專利名稱：一種仲丁醇耐受菌株及其篩選方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及仲丁醇耐受菌株，尤其是一種仲丁醇耐受菌株及其篩選方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
仲丁醇有很多用途，可以作為工業(yè)溶劑、乳化劑、染料、分散劑、脫水劑、脫漆劑和工業(yè)洗滌劑。另外，仲丁醇也可作為提高汽油辛烷值的組分、增塑劑、選礦劑和除草劑。工業(yè)上大規(guī)模生產(chǎn)仲丁醇主要依靠I- 丁烯和2- 丁烯的水合法來生產(chǎn)。目前仲丁醇的產(chǎn)量達到90萬噸/年，而生產(chǎn)廠家主要集中于歐洲和美國。仲丁醇不能直接用發(fā)酵法來生產(chǎn)，生產(chǎn)方法主要是化學(xué)法首先，碳源經(jīng)過一系列 的代謝途徑轉(zhuǎn)化為2，3-丁二醇；其次，2，3-丁二醇在酶的作用下脫水生成甲乙酮(MEK);最后，甲乙酮通過氫化反應(yīng)轉(zhuǎn)化為仲丁醇。據(jù)報道，一些乳酸桿菌能夠利用2，3-丁二醇生產(chǎn)仲丁醇。然而，目前仍未發(fā)現(xiàn)在細菌中存在仲丁醇合成的基因和生物化學(xué)方面的證據(jù)，在自然界的微生物中并沒有發(fā)現(xiàn)仲丁醇的合成途徑。通過檢索，并未發(fā)現(xiàn)與本專利申請相關(guān)的專利公開文獻。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，提供了一種具有較高的仲丁醇耐受能力及較強的仲丁醇降解能力的仲丁醇耐受菌株，該菌株可應(yīng)用于構(gòu)建產(chǎn)仲丁醇工程菌株和仲丁醇污染的生物修復(fù)；也提供了一種從自然界中富集和分離耐受和降解仲丁醇菌株的篩選方法。本發(fā)明實現(xiàn)目的的技術(shù)方案如下一種仲丁醇耐受菌株，名稱為S-2,分類名稱為Lysinibacillus fusiformis,保藏編號為=CGMCC No. 6769，保藏日期2012年11月2日，保藏地址為北京市朝陽區(qū)大屯路中國科學(xué)院微生物研究所，保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。如上所述的仲丁醇耐受菌株在構(gòu)建產(chǎn)仲丁醇工程菌株中的應(yīng)用。如上所述的仲丁醇耐受菌株在仲丁醇污染的生物修復(fù)中的應(yīng)用。如上所述的仲丁醇耐受菌株的篩選方法，從不同環(huán)境樣品中，通過含有不同濃度仲丁醇的富集培養(yǎng)基及耐受培養(yǎng)基進行篩選，并使用菌株的相對生長率作為指標篩選仲丁醇耐受菌株。而且，所述仲丁醇耐受菌株的篩選方法，具體步驟如下⑴從不同生態(tài)環(huán)境中采集樣品得不同環(huán)境樣品；⑵仲丁醇耐受菌株的富集與分離將不同環(huán)境樣品混合后使用生理鹽水充分溶解，取上清液置于含有仲丁醇的富集培養(yǎng)基中在搖床上恒溫培養(yǎng)后，吸取部分上清液重新置于新鮮的富集培養(yǎng)基中，如此重復(fù)三代；取富集后的菌懸液涂布在含有仲丁醇的固體富集培養(yǎng)基上培養(yǎng)，分離單菌落，得分離菌株；⑶篩選菌株的耐受性分析將分離菌株分別接種到含有仲丁醇的耐受培養(yǎng)基中，以不含仲丁醇的作為對照，培養(yǎng)24 h，用分光光度計在600 nm波長下測每株菌的菌體密度，并計算菌體的相對生長率，相對生長率達到0.29 g/(L*h)以上的菌株即為仲丁醇耐受菌株。
而且，所述不同環(huán)境樣品為山東或河北或天津地區(qū)的土壤、污泥、沼氣池、臭水溝或海水。而且，所述富集培養(yǎng)基為=KH2PO40. 5 g/L，K2HPO4 0. 5 g/L，F(xiàn)eSO4 7H20 0. 01 g/L，MgSO4 0.2 g/L, NaCl 9g/L，酵母粉 5 g/L，葡萄糖 30 g/L，仲丁醇 5 g/L, pH 7.0，IX IO5Pa、115 °C，滅菌 20 min ；所述耐受培養(yǎng)基為NaCl 10 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，質(zhì)量濃度分別為
