通過樹脂層，并浸泡2 4小時，而后用水以同樣流速洗至出水pH中性。用2倍體積的2%NaOH溶液，以4飛倍體積/小時的流速通過樹脂層，并浸泡2 4小時，而后用水以同樣流速洗至出水pH中性；所述HPLC檢測條件采用Agilent 1100高效液相色譜儀，色譜柱為AgilentHC-C18柱(250X4. 6 μ m，5 μ m)，柱溫為室溫；進(jìn)樣體積為20 μ L ;檢測器為AgilentG1314A紫外檢測器，波長為254nm，；流動相A :經(jīng)O. 22 μ m微孔濾膜過濾的雙蒸水，加入O. 1% (v/v)色譜級乙酸，B :色譜級甲醇，A:B=70:30 ;流速lmL/min ;數(shù)據(jù)處理在AgilentChemStation 上完成。本發(fā)明同菌體靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化或游離酶轉(zhuǎn)化生產(chǎn)糖基化葛根素相比較，具有如下優(yōu)
占-
^ \\\ ·1.采用本發(fā)明的固定化技術(shù)，酶的固定化率和活力回收率高，固定化酶穩(wěn)定性好。2.固定化酶可以重復(fù)使用，降低糖基化葛根素生產(chǎn)成本。3.固定化酶反應(yīng)過程中，副產(chǎn)物少，產(chǎn)品易于分離。4.固定化酶反應(yīng)過程操作簡便，可選擇多種反應(yīng)方式，有利于實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。
具體實(shí)施例方式下面通過實(shí)例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。實(shí)施例1:DEAE—纖維素固定葛根素糖基化酶生產(chǎn)糖基化葛根素步驟1:粗酶液的制備將氧化微桿菌(Microbacteriumoxydans)CGMCC 1788 (購于 CGMCC):將菌種劃線于LB平板，30°C培養(yǎng)至出現(xiàn)單菌落；用牙簽挑取單菌落于種子培養(yǎng)基(20mL LB/100mL錐形瓶)，30°C、220rpm振蕩培養(yǎng)24h ;以1%的接種量接入擴(kuò)大培養(yǎng)基(IL LB/3L錐形瓶)，30°C、220rpm培養(yǎng)12h,測OD600L O一3. O ;離心收集菌體，離心條件為8000rpm, 4°C,離心IOmin ；加預(yù)冷pH8. O的磷酸緩沖液重懸，破碎兩次，離心得粗酶液，離心條件為8000-12000rpm，0_10°C,離心10_30min ；bradford (1970)法測定粗酶液蛋白濃度。步驟2 :DEAE—纖維素固定葛根素糖基化酶稱取一定量DEAE—纖維素，加入適量去離子水浸泡攪拌過夜后，經(jīng)布氏漏斗抽濾掉去離子水。加入適量0. 5mol/L HCl處理Ih后，抽濾掉多余HC1，去離子水反復(fù)清洗至中性。隨后加入適量O. 5mol/LNa0H處理Ih后，抽濾掉多余NaOH，去離子水反復(fù)清洗至中性； 將預(yù)處理的DEAE—纖維素與粗酶液于磷酸緩沖液中進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件為pH3. 0-8. O,反應(yīng)溫度0-25°C，反應(yīng)時間2-12h，酶的量為2-15mg酶/g濕重纖維素，使酶固定在纖維素表面，制備得到固定化酶。固定化率91. 25%，酶活力回收率54. 8%。
步驟3 :糖基化葛根素的制備
在攪拌條件下，將12g葛根素溶于3LpH7. O磷酸緩沖液中，與步驟(2)制備的50g 固定化酶在5L發(fā)酵罐中進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)，反應(yīng)體系的條件為pH3. 0-8. 0，溫度5-50°C，時間 1-24小時；轉(zhuǎn)化液于8000rpm下離心lOmin，取上清，100°C恒溫加熱IOmin后，于12000rpm 下離心IOmin,取上清。
轉(zhuǎn)化反應(yīng)完成后,過濾,用pH7. O磷酸緩沖液清洗固定化酶2次,重新將該固定化酶投入發(fā)酵罐中進(jìn)行上述反應(yīng)，共重復(fù)進(jìn)行15次反應(yīng)，固定化酶活性仍保留70%以上。
