專利名稱：一種高效降解木質(zhì)纖維素的復合酶系的制備方法及其應用的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及微生物領域，尤其涉及一種高效降解木質(zhì)纖維素的復合酶系的制備方法及其應用。
背景技術(shù)：
隨著不可再生的化石能源的日漸枯竭，越來越多的研究都集中到了新能源的開發(fā)和利用。生物質(zhì)能由于其來源豐富，成本低廉和可再生性而備受青睞。纖維素作為地球上最為豐富的可再生資源，為生物質(zhì)能提供豐富的來源。據(jù)報道，全球每年的光合作用產(chǎn)生的 纖維素總量可達IO11噸。但是，纖維素是由葡萄糖分子以1，4-糖苷鍵結(jié)合而成的線狀高分子聚合物。纖維素分子難以直接被利用，需經(jīng)過降解成小分子糖類物質(zhì)后才可被利用。纖維素可直接通過酸、堿處理或通過酶法處理降解。酶法降解纖維素由于無污染、低能耗的優(yōu)點而逐漸取代酸、堿處理方法。木質(zhì)纖維素降解酶廣泛存在于自然界的生物體中，在食品、釀造行業(yè)、農(nóng)副產(chǎn)品深加工、飼料、醫(yī)藥、環(huán)境保護和化工等領域有著非常廣闊的應用前景和應用潛力。因此，該方法制備的復合酶系具有廣泛的應用前景。國內(nèi)外生產(chǎn)纖維素酶的方法普遍采用液體深層發(fā)酵和固態(tài)發(fā)酵。固態(tài)發(fā)酵通風效果不是很好，可操作性較差，不適合工業(yè)放大。液態(tài)發(fā)酵條件下用于產(chǎn)酶的碳源有微晶纖維素或紙漿，雖然酶活力較高，但是成本較高，環(huán)境污染嚴重，不適合大規(guī)模生產(chǎn)；也有用廉價原料麩皮、稻草以及小麥秸桿，但是酶活力較低；還有用酸處理的玉米芯殘渣作為原料進行發(fā)酵，由于酸處理后的殘渣存在毒性副產(chǎn)物糠醛等，對菌體生長有抑制作用，因此，酶活力較低?，F(xiàn)有的生產(chǎn)纖維素酶的生產(chǎn)方法都不能滿足在保證酶活力較高的同時又能夠制備出酶系比較全的需要。

發(fā)明內(nèi)容
針對上述技術(shù)問題，本發(fā)明設計開發(fā)了一種高效降解木質(zhì)纖維素的復合酶系的制備方法及其應用，目的在于制備同時含有纖維素酶和半纖維素酶的木質(zhì)纖維素降解復合酶系，降低酶的生產(chǎn)成本，提高催化效率，減少對環(huán)境的污染。本發(fā)明提供的技術(shù)方案為一種高效降解木質(zhì)纖維素的復合酶系的制備方法，包括以下步驟步驟一、活化里氏木霉菌株或其衍生菌株；步驟二、將活化后的里氏木霉菌株或其衍生菌株制備成孢子懸液，接種于種子培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，溫度為28 30°C，轉(zhuǎn)速為17(Γ200轉(zhuǎn)/分的搖床上震蕩培養(yǎng)24 36h ；步驟三、將接種里氏木霉菌株或其衍生菌株的種子培養(yǎng)基接種至以微晶纖維素和玉米芯為碳源且混合比為1:4的發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵罐培養(yǎng)。優(yōu)選的是，所述的高效降解木質(zhì)纖維素的復合酶系的制備方法中，所述步驟三中將接種里氏木霉菌株或其衍生菌株的種子培養(yǎng)基按照5 10%接種量接種至所述的發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵罐培養(yǎng)。
優(yōu)選的是，所述的高效降解木質(zhì)纖維素的復合酶系的制備方法中，按質(zhì)量百分比計，所述發(fā)酵培養(yǎng)基包括碳源29Γ8%，有機氮源O.廣5%，無機氮源濃度為(Γ2%，無機鹽
O.OOOf 10%。優(yōu)選的是，所述的高效降解木質(zhì)纖維素的復合酶系的制備方法中，按所述步驟三進行發(fā)酵罐培養(yǎng)時，pH調(diào)節(jié)為3. (Γ5. 0，溫度控制為2(T40°C，搖床轉(zhuǎn)速控制在10(Γ250轉(zhuǎn)/分，進行深層液態(tài)發(fā)酵，發(fā)酵時間為6(Γ200小時。優(yōu)選的是，所述的高效降解木質(zhì)纖維素的復合酶系的制備方法中，所述碳源含量最佳為3% 5%。優(yōu)選的是，所述的高效降解木質(zhì)纖維素的復合酶系的制備方法中，所述的發(fā)酵罐
