專(zhuān)利名稱(chēng)：一種hiv-1耐藥野生型基因合成方法
一種HIV-1耐藥野生型基因合成方法技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種Hiv-I耐藥野生型基因合成方法及引物。
背景技術(shù)：
基因合成是指在體外人工合成雙鏈DNA分子的技術(shù)，與寡核苷酸合成有所不同 寡核苷酸是單鏈的，所能合成的最長(zhǎng)片段僅為IOOnt左右，而基因合成則為雙鏈DNA分子合成，所能合成的長(zhǎng)度范圍50bp-12 kb。
基因合成是用人工方法合成基因的技術(shù)，是基因獲取的手段之一，相對(duì)于從已有生物中獲取基因來(lái)說(shuō)，基因合成無(wú)需模板，因而不受基因來(lái)源限制。人類(lèi)首條人工合成的基因出現(xiàn)在上世紀(jì)60年代基因合成是當(dāng)前合成生物學(xué)的主要內(nèi)容，通過(guò)基因合成，可以獲得自然界中不存在的基因，為人類(lèi)改造生物開(kāi)辟了一個(gè)全新的方向，在可預(yù)計(jì)的將來(lái)，基因合成將在生命科學(xué)領(lǐng)域發(fā)揮巨大作用，在新能源、新材料、人工生命、核酸疫苗、生物醫(yī)藥[I] 等領(lǐng)域的作用已初步體現(xiàn)?；蚝铣梢泊嬖跐撛诘谋婚_(kāi)發(fā)成生物武器的可能，而這個(gè)可能性在幾個(gè)病毒的人工合成之后變得更加突出。
目前基因合成有兩種途徑，一是向基因合成公司訂制，二是作本地基因合成。由于基因合成技術(shù)還沒(méi)有一個(gè)統(tǒng)一的方法，基因合成的技能和經(jīng)驗(yàn)在合成過(guò)程中具有決定性的影響，所以大部分基因合成都是在專(zhuān)業(yè)人員手中完成的，這也決定了途徑一是目前的主要渠道。本地基因合成一般需要參考學(xué)術(shù)文章，這方面的文章有很多，如Neves F0, Ho PLj Raw I， Pereira CA， Moreira C， Nascimento AL Overexpression of a synthetic gene encoding human alpha interferon in Escherichia coli. Protein Expr Purif. Jun;35(2) :353-9(2004)。但大多只是個(gè)別基因的合成，只具備有限的參考價(jià)值，除非是那些為了研究技術(shù)本身而作的基因合成。HIV-I因其為RNA病毒，具有高突變特性。HIV病毒基因突變使藥物作用靶點(diǎn)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，導(dǎo)致病毒對(duì)藥物不敏感或敏感性下降。因各種類(lèi)型HIV耐藥相關(guān)的基因突變不斷發(fā)生，因此如何準(zhǔn)確測(cè)定耐藥基因尤為重要。而一般的分子實(shí)驗(yàn)室因條件及級(jí)別的限定，都是不能直接做艾滋病毒的實(shí)驗(yàn)，換而言之，就無(wú)法直接從艾滋病毒中獲得藥物作用的靶點(diǎn)基因，只能通過(guò)實(shí)驗(yàn)室人工合成耐藥突變模板，進(jìn)行下一步的實(shí)驗(yàn)。大部分的實(shí)驗(yàn)室主要是通過(guò)公司來(lái)合成較長(zhǎng)的目的片段，因此，需要一種可以在實(shí)驗(yàn)室方法來(lái)合成想要的片段。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的第一方面的問(wèn)題在于克服現(xiàn)有技術(shù)中HIV-I耐藥野生型基因合成困難的問(wèn)題，提供一種步驟簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確、成本低的HIV-I耐藥野生型基因合成方法及引物。
為了解決上述的第一方面的技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為一種HIV-I耐藥野生型基因合成方法，其特征在于，包括如下步驟(1)把HIV-I耐藥野生型基因，分成若干N段(n=20-40)的A堿基片段，即Al，A2， A3，A4，A5…An,并進(jìn)行人工合成；設(shè)計(jì)并人工合成與上述片段互補(bǔ)的N-I堿基片段，即B1，B2，B3，B4…Bn-I ;其中，任一 Bn堿基片段的5’端比各耐藥野生型基因片段的An堿基片段5’端后移20_25bp ;Bn堿基片段的端延伸到耐藥野生型基因片段的An+1堿基片段5’端20-25bp ；根據(jù)上述相互匹配的兩兩對(duì)應(yīng)互補(bǔ)片段設(shè)計(jì)并合成正向、反向引物；(2)將上述相互對(duì)應(yīng)部分互補(bǔ)的堿基片段分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，即Al/Bl，A2/B2,A3/ B3……An/Bn，使部分互補(bǔ)經(jīng)PCR擴(kuò)增后變?yōu)橥耆パa(bǔ)；(3)再將上述具有互補(bǔ)片段的相鄰擴(kuò)增產(chǎn)物，二次擴(kuò)增；(4)以3個(gè)A堿基片段為單位分別合成167bp片段，并需要進(jìn)行瓊脂糖凝膠的割膠回收純化，標(biāo)記為Cl，C2, C4，C5…Cn/3，最后一個(gè)An片段可與Cn/3連接；(5)再運(yùn)用PCR分別兩兩擴(kuò)增Cl和C2；C3和C4，C5和C6，C7和C8，C9和ClO各可得到 309bp 片段，標(biāo)記為 Dl, D2，D3，D4，D5 ；(6)再運(yùn)用PCR分別兩兩擴(kuò)增Dl和D2，D3和D4可得598bp片段，標(biāo)記為E1，E2，D5跟 E2連接可得F1887bp ；(7)最后將El和Fl進(jìn)行PCR連接就可以得到1508bp的片段；(8)將片段插入TA載體中，并鑒定野生型模板是否構(gòu)建正確。
優(yōu)選地，所述步驟(I)中，把Hiv-I耐藥野生型基因分成31段并進(jìn)行人工合成，每段含有44-49個(gè)堿基，如Seq No. I 31所示；設(shè)計(jì)并人工合成與HIV-I耐藥野生型基因互補(bǔ)的堿基片段30段，每段含40個(gè)堿基， 如Seq No. 32 61所示；根據(jù)上述相互匹配的兩兩對(duì)應(yīng)互補(bǔ)片段設(shè)計(jì)并合成正向、反向引物，如Seq No. 62 101所示。
本發(fā)明中，HIV-I耐藥野生型基因序列來(lái)自GenBank，protein_id=〃AAC82598. 2〃 ；把 HIV-I耐藥野生型基因分成31段，每段含有44-49個(gè)堿基，如Seq No. I 31所示，即堿基序列標(biāo)號(hào)I 31所示的片段。
本發(fā)明中，序列Seq No. 62 91，即堿基序列標(biāo)號(hào)2_1 2_30所示的片段是分別與序列Seq No. 32 61,即堿基序列標(biāo)號(hào)1_1 1_30的片段對(duì)應(yīng)的引物。
本發(fā)明中，序列Seq No. 92 101,即喊基序列標(biāo)號(hào)62、62-4、62-7、62-10、 62-13、62-16、62-19、62-22、62-25、62-28是大量擴(kuò)增各個(gè)3個(gè)片段為單位的正向引物。
本發(fā)明將長(zhǎng)目的片段分段合成，并合成錯(cuò)位互補(bǔ)片段，通過(guò)運(yùn)用多次PCR方法合成所需目的基因片段，這一方法既簡(jiǎn)單又安全，無(wú)需復(fù)雜的設(shè)備，也不需要一個(gè)高度管制的實(shí)驗(yàn)環(huán)境，尤其適用感染性疾病目的基因的研究。本發(fā)明的技術(shù)方案在功能基因組學(xué)等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用，比如，在突變，缺失或嵌合基因編碼一個(gè)特定的蛋白質(zhì)，具有很大的靈活性。
本發(fā)明提供的方法可以穩(wěn)定合成IKB左右的片段。其優(yōu)點(diǎn)有⑴合成周期短，可以保證序列的100%正確無(wú)誤；⑵具有很大的靈活性，可以對(duì)基因的酶切位點(diǎn)和基因序列進(jìn)行修改，方便下游的克隆和實(shí)驗(yàn)；⑶研究人員根據(jù)自己的意愿設(shè)計(jì)得到自然界中很難獲得甚至不存在的基因。


圖I為本發(fā)明的Hiv-I耐藥野生型基因合成方法示意圖。
圖2為Al和A2連接成功的瓊脂糖凝膠電泳圖。
圖3為Al，A2和A3連接成功的瓊脂糖凝膠電泳圖。
圖4A為野生型模板片段跟TA載體連接后的質(zhì)粒，目的片段電泳圖；其中廣4為野生型質(zhì)粒電泳圖，6-10為引物擴(kuò)增電泳圖；圖4B為野生型模板片段跟TA載體連接后的質(zhì)粒酶切電泳圖。
圖5為耐藥突變點(diǎn)M41L (ATG-CTG)野生型測(cè)序圖與突變型測(cè)序圖之間的比較，進(jìn)一步證明HIV-I耐藥野生型基因構(gòu)建成功。
圖6為耐藥突變點(diǎn)K65R ( AAA-AGA)野生型測(cè)序圖與突變型測(cè)序圖之間的比較， 進(jìn)一步證明HIV-I耐藥野生型基因構(gòu)建成功。
圖7為耐藥突變點(diǎn)T69N (ACT-AAT)野生型測(cè)序圖與突變型測(cè)序圖之間的比較，進(jìn)一步證明HIV-I耐藥野生型基因構(gòu)建成功。
圖8為耐藥突變點(diǎn)M184V (ATG-GTG)野生型測(cè)序圖與突變型測(cè)序圖之間的比較，進(jìn)一步證明HIV-I耐藥野生型基因構(gòu)建成功。
圖9為耐藥突變點(diǎn)V75T(GTA_ATA)野生型測(cè)序圖與突變型測(cè)序圖之間的比較，進(jìn)一步證明HIV-I耐藥野生型基因構(gòu)建成功。