0.5% 或 1% 或 I. 5% 的仲丁醇，pH 7. 0,1 X IO5 Pa、121 ° C，滅菌 20 min。而且，還包括對篩選所得仲丁醇耐受菌株進行降解性分析。而且，所述對篩選所得仲丁醇耐受菌株進行降解性分析的步驟如下將分離的菌株分別接種到含有不同濃度仲丁醇的LB培養(yǎng)基和基本培養(yǎng)基上，對照組為接入與菌體量相等的生理鹽水，培養(yǎng)24小時后，檢測發(fā)酵液及對照組的仲丁醇剩余量，計算得菌株對仲丁醇的降解率。而且，還包括對篩選所得仲丁醇耐受菌株進行菌種鑒定，步驟如下⑴DNA提取方法苯酚-氯仿-異戊醇法抽提；(2) 16S rRNA 引物正向引物=SEQ NO. 1，反向引物=SEQ NO. 2 ；(3) PCR 反應(yīng)體系10 X Reaction Buffer 5. 0 U L,NTP 2. 5 mmol/L 4. 0 U L,正向引物10 uMol/L I. 0 U L,反向引物10 uMol/L I. Ou L,aq 聚合酶 5 U/ ii L 0.8 U L,DMSO I u L,模版DNA 50 ng/ U L 2. 0 U L,補加重蒸水至50 u L ；(4)卩0 擴增程序94°0 5 min ；94°C 40s ；51°C 2 min ；72°C 3 min 30 個循環(huán);72°C 15 min ；4°C 2 h ；(5)數(shù)據(jù)處理凝膠純化PCR，使用NCBI Blast分析分離菌株的同源性，并使用Ribosomal Database Project II 軟件 Classifier,對分離的菌株進行分類。本發(fā)明取得的優(yōu)點和有益效果是I、本發(fā)明仲丁醇耐受菌株耐受仲丁醇能力強，在仲丁醇為15 g/L的情況下仍然生長良好，與沒有加仲丁醇的菌相比，其相對生長率分別為0. 58 g/(L -h)，因此可以應(yīng)用于通過代謝工程和基因工程來構(gòu)建產(chǎn)仲丁醇工程菌株，進而通過微生物發(fā)酵法來生產(chǎn)仲丁醇，彌補了目前仍未發(fā)現(xiàn)在細菌中存在仲丁醇合成的基因和生物化學(xué)方面的證據(jù)，在自然界的微生物中并沒有發(fā)現(xiàn)仲丁醇的合成途徑的缺陷；同時，由于該仲丁醇耐受菌株具有較強的仲丁醇降解能力，因此，也可應(yīng)用于仲丁醇污染的生物修復(fù)。2、本發(fā)明仲丁醇耐受菌株的篩選方法主要利用在富集培養(yǎng)基和選擇性培養(yǎng)基上來富集和分離菌株，通過16S rRNA鑒定菌株，并且通過計算相對生長率和降解率以及分析降解仲丁醇的酶活力來檢測篩選菌對仲丁醇的耐受和降解能力，工藝相對簡單，篩選菌株準確，為微生物發(fā)酵法生產(chǎn)仲丁醇提供了新思路。


圖I為本發(fā)明篩選方法篩選出的30株耐受菌株的相對生長率圖；其中，A :在0. 5%仲丁醇濃度下30株耐受菌株的相對生長率圖；B :在I. 0%仲丁醇濃度下30株耐受菌株的相對生長率圖；·C :在I. 5%仲丁醇濃度下30株耐受菌株的相對生長率圖；圖2為本發(fā)明30株分離菌株在不同培養(yǎng)基中對仲丁醇的降解率圖；其中，A :在LB培養(yǎng)基中30株分離菌的降解率圖；B :在基本培養(yǎng)基中30株分離菌的降解率圖；圖3為本發(fā)明部分分離菌株的全基因組電泳圖；圖4為本發(fā)明PCR方法擴增部分分離菌株16S rRNA基因片段電泳圖；圖5為本發(fā)明部分分尚菌株發(fā)育樹的構(gòu)建圖。