步驟4 :糖基化葛根素的純化
層析柱內(nèi)加入相當(dāng)于裝填樹脂體積O. Γ0. 5倍的乙醇或甲醇，然后將AB-8型樹脂投入層析柱中。使其液面高于樹脂層約O. 3m處，并浸泡24h。用兩倍體積的乙醇或甲醇，以 2倍體積/小時的流速通過樹脂層，并浸泡4 5h。用乙醇或甲醇，以2倍體積/小時的流速通過樹脂層，洗至流出液加水不呈白色混濁止。并以水以同樣流速洗凈乙醇或甲醇。用2 倍體積的5%HC1溶液，以4飛倍體積/小時的流速通過樹脂層，并浸泡2 4小時，而后用水以同樣流速洗至出水pH中性。用2倍體積的2%Na0H溶液，以4飛倍體積/小時的流速通過樹脂層，并浸泡2 4小時，而后用水以同樣流速洗至出水pH中性。
將步驟(3)制備的轉(zhuǎn)化液經(jīng)層析系統(tǒng)分離，洗脫液經(jīng)HPLC檢測，HPLC檢測條件 采用AgilentllOO高效液相色譜儀,色譜柱為Agilent HC-C18柱(250X4. 6μηι,5μηι),柱溫為室溫；進(jìn)樣體積為20 μ L ;檢測器為AgilentG1314A紫外檢測器，波長為254nm，；流動相A :經(jīng)O. 22 μ m微孔濾膜過濾的雙蒸水，加入O. 1%0 (v/v)色譜級乙酸，B :色譜級甲醇， A:B=70:30 ;流速lmL/min ;數(shù)據(jù)處理在Agilent ChemS tation上完成；將糖基化葛根素檢測純度大于95%的洗脫液經(jīng)減壓真空濃縮，再經(jīng)冷凍干燥獲得純度97. 67%的糖基化葛根素 5. 12g。
實(shí)施例2 :CM—纖維素固定葛根素糖基化酶生產(chǎn)糖基化葛根素
稱取一定量CM-纖維素，加入適量去離子水浸泡攪拌過夜后，經(jīng)布氏漏斗抽濾掉去離子水。加入適量O. 5mol/LNa0H處理Ih后，抽濾掉多余NaOH，去離子水反復(fù)清洗至中性。隨后加入適量O. 5mol/LHCl處理Ih后，抽濾掉多余HC1，去離子水反復(fù)清洗至中性。
其它步驟同實(shí)施例1。
CM—纖維素固定化酶的固定化率為88. 39%，酶活力回收率45. 26%。
實(shí)施例3 =DEAE-纖維素與戊二醛交聯(lián)載體固定葛根素糖基化酶生產(chǎn)糖基化葛根素
稱取O. 5g DEAE-纖維素,加入25ml 6%戍二醒，于30°C、220rpm下交聯(lián)6h。離心去除上清，并用去離子水反復(fù)清洗至無戊二醛殘留，去除多余去離子水，制得交聯(lián)載體。
其它步驟同實(shí)施例1。
DEAE-纖維素與戊二醛交聯(lián)載體固定化酶的固定化率為85. 33%，酶活力回收率 40. 83%。
權(quán)利要求
1.一種用固定化酶生產(chǎn)糖基化葛根素的方法，其特征在于包括如下步驟(1)粗酶液的制備將氧化微桿菌(IicroAacieri應(yīng) oxydans ) CGMCC 1788 培養(yǎng)至 0D_1. O一3. O,離心收集菌體，加預(yù)冷PH8. O的磷酸緩沖液重懸，破碎兩次，離心得粗酶液；(2)固定化酶的制備稱取一定量纖維素，預(yù)處理后與粗酶液于磷酸緩沖液中進(jìn)行反應(yīng)，使酶固定在纖維素表面，制備得到固定化酶；(3)糖基化葛根素的制備在攪拌條件下，將葛根素溶于緩沖液中，與步驟(2)制備的固定化酶進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)，反應(yīng)體系的pH為3. 0-8. 0，溫度5-50°C，時間1-24小時，即制得含糖基化葛根素的轉(zhuǎn)化液；(4)糖基化葛根素的純化采用濕法裝柱，將預(yù)處理好大孔樹脂填充至層析柱，將步驟(3 )制備的轉(zhuǎn)化液經(jīng)層析系統(tǒng)分離，洗脫液經(jīng)HPLC分析測定，將糖基化葛根素純度大于95%的洗脫液濃縮，再經(jīng)冷凍干燥獲得高純度的糖基化葛根素。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用固定化酶生產(chǎn)糖基化葛根素的方法，其特征在于所述步驟(2)是稱取一定量纖維素，加入去離子水浸泡過夜，抽濾掉去離子水，加入O. 5mol/ LHCl處理后，抽濾掉多余HC1，去離子水反復(fù)清洗至中性；隨后加入O. 