專利名稱：棉鈴蟲對Cry1Ac 毒素非隱性抗性鈣粘蛋白胞質(zhì)區(qū)缺失突變的分子檢測方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物技術，涉及棉鈴蟲對CrylAc毒素非隱性抗性鈣粘蛋白胞質(zhì)區(qū)缺失突變的分子檢測方法。
背景技術：
表達CrylAc毒素蛋白的轉Bt基因棉花，從1997年開始在我國推廣應用，目前已大規(guī)模種植于黃河流域和長江流域棉區(qū)，平均占到全國棉花種植面積的75%左右。由于轉基因Bt棉花的大規(guī)模推廣應用的高強度選擇壓力導致其祀標害蟲棉鈴蟲(Helicoverpa armigera)對CrylAc毒素產(chǎn)生抗性,是Bt棉花使用中面臨的最大威脅。目前研究表明棉鈴蟲中腸腸壁細胞鈣粘蛋白基因突變是抗性形成的主要原因。鈣粘蛋白是一類對細胞粘結起決定作用的依賴Ca2+的糖蛋白，參與多種細胞活動，是由12個重復子的胞外區(qū)、跨膜區(qū)和較小的胞內(nèi)區(qū)組成。以往發(fā)現(xiàn)的基因突變部位均位于鈣粘蛋白胞外區(qū)結構域，通過轉座子的插入或片段缺失導致鈣粘蛋白翻譯提前終止，喪失了毒素結合區(qū)，從而對CrylAc產(chǎn)生抗性，這種功能喪失性突變產(chǎn)生的抗性通常呈隱性。2009年利用Fl單對檢測法共檢測230頭山東夏津田間棉鈴蟲，檢測到攜帶抗性基因的個體有67頭。根據(jù)Fl檢測的原理(Zhang等，Diverse genetic basis offield-evolved resistance to Bt cotton in cotton boIlworm from China. PNAS,2012,109(26) :10275-10280)，這些抗性個體與室內(nèi)抗性品系SCD_rl單對雜交(Yang等，Introgression of a disrupted cadherin gene enables susceptible Helicoverpaarmigera to obtain resistance to Bacillus thuringiensis toxin CrylAc. Bulletinof Entomological Research, 200, 99 (2) : 175-181), F1 代經(jīng)診斷劑量(I μ g/cm2CrylAc)處理存活個體應含有兩個鈣粘蛋白等位基因，一個來自SCD-rl品系G1) (Yang等，Identification and molecular detection of a deletion mutation responsiblefor a truncated casherin of Helicoverpa armigera.1nsect Biochemistry andMolecular Biology, 2006，36 (9) : 735-740)，另一個來自田間個體(rx)。SCD-rl 品系的抗性是由鈣粘蛋白突變基因A引起的，Γι缺失大部分胞外區(qū)和整個跨膜區(qū)及胞質(zhì)區(qū)，因此可以通過4組特異性引物選擇性的克隆出田間抗性個體的鈣粘蛋白基因rx (Zhao等，Diverse cadherin mutations conferring resistance to toxin CrylAc in Helicoverpaarimgera.，2010，40(2) : 113-118)?？