具體實施例方式下面通過具體實施例對本發(fā)明作進一步詳述，以下實施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本發(fā)明的保護范圍。需要說明的是從不同地域的不同生態(tài)環(huán)境中分離得到的微生物，其耐受仲丁醇能力不同，采用相對生長率來分析篩選菌株對仲丁醇的耐受情況，從而篩選出耐受較強的微生物。另外，本發(fā)明也通過測篩選菌對仲丁醇的降解率來分析菌株對仲丁醇的降解能力。一種仲丁醇耐受菌株，名稱為S-2,分類名稱為Lysinibacillus fusiformis,保藏編號為=CGMCC No. 6769，保藏日期2012年11月2日，保藏地址為北京市朝陽區(qū)大屯路中國科學(xué)院微生物研究所，保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。一種仲丁醇耐受菌株的篩選方法，步驟如下I、從山東、河北、天津等不同地域(土壤、污泥、沼氣池、臭水溝以及海水等)的生態(tài)環(huán)境中取樣品10余份，保存于無菌的封口袋中，置4°C冰箱中保存?zhèn)溆茫?、耐受仲丁醇菌株的富集和分離將樣品混合后用生理鹽水(質(zhì)量濃度為0. 9%)充分溶解，取上清液置于含有仲丁醇的富集培養(yǎng)基中在搖床上恒溫培養(yǎng)24h后，吸取部分上清液重新置于新鮮的富集培養(yǎng)基中，如此重復(fù)三代；取富集后的菌懸液涂布在含有仲丁醇的固體富集培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h，分離單菌落，得分離菌株；3、菌株對仲丁醇的耐受性分析將分離菌株分別接種到含有仲丁醇的耐受培養(yǎng)基中(不含仲丁醇的作為對照)培養(yǎng)24 h，用分光光度計在600 nm波長下測每株菌的菌體密度(00_值)，并計算菌體的相對生長率來反應(yīng)篩選菌株對仲丁醇的耐受能力；4、菌株對仲丁醇的降解性分析將分離菌株分別接種到含有一定濃度仲丁醇的LB培養(yǎng)基和基本培養(yǎng)基上(對照組為接入與菌體量相等的生理鹽水)，培養(yǎng)24小時后，用氣相色譜Agilent7890A測發(fā)酵液對照組的仲丁醇剩余量，計算可得出菌株對仲丁醇的降解率；微生物對底物的作用實際上是一系列酶促反應(yīng)的結(jié)果，本步驟中分離菌株對仲丁醇的降解作用也是酶促反應(yīng)的結(jié)果，通過產(chǎn)生仲丁醇降解酶來降解仲丁醇。通過測篩選菌株在含有一定含量仲丁醇的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后仲丁醇的剩余量來計算微生物對仲丁醇的降解率間接反映降解酶的酶活大小，進而得知篩選菌株對仲丁醇的降解能力。5、部分分離菌株的菌種鑒定(I)DNA提取方法苯酚-氯仿-異戊醇抽提法。
(2)16S rRNA引物正向引物SEQ NO. I 5 ; -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 ; (E. colibases 8 to 27)，反向引物 SEQ NO. 2 5 ; -TACCTTGTTACGACTT-3 ; (E. coli bases 1507tol492)，由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。(3) PCR 反應(yīng)體系10 X Reaction Buffer 5. 0 y L，dNTP (2. 5 mmol/L)4. 0 u L,正向引物(10 uMol/L) 1.0 UL，反向引物(10 uMol/L) I. 0 yL，Taq 聚合酶(5 U/u L)
0.8 u L, DMSO I yL，模版 DNA (50 ng/u L) 2. 0 U L，補加重蒸水至 50 u L0(4) PCR 擴增程序94°C 5 min ；94 0C 40s ；51°C 2 min ；72°C 3 min 30 個循環(huán)；72° C 15 min ；4°C 2h。(5)數(shù)據(jù)處理凝膠純化PCR，使用NCBI Blast分析分離菌株的同源性，并使用Ribosomal Database Project II軟件 Classifier,對分離的菌株進行分類。本發(fā)明通過該方法從土壤和污泥的混合樣品中可篩選出30株耐受仲丁醇的菌株，其中，菌株S-2、S-9、S-24、S-26耐受高濃度的仲丁醇，菌株S_9、S-13、S-24可以高強度的降解仲丁醇，尤其是菌株S-13在LB培養(yǎng)基上對仲丁醇的降解率高達72. 7%。高強度耐受仲丁醇的菌株可以通過基因工程的方法構(gòu)建產(chǎn)仲丁醇的菌株，而高強度降解仲丁醇的菌株可以應(yīng)用于仲丁醇污染的生物修復(fù)。