圖10為耐藥突變點(diǎn)V82A (GTC-GCC)野生型測(cè)序圖與突變型測(cè)序圖之間的比較，進(jìn)一步證明HIV-I耐藥野生型基因構(gòu)建成功。
圖11為耐藥突變點(diǎn)L90M(TTG-ATG)野生型測(cè)序圖與突變型測(cè)序圖之間的比較，進(jìn)一步證明HIV-I耐藥野生型基因構(gòu)建成功。
具體實(shí)施方式
以下結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)上述方案做進(jìn)一步說(shuō)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例是用于說(shuō)明本發(fā)明而不限于限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中采用的實(shí)施條件可以根據(jù)具體廠家的條件做進(jìn)一步調(diào)整，未注明的實(shí)施條件通常為常規(guī)實(shí)驗(yàn)中的條件。其中，實(shí)驗(yàn)中，使用到的重要試劑、藥品、儀器的廠家及型號(hào)如下所述實(shí)驗(yàn)材料一、主要儀器
權(quán)利要求
1.一種HIV-I耐藥野生型基因合成方法，其特征在于，包括如下步驟 (1)把HIV-I耐藥野生型基因，分成若干N段(n=20-40)的A堿基片段，即Al，A2，A3，A4，A5…An,并進(jìn)行人工合成， 設(shè)計(jì)并人工合成與上述片段互補(bǔ)的N-I堿基片段，即B1，B2，B3，B4…Bn-I ;其中，任一Bn堿基片段的5’端比各耐藥野生型基因片段的An堿基片段5’端后移20_25bp ;Bn堿基片段的端延伸到耐藥野生型基因片段的An+1堿基片段5’端20-25bp， 根據(jù)上述相互匹配的兩兩對(duì)應(yīng)互補(bǔ)片段設(shè)計(jì)并合成正向、反向引物； (2)將上述相互對(duì)應(yīng)部分互補(bǔ)的堿基片段分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，即Al/Bl，A2/B2,A3/B3……An/Bn，由部分互補(bǔ)變?yōu)橥耆パa(bǔ)片段； (3)再將上述具有互補(bǔ)片段的相鄰擴(kuò)增產(chǎn)物，二次擴(kuò)增； (4)以3個(gè)A堿基片段為單位分別合成167bp片段，并需要進(jìn)行瓊脂糖凝膠的割膠回收純化，標(biāo)記為Cl，C2, C4，C5…Cn/3，最后一個(gè)An片段可與Cn/3連接； (5)再運(yùn)用PCR分別兩兩擴(kuò)增Cl和C2；C3和C4，C5和C6，C7和C8，C9和ClO各可得到 309bp 片段，標(biāo)記為 Dl, D2，D3，D4，D5 ； (6)再運(yùn)用PCR分別兩兩擴(kuò)增Dl和D2，D3和D4可得598bp片段，標(biāo)記為E1，E2，D5跟E2連接可得Fl=887bp ； (7)最后將El和Fl進(jìn)行PCR連接就可以得到1508bp的片段； (8)將片段插入TA載體中，并鑒定野生型模板是否構(gòu)建正確。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的HIV-I耐藥野生型基因合成方法，其特征在于， 所述步驟(I)中，把HIV-I耐藥野生型基因分成31段并進(jìn)行人工合成，每段含有44-49個(gè)堿基，如Seq No. I 31所示； 設(shè)計(jì)并人工合成與HIV-I耐藥野生型基因互補(bǔ)的堿基片段30段，每段含40個(gè)堿基，如Seq No. 32 61所示； 根據(jù)上述相互匹配的兩兩對(duì)應(yīng)互補(bǔ)片段設(shè)計(jì)并合成正向、反向引物，如Seq No. 62 101所示。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種HIV-1耐藥野生型基因合成方法,將長(zhǎng)目的片段分段合成，并合成錯(cuò)位互補(bǔ)片段，通過(guò)運(yùn)用多次PCR方法合成所需目的基因片段，這一方法既簡(jiǎn)單又安全，無(wú)需復(fù)雜的設(shè)備，也不需要一個(gè)高度管制的實(shí)驗(yàn)環(huán)境，尤其適用感染性疾病目的基因的研究。本發(fā)明的技術(shù)方案在功能基因組學(xué)等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用，比如，在突變，缺失或嵌合基因編碼一個(gè)特定的蛋白質(zhì)，具有很大的靈活性。
文檔編號(hào)C12N15/10GK102978199SQ20121051487
公開(kāi)日2013年3月20日 申請(qǐng)日期2012年12月4日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月4日
發(fā)明者李凱, 張佳, 季曉英 申請(qǐng)人:蘇州大學(xué)