5mol/L NaOH處理Ih 后，抽濾掉多余NaOH，去離子水反復(fù)清洗至中性；將粗酶與預(yù)處理的纖維素于磷酸緩沖液中進(jìn)行反應(yīng)，使酶固定在纖維素表面，反應(yīng)體系的PH為3. 0-8. O,反應(yīng)溫度0-25°C，反應(yīng)時間2-12h，酶的量為2-15mg酶/g濕重纖維素。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用固定化酶生產(chǎn)糖基化葛根素的方法，其特征在于所述纖維素為CM—纖維素、DEAE一纖維素或DEAE—纖維素與戍二醒交聯(lián)載體。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用固定化酶生產(chǎn)糖基化葛根素的方法，其特征在于所述固定化酶轉(zhuǎn)化反應(yīng)為在發(fā)酵罐中進(jìn)行間隙或連續(xù)攪拌反應(yīng)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用固定化酶生產(chǎn)糖基化葛根素的方法，其特征在于所述糖基化葛根素為葛根素-7-0-果糖苷或葛根素-7-0-葡萄糖苷。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用固定化酶生產(chǎn)糖基化葛根素的方法，其特征在于所述步驟(3)緩沖液為磷酸緩沖液或Tris緩沖液。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用固定化酶生產(chǎn)糖基化葛根素的方法，其特征在于所述大孔樹脂為AB - 8型、DM - 130型、LSA - 10型或LSA - 20型。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用固定化酶生產(chǎn)糖基化葛根素的方法，其特征在于所述層析系統(tǒng)為雙柱串聯(lián)層析系統(tǒng)或超長兩段層析柱分離系統(tǒng)。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用固定化酶生產(chǎn)糖基化葛根素的方法，其特征在于所述濃縮方法為旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮或減壓真空濃縮。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用固定化酶生產(chǎn)糖基化葛根素的方法，步驟如下1)粗酶的制備將菌體經(jīng)高壓破碎，離心得粗酶液；2)固定化酶的制備將粗酶與預(yù)處理的纖維素于磷酸緩沖液中反應(yīng)，使酶固定在纖維素表面，酶的量為2-15mg酶/g濕重纖維素；3)糖基化葛根素的制備在攪拌條件下，將溶于反應(yīng)介質(zhì)中的葛根素與固定化酶進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)，反應(yīng)體系的ph為3.0-8.0，溫度5-50℃，時間1-24小時；4)糖基化葛根素的純化將轉(zhuǎn)化液經(jīng)雙柱串聯(lián)層析分離，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，冷凍干燥，制得糖基化葛根素；反應(yīng)結(jié)束后，過濾回收固定化酶。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)為成本低，轉(zhuǎn)化副產(chǎn)物少，固定化酶可重復(fù)利用，適應(yīng)于規(guī)模化生產(chǎn)。
文檔編號C12R1/01GK102994594SQ201210512348
公開日2013年3月27日 申請日期2012年12月4日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月4日
發(fā)明者劉貴友, 袁生, 孫磊, 封建樹, 黃國棟, 崔沂, 陸舟, 沈嬌嬌, 武秀秀 申請人:南京師范大學(xué), 江蘇教育學(xué)院