采用上述方法篩選保藏編號為CGMCC No. 6769的仲丁醇耐受菌株，步驟如下—、耐受仲丁醇菌株的富集和分離所用試劑均為市售分析純或生化試劑；所使用的儀器主要包括恒溫搖床，恒溫培養(yǎng)箱；所用培養(yǎng)基富集培養(yǎng)基=KH2PO40. 5 g/L, K2HPO4 0. 5 g/L, FeSO4 7H20 0. 01 g/L, MgSO4 0. 2g/L, NaCl 9 g/L,酵母粉 5 g/L,葡萄糖 30 g/L, pH 7. 0,1 X IO5 Pa、115° C,滅菌 20 min ；LB 培養(yǎng)基NaCl 10 g/L，蛋白胨 10 g/L，酵母粉 5 g/L, pH 7.0，IX IO5 Pa、121°C，滅菌 20 min。添加適量的仲丁醇作為篩選富集條件。富集和分離步驟如下稱取土樣和污泥共10 g，裝入盛有50 mL無菌生理鹽水(質(zhì)量濃度為0. 9%)的250mL三角瓶中，搖動三角瓶使樣品充分溶解，靜置15 min，取上清液10 mL加入裝有150 mL富集培養(yǎng)基(仲丁醇含量5 g/L)的250 mL三角瓶，在220 rpm、35°C的搖床上恒溫培養(yǎng)24h，取IOmL上清液轉(zhuǎn)接到新的富集培養(yǎng)基(仲丁醇含量5 g/L)，相同條件下培養(yǎng)24 h，如此重復(fù)三代。取富集培養(yǎng)后的菌懸液I mL，梯度稀釋到10_6，取稀釋后的菌懸液150 U L涂布在固體富集培養(yǎng)基(仲丁醇含量5 g/L)上，置于37°C的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h后，分離單菌落并置于甘油管中保存?zhèn)溆?。結(jié)果最終從不同環(huán)境的土壤和污泥樣品中，在富集培養(yǎng)基(仲丁醇濃度5 g/L)上通過菌種的富集共篩選到30株能夠耐受一定濃度的仲丁醇的菌株。二、篩選菌株對仲丁醇的耐受性分析所用試劑均為市售分析純或生化試劑；所使用的儀器主要包括恒溫搖床，恒溫培養(yǎng)箱； 所用培養(yǎng)基LB培養(yǎng)基NaCl 10 g/L，蛋白胨10 g/L，，酵母粉5 g/L, pH 7.0,IXlO5 Pa、121°C，滅菌20 min。添加適量的仲丁醇作為耐受性壓力；檢測方法用分光光度計在600 nm波長下測每株菌的菌體密度(0D_值)，并計算菌體的相對生長率。耐受性分析步驟如下將所篩選到菌接到5mL LB培養(yǎng)基中置于37° C過夜培養(yǎng)，然后將每株菌按5%的接種量分別接種到含不同濃度仲丁醇的液體LB培養(yǎng)基上(仲丁醇質(zhì)量濃度分別為0. 5%, 1%，
I.5%)，將上述試管置于37°C、220 rpm的恒溫搖床上培養(yǎng)24h，然后測量每株菌的OD6tltl ；配含有不同濃度梯度仲丁醇的固體LB培養(yǎng)基，其中仲丁醇的濃度分別為0.5%，1%，I. 5%，每組倒3個板作為平行。將篩選到的菌接到上述固體平板上，置于37° C的恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)48 h,觀察菌的生長情況。觀察結(jié)果在含有不同濃度梯度仲丁醇的LB培養(yǎng)基上30株菌的相對生長率如圖I (A、B、C)所示其中菌株S-2、S-9、S-24和S-26在仲丁醇濃度為15 g/L的情況下仍然生長良好，與沒有加仲丁醇的菌相比，其相對生長率分別為0.58 g/(L h),0. 64 g/(L*h),0. 31 g/(L*h),0. 29 g/(L*h)。其它26株菌的相對生長率都在0. 13 g/(L*h)之下。當仲丁醇濃度為5 g/L和10 g/L時，這30株菌的相對生長率沒有很大變化，從而說明菌株S-2、S-9、S-24、S-26對仲丁醇的耐受能力較強，可以作為耐受菌來單獨研究其代謝機理，也可以用于構(gòu)建產(chǎn)仲丁醇的基因工程菌，從而為微生物發(fā)酵法生產(chǎn)仲丁醇提供了菌種基礎(chǔ)。