寺×?20個田間抗性個體的鈣粘蛋白基因序列，鑒定至IJI個新的鈣粘蛋白突變基因r15。測序結果表明位于鈣粘蛋白胞質(zhì)區(qū)的第32號外顯子缺失165個堿基，導致其編碼的55個氨基酸發(fā)生缺失，這種鈣粘蛋白胞質(zhì)區(qū)突變能夠使CrylAc毒力顯著降低，從而導致抗性產(chǎn)生。(見附圖1、見附圖2)。多年多點的田間監(jiān)測表明，雖然棉鈴蟲對Bt棉花的抗性水平?jīng)]有明顯上升，但田間對CrylAc毒素抗性基因頻率在逐年增加，特別是新發(fā)現(xiàn)的非隱性抗性基因頻率增加明顯。目前主要的抗性監(jiān)測技術包括劑量對數(shù)-死亡機率值法(抗性倍數(shù)法)、F1檢測法、F2檢測法、診斷劑量檢測法及分子檢測法。但前面四種抗性監(jiān)測方法在棉鈴蟲對Bt棉花的抗性監(jiān)測中都有明顯的缺點，如不能檢測抗性基因類型，難以確定合適的診斷劑量，室內(nèi)必須有相應抗性品系，成本高，花費時間長等，導致對抗性監(jiān)測的不準確和延后，嚴重影響后續(xù)有效抗性治理的開展和實施。而分子檢測方法可以直接檢測抗性基因型，精確性高，對待測樣本的狀態(tài)無要求，對抗性基因顯隱性無要求，具有靈活性和穩(wěn)定性。

發(fā)明內(nèi)容
田間棉鈴蟲由于鈣粘蛋白胞質(zhì)區(qū)缺失突變導致的非隱性抗性基因頻率增加明顯，且在基因組DNA水平上有三種不同的類型。本發(fā)明的目的在于，利于PCR方法，根據(jù)鈣粘蛋白胞質(zhì)區(qū)缺失突變序列特點，建立快速、準確的分子檢測方法，明確由此類突變導致的非隱性抗性基因頻率，對棉鈴蟲對Bt棉花的抗性監(jiān)測和治理提供指導，具有實用價值。棉鈴蟲對CrylAc毒素非隱性抗性的鈣粘蛋白胞質(zhì)區(qū)缺失突變的三種基因型DNA分子檢測方法，設計特異性引物，采用PCR技術，檢測棉鈴蟲種群內(nèi)各個體鈣粘蛋白胞質(zhì)區(qū) 是否存在由于三種不同的插入或缺失導致胞內(nèi)區(qū)32號外顯子缺失55個氨基酸的情況。本發(fā)明棉鈴蟲對CrylAc毒素非隱性抗性的鈣粘蛋白胞質(zhì)區(qū)缺失突變的三種基因型DNA分子檢測方法優(yōu)選包含以下三個步驟第一步提取棉鈴蟲幼蟲或成蟲的基因組DNA ；第二步利用SEQ ID NO.1所示的引物A和SEQ ID NO. 2所示的引物B，PCR擴增上一步提取的棉鈴蟲基因組DNA ；第三步將上一步PCR獲得產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)電泳圖譜準確鑒定棉鈴蟲個體其鈣粘蛋白胞質(zhì)區(qū)缺失突變及其具體類型，一次性區(qū)分出抗性純合子、抗性雜合子及敏感個體。r15_i突變是由第32號外顯子上插入了 1459bp的片段，得到的PCR擴增產(chǎn)物的大小為2500bp左右，這個片段與I個棉鈴蟲羧酸膽堿酯酶基因(GenBank登錄號為FJ997310.1)的3’端非編碼區(qū)有95%的相似性，如果電泳結果只顯示這一條帶，則為鈣粘蛋白胞內(nèi)區(qū)基因組DNA插入而導致的mRNA缺失突變的抗性純合子，如果電泳有2500bp和IOOObp兩個條帶，則為抗性雜合子(如附圖3，泳道I和泳道2)。