體積為5L，且裝有3L發(fā)酵培養(yǎng)基。利用上述方法制備的一種復合酶系的應用，將所述復合酶系處理玉米芯和氣爆秸桿以及經(jīng)NaOH常溫預處理的玉米秸桿。本發(fā)明所述的高效降解木質(zhì)纖維素的復合酶系的制備方法，以少量微晶纖維素與玉米芯混合作為發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源，因玉米芯來源廣泛、價格低廉，降低了生產(chǎn)成本。應用本方法得到的復合酶系中木聚糖酶活力顯著高于純微晶纖維素作為碳源的木聚糖酶的活力，纖維素酶活力有所降低。將利用本方法制備的復合酶系處理玉米芯和氣爆秸桿以及經(jīng)NaOH常溫預處理的玉米秸桿，結(jié)果發(fā)現(xiàn)對玉米芯的水解效果高于微晶纖維素作為碳源的處理效果，對預處理的玉米秸桿還原糖含量也得到了一定的提高。本發(fā)明所述的制備方法中的原料不需要進行酸或者堿等方法預處理，因此，制備過程中不會產(chǎn)生毒性副產(chǎn)物，制備的復合酶系在食品、釀造行業(yè)、農(nóng)副產(chǎn)品深加工、飼料、醫(yī)藥、環(huán)境保護和化工等領域有著非常廣闊的應用前景和應用潛力。


圖1是本發(fā)明所述的復合酶系中纖維素酶活力和木聚糖酶活力隨發(fā)酵時間變化規(guī)律圖。
具體實施例方式下面結(jié)合附圖對本發(fā)明做進一步的詳細說明，以令本領域技術(shù)人員參照說明書文字能夠據(jù)以實施。本發(fā)明提供一種高效降解木質(zhì)纖維素的復合酶系的制備方法，包括以下步驟步驟一、活化里氏木霉菌株或其衍生菌株；步驟二、將活化后的里氏木霉菌株或其衍生菌株制備成孢子懸液，接種于種子培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，溫度為28 30°C，轉(zhuǎn)速為17(Γ200轉(zhuǎn)/分的搖床上震蕩培養(yǎng)24 36h ；步驟三、將接種里氏木霉菌株或其衍生菌株的種子培養(yǎng)基接種至以微晶纖維素和玉米芯為碳源且混合比為1:4的發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵罐培養(yǎng)。所述的高效降解木質(zhì)纖維素的復合酶系的制備方法中，所述步驟三中將接種里氏木霉菌株或其衍生菌株的種子培養(yǎng)基按照5 10%接種量接種至所述的發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵罐培養(yǎng)。所述的高效降解木質(zhì)纖維素的復合酶系的制備方法中，按質(zhì)量百分比計，所述發(fā)酵培養(yǎng)基包括碳源2% 8%，有機氮源O.1 5%，無機氮源濃度為0 2%，無機鹽O. 0001 10%。所述的高效降解木質(zhì)纖維素的復合酶系的制備方法中，按所述步驟三進行發(fā)酵罐培養(yǎng)時，PH調(diào)節(jié)為3. (Γ5. 0，溫度控制為2(T40°C，搖床轉(zhuǎn)速控制在10(Γ250轉(zhuǎn)/分，進行深層液態(tài)發(fā)酵，發(fā)酵時間為6(Γ200小時。所述的高效降解木質(zhì)纖維素的復合酶系的制備方法中，所述碳源含量最佳為
3% 5%。所述的高效降解木質(zhì)纖維素的復合酶系的制備方法中，所述的發(fā)酵罐體積為5L，且裝有3L發(fā)酵培養(yǎng)基。利用上述方法制備的一種復合酶系的應用，將所述復合酶系處理玉米芯和氣爆秸 桿以及經(jīng)NaOH常溫預處理的玉米秸桿。實驗材料本實驗中以里氏木霉(Trichoderma reesei Rut C-30)購買于中國工業(yè)微生物菌種保存中心(CICC)，CICC13052。種子培養(yǎng)基包括微晶纖維素2%，玉米漿1. 5%，葡萄糖1%，調(diào)節(jié)pH為4. 5。本發(fā)明的發(fā)酵培養(yǎng)基以微晶纖維素和玉米芯作為碳源，其中玉米芯粉經(jīng)粉碎機粉碎而成，玉米漿作為有機氮源，硫酸銨作為無機氮源，磷酸二氫鉀、硫酸鎂、碳酸鈣作為無機鹽成分，甘油作為菌種發(fā)酵初期的碳源。因此，所確定出的發(fā)酵培養(yǎng)基包括玉米漿1. 0 2· 5%, (NH4)2SCM O. 2 O. 8%, KH2PO4O^O. 6%, MgSO4 · 7Η20 0 0· 1%，CaCO3 0 0· 25%，甘油(TO. 25%，調(diào)節(jié)pH為4. (Γ5. O。