三、篩選菌株對仲丁醇的降解性分析所用試劑均為市售分析純或生化試劑；所使用的儀器主要包括恒溫搖床，恒溫培養(yǎng)箱；所用培養(yǎng)基LB 培養(yǎng)基NaCl 10 g/L，蛋白胨 10 g/L，酵母粉 5 g/L, pH 7.0，IX IO5 Pa、121°C，滅菌 20 min ；基本培養(yǎng)基KH2PO40. 5 g/L, K2HPO4 0. 5 g/L, FeSO4 7H20 0. 01 g/L, MgSO4 0. 2g/L, NaCl 9 g/L, (NH4)2SO4 5 g/L, pH 7.0，I X IO5 Pa、121° C，滅菌 20 min。添加一定含量的仲丁醇作為菌株的降解底物；檢測方法高效氣相色譜分析法用于測量發(fā)酵液中的仲丁醇的剩余量。采用Agilent7890A高效氣相色譜儀色譜柱為HP-innowax，升溫程序初溫45° C保留I min以8° C /min升至 155° C 保留 I min ;柱流速1 mL/min，進樣口 180° C，檢測器 200° C ;載氣N2 35 mL/min, H2 35 mL/min，空氣 350 mL/min。檢測器FID。用內(nèi)標法(內(nèi)標物為異戊醇)定量測定發(fā)酵液中殘余仲丁醇的量。降解性分析步驟如下將所篩選到菌接到5 mL LB培養(yǎng)基中置于37° C過夜培養(yǎng)，然后每株菌按5%的接種量接到新的LB培養(yǎng)基中(仲丁醇含量為質(zhì)量分數(shù)1%)，同時以相同的接種量將無菌生理鹽水接到上述培養(yǎng)基上，共接3管作為對照，將上述所接所有試管置于220 rpm,37° C的恒溫搖床上培養(yǎng)24 h，以完全相同的操作處理方式處理菌樣和對照組，通過高效氣相色譜分析法測量發(fā)酵液中仲丁醇的剩余量。以與上述相同的實驗方法檢測所篩菌在基本培養(yǎng)基上對仲丁醇的降解能力。結(jié)果結(jié)果如圖2所示在LB培養(yǎng)基和基本培養(yǎng)基上，30株菌對仲丁醇的降解能力各有不同，其中菌株S-2在兩種培養(yǎng)基上對仲丁醇的降解能力都較強，分別為63. 7%和56. 4%，菌株S-26在兩種培養(yǎng)基上也表現(xiàn)出較高的降解能力，降解力分別為54. 1%和21. 4%，而菌株
S-13在LB培養(yǎng)基上的降解能力高達72. 7%，說明菌株S-13在含有碳源的情況下能以一種獨特的代謝方式更高效的降解仲丁醇。四、部分篩選菌株的菌種鑒定所用試劑均為市售分析純或生化試劑；所使用的儀器主要包括恒溫振蕩器，PCR儀；所用的培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基NaCl 10 g/L，蛋白胨 10 g/L，酵母粉 5 g/L，調(diào)pH 7.0后，121°C，滅菌20 min。菌種鑒定步驟如下將分離出來的部分高耐受高強度降解仲丁醇的菌株接種在LB培養(yǎng)基上，過夜培養(yǎng)，待用。按如下操作進行(I)按照苯酚-氯仿-異戊醇抽提法提取菌體DNA，并做電泳驗證，電泳圖如圖3所示。苯酚-氯仿-異戊醇抽提法步驟如下a.、取1.5 mL過夜培養(yǎng)的菌液,離心8000 rpm 5 min后,棄上清；b、沉淀中加入0.5 mL TE緩沖液，10 uL溶菌酶，室溫放置10 min ；C、加入10 ul 20%的SDS和50 ul蛋白酶K，震蕩混勻，于60° C水浴2 h ；d、加入0.6 mL抽提液(苯酹氯仿異戍醇=25:24:1)充分混勻，10000 rpm離心10 min ；e、吸取上清,重復(fù)抽提至無蛋白膜,加等體積氯仿混勻，離心10000 rpm 10 min ；f、吸取上清于新EP管加10%上清體積的3 Mo I/L NaAc和2倍上清體積的95%冷乙醇，震蕩混勻，10000 rpm離心10 min ；g.沉淀中加600 uL 70%乙醇，10000 rpm離心5 min棄上清后室溫干燥,加100uL ddH20，冰箱保存。