r15_2突變的等位基因在第32號外顯子上缺失82bp的DNA序列，得到的擴增產(chǎn)物為750bp，如果電泳結果只顯示這一條帶，則為鈣粘蛋白胞內(nèi)區(qū)基因組DNA缺失而導致的mRNA第32號外顯子缺失突變的抗性純合子，如果電泳有750bp和IOOObp兩個條帶，則為抗性雜合子(如附圖3，泳道3和泳道4)。r15_3突變是由第32號外顯子上插入了約4000bp的片段形成，擴增產(chǎn)物約為5000bp，如果電泳結果只顯示這一條帶，則為鈣粘蛋白胞內(nèi)區(qū)基因組DNA插入而導致的mRNA缺失突變的抗性純合子，如果電泳有5000bp和兩個條帶，則為抗性雜合子(如附圖3，泳道5和泳道6)。如果PCR擴增片段只有IOOObp (如附圖3，泳道7)，則為敏感個體。本發(fā)明方法還可包括基于第三步的結果判斷種群內(nèi)抗性基因頻率。有益效果本發(fā)明就是基于室內(nèi)前期研究的基礎，開發(fā)了針對鈣粘蛋白胞質(zhì)區(qū)缺失突變的基因組DNA分子檢測技術，它具有(I)快速、準確及同時檢測鈣粘蛋白胞質(zhì)區(qū)突變基因組DNA水平上的三種不同類型，(2)判斷出發(fā)生突變個體的基因型，計算出與突變有關的非隱性抗性基因個體頻率，(3)全過程耗時5-8小時等特點。
與傳統(tǒng)的抗性監(jiān)測技術相比，此方法無需將田間試蟲飼養(yǎng)至適宜蟲齡，再進行生物測定以確定抗性水平，以后再通過與室內(nèi)現(xiàn)有的抗性和敏感品系進行遺傳雜交以決定抗性的顯、隱性水平，最后再進行基因型鑒定。如果完成上述工作需數(shù)月甚至更長時間，其結果對生產(chǎn)實際的指導意義嚴重滯后。而本發(fā)明方法不需飼養(yǎng)試蟲，節(jié)省勞動力和資源，可以快速、準確檢測出棉鈴蟲對CrylAc毒素非隱性抗性鈣粘蛋白胞質(zhì)區(qū)缺失突變，以及具體DNA的變化類型，單個試蟲僅需數(shù)小時。如果采集鑒定田間的代表性試蟲種群，也只需幾周時間就可以得到種群內(nèi)抗性基因頻率，鑒定結果可及時對棉鈴蟲的有效抗性治理提供正確指導。


圖1棉鈴蟲SCD品系鈣粘蛋白基因與rl5等位基因氨基酸序列比較相同序列用圓點表示，水平箭頭表示推測的結構域起始點。SIG，信號肽區(qū)；EC，鈣粘蛋白重復區(qū)；MPR，近膜區(qū)；TM，跨膜區(qū)；CYT，胞質(zhì)區(qū)。黑色方框表示缺失片段。S⑶鈣粘蛋白基因序列GenBank登錄號 JN836544. 1，rl5 序列 GenBank 登錄號 JN898956.1。 圖2棉鈴蟲鈣粘蛋白結構示意圖。A :棉鈴蟲鈣粘蛋白結構，分為胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)，其中胞外區(qū)又包括信號肽區(qū)(SIG)，11個鈣粘蛋白重復子區(qū)(1-11)和近膜區(qū)(MPR)。B :棉鈴蟲鈣粘蛋白基因組結構。胞內(nèi)區(qū)缺失突變是由于在其基因組DNA第33個外顯子上插入了 1459bp或4000bp或缺失了 82bp的DNA片段，導致胞內(nèi)區(qū)缺失55個氨基酸。圖3實施例1PCR擴增電泳結果圖，用于驗證棉鈴蟲鈣粘蛋白胞質(zhì)區(qū)的缺失突變及相應的基因組DNA突變類型。不同的泳道表示突變不同的基因型，其中各泳道分別表示l:r15_iri5_1;2:ri5_lS;3:ri5-2ri5-2; 4:r15_2s; 5:r15_3r15_3; 6 :r15_3s; 7: ss ；M:DNA Ladder。r15_!突變擴增片段為 2500bp，r15_2突變擴增片段為750bp，r15_3突變擴增片段為5000bp，ss擴增片段為lOOObp。圖4實施例2PCR擴增電泳結果圖，用于判斷棉鈴蟲田間種群內(nèi)個體發(fā)生鈣粘蛋白胞質(zhì)區(qū)的缺失突變及相應的基因組DNA突變類型的情況。不同的泳道表示突變不同的基因型，其中各泳道分別表示1，2:r15_2r15_2，為抗性純合子；3，4，5:r15_2s,為抗性雜合子6，7: ss,為敏感個體；M:DNA Ladder。