其中，有機氮源還可以為酵母粉、蛋白胨；無機氮源還可以為氯化銨、硝酸銨。繪制葡萄糖和木糖的標準曲線，利用標準曲線測定本發(fā)明得到的復合酶系中的濾紙酶活和木聚糖酶活力。I)葡萄糖標準曲線的繪制配制10mg/ml葡萄糖母液,稀釋成2. O, 3. 3, 5. O和6. 7mg/ml的葡萄糖溶液樣品。取O. 5ml的葡萄糖溶液樣品加到Iml的O. 05M，pH4. 8的檸檬酸緩沖溶液中，再加3ml的DNS反應液，混勻，沸水浴加熱5min,冷卻至室溫。使用分光光度計測定于波長540nm下測定吸光度0D。以0D540為縱坐標，對應葡萄糖濃度為橫坐標，繪制標準曲線。2)木糖標準曲線的繪制配制O. OlM (=0. 15g/100ml 緩沖液)木糖母液，稀釋成 10、5、3· 33 和 2 μ mol/ml 的木糖溶液樣品。取O. 2ml木糖溶液樣品加到1. 8ml的木聚糖底物溶液中，添加3mlDNS反應液，混勻，沸水浴加熱5min，冷卻并離心，使用分光光度計于波長540nm下測定上清液吸光度0D。以0D540為縱坐標，對應木糖濃度為橫坐標，繪制標準曲線。3)濾紙酶活測定試管內(nèi)添加1. Oml O. 05M, pH 4. 8檸檬酸鈉緩沖液，添加O. 5ml的稀釋酶液，加熱至50°C，添加一條濾紙條帶混合，50°C水浴反應60min，立即添加3. OmlDNS反應液混勻終止反應。沸水浴加熱5min，轉(zhuǎn)移至冷水浴，冷卻。取O. 45ml顏色反應后的混合液，加入2. Oml去離子水或蒸餾水，充分混勻。在540nm下讀取吸光度，由標準曲線讀取樣品的葡萄糖濃度。4)木聚糖酶活力測定
添加1. 8ml的底物溶液(用O. 05M, pH5. 3的檸檬酸緩沖液溶解，制備1%木聚糖懸浮液)和O. 2ml的稀釋酶液至試管內(nèi)，50°C水浴反應5min，添加3. Oml的DNS反應液，混勻。沸水浴加熱5min,轉(zhuǎn)移樣品至冷水浴,然后離心沉淀未反應的底物。上清液于540nm處讀取樣品的吸光度，根據(jù)木糖標準曲線，將測定管的樣品的吸光度轉(zhuǎn)換為木糖的濃度。5)復合酶系的應用在50ml搖瓶中，加入5^15%的預處理或者未處理的底物，酶的裝載量為5 10FPU/g干底物，在溫度為50°C，搖床轉(zhuǎn)速為150轉(zhuǎn)/分時，酶解48、6h，分別取樣1ml，離心取上清液，測定上清液中的總還原糖。實施例一將PDA斜面培養(yǎng)基上活化后的里氏木霉菌株或其衍生菌株制備成孢子懸液，按照第一百分比的接種量接種于新鮮的種子培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。微晶纖維素和玉米芯以不同 的比例混合，取1. 5g不同混合比例原料加50ml發(fā)酵培養(yǎng)基溶液裝入250ml的三角瓶，于120°C滅菌15min，冷卻后接種里氏木霉菌株或其衍生菌株的種子培養(yǎng)基溶液，于28 30°C，150^220轉(zhuǎn)/分發(fā)酵5 7天，離心取上清液測定纖維素酶和木聚糖酶活力。結(jié)果如表I所示，當微晶纖維素和玉米芯以2:8的比例混合時，纖維素酶活力為純微晶纖維素作為碳源時的94.6%，木聚糖酶活力為純微晶纖維素作為碳源時的10倍。因此，選用微晶纖維素和玉米芯的最佳配比為1:4進行下面實施例的實驗。表I玉米芯替代部分微晶纖維素對復合酶系發(fā)酵的影響以及水解效果
微晶纖維素相對濾紙酶活相對木聚糖酶活力
_玉米芯__(%)__(%)
0871.296511:883·38737
2:8 94.94 1087 3:8 95.72 996 4:8 96.83 993 _3.3； O_100,00_100實施例二按照實施例一中的實施方式，將活化后的里氏木霉菌株及其衍生菌株接種于種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)，然后接入含有150g/L的混合原料的3L發(fā)酵培養(yǎng)基溶液并裝入51發(fā)酵罐中發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)束測定纖維素酶活力和木聚糖酶活力，結(jié)果見圖1，纖維素酶活力在96h后達到9. 7IU/ml，木聚糖酶活力在132h達到3000IU/ml。實施例三將實施例二中制備的粗酶液處理玉米芯、氣爆秸桿，未添加β -葡萄糖苷酶粗酶液，底物濃度為5%，酶的裝載量是5 10IU/g底物，水解體系是20ml的pH4. 8,0. 05M的檸檬酸緩沖溶液，水解時間為48h。