(2) 16S rRNA引物正向引物SEQ NO. I 5 ; -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 ; (E. colibases 8 to 27)，反向引物 SEQ NO. 2 5 ; -TACCTTGTTACGACTT-3 ; (E. coli bases 1507tol492)0(3) PCR 反應(yīng)體系10 X Reaction Buffer 5.0 u L, dNTP (2.5 mmol/L) 4.0 u L,正向引物(10 uMol/L) 1.0 UL，反向引物(10 uMol/L)l. 0 ii L，Taq 聚合酶(5U/ii L)0. 8U L, DMSO lyL，模版 DNA (50 ng/u L) 2. 0 U L，補加重蒸水至 50 u L0(4)PCR 擴增程序94°C 5 min ；94°C 40s ；51°C 2 min ；72°C 3 min 30 個循環(huán);72°C 15 min ；4°C 2 h。PCR 結(jié)果如圖 4 所示。(5)數(shù)據(jù)處理凝膠純化PCR，使用NCBI Blast分析分離菌株的同源性，并使用Ribosomal Database Project II軟件，對分離的菌株進行分類。 結(jié)果按照上述步驟進行操作分析，結(jié)果如表I所示S_2與Lysinibacillusfusiformis 的同源性達到 100% ;S_9 與 Bacillus aryabhattai 的同源性高達 100% ;S_13與 Arthrobacter Iuteolus 的同源性高達 100% ;S_24 和 S-26 與 Bacillus tequilensis 的同源性高達100%。運用MEGA4. 0軟件，選擇枯草芽孢桿菌168和銅綠假單胞菌PAOl作為參比菌株，構(gòu)建分尚菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹，構(gòu)建的發(fā)育樹如圖5所不。表I部分分離菌株的同源性分析和分類結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種仲丁醇耐受菌株，其特征在于名稱為S-2，分類名稱為Lysinibacillusfusiformis，保藏編號為CGMCC No. 6769，保藏日期2012年11月2日，保藏地址為北京市朝陽區(qū)大屯路中國科學(xué)院微生物研究所，保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。
2.如權(quán)利要求I所述的仲丁醇耐受菌株在構(gòu)建產(chǎn)仲丁醇工程菌株中的應(yīng)用。
3.如權(quán)利要求I所述的仲丁醇耐受菌株在仲丁醇污染的生物修復(fù)中的應(yīng)用。
4.一種如權(quán)利要求I所述的仲丁醇耐受菌株的篩選方法，其特征在于從不同環(huán)境樣品中，通過含有不同濃度仲丁醇的富集培養(yǎng)基及耐受培養(yǎng)基進行篩選，并使用菌株的相對生長率作為指標篩選仲丁醇耐受菌株。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的仲丁醇耐受菌株的篩選方法，其特征在于具體步驟如下 ⑴從不同生態(tài)環(huán)境中采集樣品得不同環(huán)境樣品； ⑵仲丁醇耐受菌株的富集與分離將不同環(huán)境樣品混合后使用生理鹽水充分溶解，取上清液置于含有仲丁醇的富集培養(yǎng)基中在搖床上恒溫培養(yǎng)后，吸取部分上清液重新置于新鮮的富集培養(yǎng)基中，如此重復(fù)三代；取富集后的菌懸液涂布在含有仲丁醇的固體富集培養(yǎng)基上培養(yǎng)，分離單菌落，得分離菌株； ⑶篩選菌株的耐受性分析將分離菌株分別接種到含有仲丁醇的耐受培養(yǎng)基中，以不含仲丁醇的作為對照，培養(yǎng)24 h，用分光光度計在600 nm波長下測每株菌的菌體密度，并計算菌體的相對生長率，相對生長率達到0.29 g/(L*h)以上的菌株即為仲丁醇耐受菌株。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的仲丁醇耐受菌株的篩選方法，其特征在于所述不同環(huán)境樣品為山東或河北或天津地區(qū)的土壤、污泥、沼氣池、臭水溝或海水。