具體實施例方式實施例1第一步單頭棉鈴蟲幼蟲或成蟲基因組DNA的提取。(I)分別獲取室內(nèi)通過生物測定方法和與敏感品系遺傳雜交證實其確為抗性純合子、抗性雜合子和敏感個體的棉鈴蟲幼蟲。(2)采用市售的DNA提取試劑盒提取幼蟲基因組DNA。本方法采用愛思進生物技術(杭州)有限公司的AxyPr印基因組DNA小量試劑盒。(3)取棉鈴蟲3-4齡幼蟲或成蟲的腹部組織30毫克，于1. 5mL離心管中，加入O. 01mol/LPH7. 4的磷酸緩沖液350mL和O. 9 μ L RNaseA(50mg/mL)溶液研磨均勻。收集350 μ L組織勻漿液于2mL離心管。(4)加入150 μ L裂解液(Buffer C-L)和20 μ L蛋白酶K(15mg/mL)溶液，渦漩振蕩I分鐘后，短暫離心，再將其置于56度水浴10分鐘。(5)加入350 μ L蛋白去除液(Buffer P-D),渦漩振蕩30秒，12，OOOXg離心10分鐘。(6)將DNA制備管置于另一 2m L離心管中，將(5)中的上清液移至制備管中，12，000 Xg離心I分鐘。(7)棄濾液，將制備管放回原來的2mL離心管，加入500 μ L洗滌液(Buffer W1),12，000 Xg離心I分鐘。(8)棄濾液，將制備管放回原來的2mL離心管，加入700 μ L去鹽液(Buffer W2),12，000 Xg離心I分鐘。(9)棄濾液，將制備管放回原來的2mL離心管，12，OOOXg離心I分鐘。(10)棄濾液，將制備管放到另一潔凈的1. 5mL離心管，在制備管膜中央加100-200 μ L2. 5mmol/L 的 Tris-HCL 溶液，12，000 Xg 離心 I 分鐘，得到基因組 DNA 溶液，-20
度保存?zhèn)溆?。第二步，對第一步中提取的基因組DNA模板進行鈣粘蛋白特定基因片段的PCR擴
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>曰ο(I)根據(jù)棉鈴蟲鈣粘蛋白胞質(zhì)區(qū)32號外顯子缺失后的序列特征，設計出特異性PCR引物，可以通過擴增同時檢測出基因組DNA水平上三種不同的插入或缺失。上游引物A 的序列為TGATTGTTGTTGTGCTGCTTATTGTG (SEQ ID NO.1)下游引物B 的序列為CGATCAGGTCTGAGTCGTATGAC (SEQ ID NO. 2)(2)在O. 2mLPCR管中建立總反應體積為25 μ L的PCR反應體系。
IOXLA FCR BufTerII Clgs* Free) 2. 5Pl MgCI, C25minoi/L)2. nML
JXTP Mixture ( 1() ibo1/L each)0. 5μ|.
A (10μ iioi/L)L OlC
B (IOpboI/L)1. OA
(ienomi c DXAI, Ol1L
LA Taq DKA 聚合_ (5 / μ I)0. 25Λ
ddH2()(滅菌雙蒸水)16· 25μΙ.