如表2所示，其中，酶液I為微晶纖維素和玉米芯作為碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基，酶液2為微晶纖維素作為碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基，酶液I對玉米芯的水解效果是33g/L，為酶液2水解效果的1. 59倍，氣爆秸桿作為底物時兩種酶液的水解效果差別較小。表2不同配比的酶活性比較和不同底物水解試驗結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種高效降解木質(zhì)纖維素的復合酶系的制備方法，其特征在于，包括以下步驟步驟一、活化里氏木霉菌株或其衍生菌株；步驟二、將活化后的里氏木霉菌株或其衍生菌株制備成孢子懸液，接種于種子培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，溫度為28 30°C，轉(zhuǎn)速為17(Γ200轉(zhuǎn)/分的搖床上震蕩培養(yǎng)24 36h ；步驟三、將接種里氏木霉菌株或其衍生菌株的種子培養(yǎng)基接種至以微晶纖維素和玉米芯為碳源且混合比為1:4的發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵罐培養(yǎng)。
2.如權(quán)利要求1所述的高效降解木質(zhì)纖維素的復合酶系的制備方法，其特征在于，所述步驟三中將接種里氏木霉菌株或其衍生菌株的種子培養(yǎng)基按照5 10%接種量接種至所述的發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵罐培養(yǎng)。
3.如權(quán)利要求1所述的高效降解木質(zhì)纖維素的復合酶系的制備方法，其特征在于，按質(zhì)量百分比計，所述發(fā)酵培養(yǎng)基包括碳源29Γ8%，有機氮源O. 1飛％，無機氮源濃度為(Γ2%， 無機鹽 O. 000 Γ10%ο
4.如權(quán)利要求3所述的高效降解木質(zhì)纖維素的復合酶系的制備方法，其特征在于，按所述步驟三進行發(fā)酵罐培養(yǎng)時，PH調(diào)節(jié)為3. (Γ5. 0，溫度控制為2(T40°C，搖床轉(zhuǎn)速控制在 100^250轉(zhuǎn)/分，進行深層液態(tài)發(fā)酵，發(fā)酵時間為6(Γ200小時。
5.如權(quán)利要求4所述的高效降解木質(zhì)纖維素的復合酶系的制備方法，其特征在于，所述碳源含量最佳為39Γ5%。
6.如權(quán)利要求1所述的高效降解木質(zhì)纖維素的復合酶系的制備方法，其特征在于，所述的發(fā)酵罐體積為5L，且裝有3L發(fā)酵培養(yǎng)基。
7.一種利用權(quán)利要求1所述的方法制備的復合酶系的應用，其特征在于，將所述復合酶系處理玉米芯和氣爆秸桿以及經(jīng)NaOH常溫預處理的玉米秸桿。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種高效降解木質(zhì)纖維素的復合酶系的制備方法及其應用，其特征在于，包括步驟一、活化里氏木霉菌株或其衍生菌株；步驟二、將活化后的里氏木霉菌株或其衍生菌株制備成孢子懸液，接種于種子培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，溫度為28~30℃，轉(zhuǎn)速為170~200轉(zhuǎn)/分的搖床上震蕩培養(yǎng)24~36h；步驟三、將接種里氏木霉菌株或其衍生菌株的種子培養(yǎng)基接種至以微晶纖維素和玉米芯為碳源且混合比為1:4的發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵罐培養(yǎng)。并將所述復合酶系處理玉米芯和氣爆秸稈以及經(jīng)NaOH常溫預處理的玉米秸稈。本發(fā)明所述的方法提高了復合酶系的糖化水解能力，降低了酶的制備成本，對環(huán)境的污染較小。
文檔編號C12P19/14GK102994481SQ201210515988
公開日2013年3月27日 申請日期2012年12月5日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月5日
發(fā)明者武改紅, 陳樹林, 馬立娟, 張東遠, 李德茂, 馬延和 申請人:天津工業(yè)生物技術(shù)研究所