7.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的仲丁醇耐受菌株的篩選方法，其特征在于所述富集培養(yǎng)基為KH2PO4 0.5 g/L, K2HPO4 0.5 g/L，F(xiàn)eSO4 7H20 0. 01 g/L, MgSO4 0.2 g/L, NaCl 9g/L，酵母粉 5 g/L，葡萄糖 30 g/L，仲丁醇 5 g/L, pH 7.0，I X IO5 Pa、115 ° C，滅菌 20 min ； 所述耐受培養(yǎng)基為=NaCl 10 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，質(zhì)量濃度分別為0. 5%或 1% 或 I. 5% 的仲丁醇，pH 7.0，I X IO5 Pa、121 ° C，滅菌 20 min。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的仲丁醇耐受菌株的篩選方法，其特征在于還包括對篩選所得仲丁醇耐受菌株進行降解性分析。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的仲丁醇耐受菌株的篩選方法，其特征在于所述對篩選所得仲丁醇耐受菌株進行降解性分析的步驟如下 將分離的菌株分別接種到含有不同濃度仲丁醇的LB培養(yǎng)基和基本培養(yǎng)基上，對照組為接入與菌體量相等的生理鹽水，培養(yǎng)24小時后，檢測發(fā)酵液及對照組的仲丁醇剩余量，計算得菌株對仲丁醇的降解率。
10.根據(jù)權(quán)利要求5所述的仲丁醇耐受菌株的篩選方法，其特征在于還包括對篩選所得仲丁醇耐受菌株進行菌種鑒定，步驟如下 ⑴DNA提取方法苯酌' -氯仿_異戍醇法抽提； (2)16S rRNA引物正向引物=SEQ NO. 1，反向引物=SEQ NO. 2 ；⑶ PCR 反應(yīng)體系10 X Reaction Buffer 5. 0 u L,dNTP 2. 5 mmol/L 4. 0 u L, 正向引物 10 uMol/L I. 0 u L,反向引物 10 u Mol/L I. Ou L, Taq 聚合酶 5 U/ii L 0.8 U L,DMSO I u L, 模版 DNA 50 ng/u L 2. 0 u L， 補加重蒸水至50 u L ； (4)PCR擴增程序-M0C5 min ；94°C 40s ；51°C 2 min ；72°C 3 min 30個循環(huán)；72°C 15min ；4° C 2 h ； (5)數(shù)據(jù)處理凝膠純化PCR，使用NCBIBlast分析分離菌株的同源性，并使用 Ribosomal Database Project II 軟件 Classifier,對分離的菌株進行分類。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種仲丁醇耐受菌株，名稱為S-2，分類名稱為Lysinibacillus fusiformis，保藏編號為CGMCC No. 6769，保藏日期2012年11月2日，保藏地址為北京市朝陽區(qū)大屯路中國科學(xué)院微生物研究所，保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。本發(fā)明仲丁醇耐受菌株耐受仲丁醇能力強，可以應(yīng)用于通過代謝工程和基因工程來構(gòu)建產(chǎn)仲丁醇工程菌株，進而通過微生物發(fā)酵法來生產(chǎn)仲丁醇，彌補了目前仍未發(fā)現(xiàn)在細菌中存在仲丁醇合成的基因和生物化學(xué)方面的證據(jù)，以及在自然界的微生物中并沒有發(fā)現(xiàn)仲丁醇的合成途徑的缺陷；同時，由于該仲丁醇耐受菌株具有較強的仲丁醇降解能力，因此，也可應(yīng)用于仲丁醇污染的生物修復(fù)。
文檔編號C12N1/20GK102978141SQ20121051241
公開日2013年3月20日 申請日期2012年12月4日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月4日
發(fā)明者楊洪江, 石禮濤 申請人:天津科技大學(xué)