總體積25μ (3) PCR反應條件為94V預變性3分鐘，94V變性30秒，57V退火30秒，72°C延伸5分30秒，循環(huán)數(shù)30，最后72°C延伸10分鐘。反應結束后在4°C保存反應產(chǎn)物，用于后續(xù)瓊脂糖凝膠電脈檢測。第三步，對第二步得到的PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電脈檢測。(I)準備1% (g/mL)的瓊脂糖凝膠。
(2)取IOyL PCR擴增產(chǎn)物進行電泳，穩(wěn)流80mA，1. 5小時后在紫外光下觀察。從電泳結果可以看到此對PCR引物針對棉鈴蟲鈣粘蛋白基因在胞內(nèi)區(qū)55個氨基酸的缺失突變擴增出三種類型，根據(jù)電泳條帶的大小可以進行同時鑒定，并能一次區(qū)分出抗性純合子、抗性雜合子及敏感個體，結果見附圖3。由DNA的插入或缺失引起的3種突變導致鈣粘蛋白胞質(zhì)區(qū)mRNA水平上32號外顯子的缺失。r15_i突變是由第32號外顯子上插入了 1459bp的片段，得到的PCR擴增產(chǎn)物的大小為2500bp左右，這個片段與I個棉鈴蟲羧酸膽堿酯酶基因(GenBank登錄號為FJ997310.1)的3’端非編碼區(qū)有95%的相似性，抗性純合子電泳結果只顯示這一條帶(如附圖3，泳道I )，抗性雜合子電泳有2500bp和IOOObp兩個條帶(如附圖3，泳道2)。r15_2突變的等位基因 在第32號外顯子上缺失82bp的DNA序列，得到的擴增產(chǎn)物為750bp (如附圖3，泳道3)，抗性純合子電泳結果只顯示這一條帶，抗性雜合子電泳有750bp和IOOObp兩個條帶(如附圖3，泳道4)。r15_3突變是由第32號外顯子上插入了約4000bp的片段形成，擴增產(chǎn)物約為5000bp (如附圖3，泳道5)，抗性純合子電泳結果只顯示這一條帶，抗性雜合子電泳有5000bp和IOOObp兩個條帶(如附圖3，泳道6)。敏感個體PCR擴增片段只有IOOObp (如附圖3，泳道7)。實施例2下面說明本發(fā)明優(yōu)選的技術方案用于棉鈴蟲種群內(nèi)鈣粘蛋白胞內(nèi)區(qū)缺失突變基因頻率的檢測方法第一步單頭棉鈴蟲幼蟲或成蟲基因組DNA的提取。(I)直接從田間采集棉鈴蟲幼蟲或采用高壓汞燈誘集棉鈴蟲成蟲，將得到的試蟲浸泡在95%的乙醇中帶回實驗室，隨機抽取100頭棉鈴蟲幼蟲或成蟲個體供基因頻率檢測。(2)采用市售的DNA提取試劑盒提取幼蟲或成蟲的基因組DNA。本方法采用愛思進生物技術(杭州)有限公司的AxyPr印基因組DNA小量試劑盒。(3)取棉鈴蟲3-4齡幼蟲或成蟲的腹部組織30毫克，于1. 5mL離心管中，加入O. 01mol/LPH7. 4的磷酸緩沖液350mL和O. 9 μ L RNaseA(50mg/mL)溶液研磨均勻。收集350 μ L組織勻漿液于2mL離心管。(4)加入150 μ L裂解液(Buffer C-L)和20 μ L蛋白酶K(15mg/mL)溶液，渦漩振蕩I分鐘后，短暫離心，再將其置于56度水浴10分鐘。(5)加入350 μ L蛋白去除液(Buffer P-D),渦漩振蕩30秒，12，OOOXg離心10分鐘。(6)將DNA制備管置于另一 2mL離心管中，將(5)中的上清液移至制備管中，12，000 Xg離心I分鐘。(7)棄濾液，將制備管放回原來的2mL離心管，加入500 μ L洗滌液(Buffer W1),12，000 Xg離心I分鐘。(8)棄濾液，將制備管放回原來的2mL離心管，加入700 μ L去鹽液(Buffer W2),12，000 Xg離心I分鐘。(9)棄濾液，將制備管放回原來的2mL離心管，12，OOOXg離心I分鐘。(10)棄濾液，將制備管放到另一潔凈的1. 5mL離心管，在制備管膜中央加100-200 μ L2. 5mmol/L 的 Tris-HCL 溶液，12，000 Xg 離心 I 分鐘，得到基因組 DNA 溶液，-20
度保存?zhèn)溆?。第二步，對第一步中提取的基因組DNA模板進行鈣粘蛋白特定基因片段的PCR擴

(I)根據(jù)棉鈴蟲鈣粘蛋白胞質(zhì)區(qū)32號外顯子缺失后的序列特征，設計出特異性PCR引物，可以通過擴增同時檢測出基因組DNA水平上三種不同的插入或缺失。上游引物A 的序列為TGATTGTTGTTGTGCTGCTTATTGTG (SEQ ID NO.1) 下游引物B 的序列為CGATCAGGTCTGAGTCGTATGAC (SEQ ID NO. 2)(2)在O. 2mLPCR管中建立總反應體積為25 μ L的PCR反應體系。
權利要求
1.棉鈴蟲對CrylAc毒素非隱性抗性的鈣粘蛋白胞質(zhì)區(qū)缺失突變的三種基因型DNA分子檢測方法，其特征在于設計特異性引物，采用PCR技術，檢測棉鈴蟲種群內(nèi)各個體鈣粘蛋白胞質(zhì)區(qū)是否存在由于三種不同的插入或缺失導致胞內(nèi)區(qū)32號外顯子缺失55個氨基酸的情況。
2.根據(jù)權利要求1所述的分子檢測方法，其特征在于該方法包含以下三個步驟 第一步提取棉鈴蟲幼蟲或成蟲的基因組DNA ； 第二步利用SEQ ID NO.1所示的引物A和SEQ ID NO. 2所示的引物B，PCR擴增上一步提取的棉鈴蟲基因組DNA ； 第三步將上一步PCR獲得產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)電泳圖譜準確鑒定棉鈴蟲個體其鈣粘蛋白胞質(zhì)區(qū)缺失突變及其具體類型，一次性區(qū)分出抗性純合子、抗性雜合子及敏感個體。
3.根據(jù)權利要求2所述的分子檢測方法，其特征在于所述的分子檢測方法還包括根據(jù)第三步的結果判斷種群內(nèi)抗性基因頻率。
4.根據(jù)權利要求1所述的分子檢測方法，其特征在于所述的根據(jù)電泳圖譜準確鑒定棉鈴蟲個體其鈣粘蛋白胞質(zhì)區(qū)缺失突變及其具體類型，一次性區(qū)分出抗性純合子、抗性雜合子及敏感個體的方法是如果電泳結果只顯示2500bp條帶，則表明該棉鈴蟲為鈣粘蛋白胞內(nèi)區(qū)基因組DNA插入而導致的mRNA缺失突變的抗性純合子；如果電泳結果顯示2500bp和IOOObp兩個條帶，則該棉鈴蟲為抗性雜合子；如果電泳結果只顯示750bp條帶，則表明該棉鈴蟲為鈣粘蛋白胞內(nèi)區(qū)基因組DNA缺失而導致的mRNA第32號外顯子缺失突變的抗性純合子；如果電泳結果顯示750bp和IOOObp兩個條帶,則表明該棉鈴蟲為抗性雜合子；如果電泳結果只顯示5000bp條帶，則表明該棉鈴蟲為鈣粘蛋白胞內(nèi)區(qū)基因組DNA插入而導致的mRNA缺失突變的抗性純合子；如果電泳結果顯示5000bp和IOOObp兩個條帶，則表明該棉鈴蟲為抗性雜合子；如果電泳結果只顯示lOOObp，則表明該棉鈴蟲為CrylAc毒素敏感個體。
全文摘要
本發(fā)明公開了棉鈴蟲對Cry1Ac毒素非隱性抗性鈣粘蛋白胞質(zhì)區(qū)缺失突變的分子檢測方法。該檢測方法共分3個主要步驟，第一步分別提取棉鈴蟲樣品的基因組DNA；第二步進行特定鈣粘蛋白胞質(zhì)區(qū)片段的PCR擴增；第三步將PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，根據(jù)電泳圖譜，可以準確鑒定基因型，并以此判斷不同種群的抗性基因頻率。本發(fā)明方法不需飼養(yǎng)試蟲，節(jié)省勞動力和資源，可以快速、準確檢測出棉鈴蟲的基因型，單個試蟲僅需數(shù)小時，采集鑒定田間種群的抗性個體頻率也只需幾周時間，鑒定結果可及時對棉鈴蟲的有效抗性治理提供正確指導。
文檔編號C12Q1/68GK103014159SQ201210524000
公開日2013年4月3日 申請日期2012年12月7日 優(yōu)先權日2012年12月7日
發(fā)明者吳益東, 張浩男, 楊亦樺, 武淑文 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學