專利名稱：編碼豬β干擾素的基因片段及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及編碼豬β干擾素的基因片段及其應用。
背景技術：
近年來豬病毒性傳染病日益泛濫，已嚴重地威脅著我國畜牧業(yè)的持續(xù)發(fā)展。免疫抑制病及病毒抗原快迅變異，常導致疫苗免疫失?。患又粩喑霈F(xiàn)新的病毒病，目前還尚無 成功的疫苗接種預防。另ー方面，疫苗對疾病只有預防作用，治療還有賴于抗生素的使用。而ー些抗藥性菌株的出現(xiàn)，給人類食品和健康帶來極大的威脅，ー些國家已明令禁止在養(yǎng)殖生產(chǎn)中應用某些抗生素和抗菌劑。因此，生產(chǎn)中迫切需要ー種既有效又有利于環(huán)保的新方法來防控畜禽疾病。實踐證明，干擾素作為ー種廣譜的抗病毒劑，在病毒性傳染病的防控方面具有廣闊的應用前景。傳統(tǒng)的生產(chǎn)方法由中草藥等誘生劑誘導產(chǎn)生干擾素，因純化工藝復雜，產(chǎn)量少、作用緩和等諸多因素影響而極大限制了在臨床和科研的應用。隨著豬干擾素基因的克隆成功，對其重組產(chǎn)物的臨床應用及作用機理的研究也隨之展開。1990年，Lefevre和LaBonnar等人在大腸桿菌中表達了 PoIFN-α I基因，得到了ー個含189個氨基酸的前體蛋白，去除其N端的含23個氨基酸的信號肽后，得到了具有完全天然PoIFN-α I生物學活性的產(chǎn)物，并且其在豬源性細胞上的抗病毒活性至少是病毒刺激豬白細胞產(chǎn)生的干擾素的6倍。Pol JM等(1991)研究發(fā)現(xiàn)rPoIFN-a I能夠抑制偽狂犬病毒(PRV)強毒和中等毒力病毒在豬鼻腔黏膜組織stroma細胞層的増殖，PRV接種干擾素處理的豬成纖維細胞和豬腎細胞，病毒滴度明顯下降。Horisberger MA (1992)比較了重組PoIFN-α (rPoIFN-a )和重組PoIFN-Y (rPoIFN-Y )在豬的細胞中抗病毒活性的區(qū)別，發(fā)現(xiàn)rPoIFN- a可大大降低豬水泡性ロ炎病毒(VSV)在豬PK-15上引起的病變，井能削弱豬水泡性口炎病毒(VSV)和流感病毒在豬腎細胞中的復制，但rPoIFN-a和rPoIFN-γ對門戈病毒(一種腦心肌炎病毒)都有抗病毒作用。Jordan LT等(1994)發(fā)現(xiàn)rPoIFN-α對傳染性胃腸炎病毒(TGEV)有很好的預防作用。Tonomura N等(1996)研究發(fā)現(xiàn)HuIFN-α處理Vero后PRV的增殖受到抑制，PRV的立即早期基因的mRNA在干擾素處理的Vero中降低，瞬時表達試驗表明PRV IE啟動子的轉(zhuǎn)錄被選擇性抑制。BuddaertW (1998)對rPoIFN-α在體內(nèi)、外對豬繁殖與呼吸障礙綜合癥病毒(PRRSV)的抗病毒活性進行了研究，發(fā)現(xiàn)PRRSV在體內(nèi)、外對rPoIFN-α都很敏感，rPoIFN-α可明顯抑制PRRSV的產(chǎn)量和感染細胞的數(shù)量。chinsangaram J.等(2001)人用大腸桿菌表達rPoIFN-α或rPolFN-β并分別進行了抗ロ蹄疫病毒(FMDV)實驗，發(fā)現(xiàn)rPoIFN-α和rPoIFN-β抑制FMDV復制是在蛋白質(zhì)翻譯水平上的，主要是激活雙鏈RNA依賴性蛋白激酶(PKR)作用的結(jié)果在細胞中加入PKR抑制劑2_氨基嘌呤后,病毒的產(chǎn)量就會上升；而RNase L和PKR基因缺失的細胞在干擾素的作用下仍能感染FMDV，這充分說明了 PKR在抑制病毒復制中起作用。我國學者也對豬α干擾素進行了多項研究。曹瑞兵等(2004)克隆了一種新的豬IFN-α基因并在大腸桿菌中進行了其成熟蛋白的單純表達，表達產(chǎn)物具有較高的抗病毒活性。杜以軍等利用豬IFN-α的成熟蛋白基因構(gòu)建了重組腺病毒質(zhì)粒pAd-PoIFN-a轉(zhuǎn)染HEK-293A細胞，滴度為107TCID5(l/mL。RT-PCR證明目的基因在mRNA水平上可有效表達；在PK-15細胞上可以檢測到較強的抗豬口蹄疫病毒活性，從而為研究豬口蹄疫免疫防治新技術奠定了重要基礎。謝海燕等(2004)克隆了豬IFN-a基因，構(gòu)建了原核表達載體，初步對其進行了原核表達研究；我國學者夏春等(2005)報道了用pQE30表達載體在大腸桿菌原核表達的rPoIFN-α在豬源細胞和非豬源細胞系上可顯著抑制CSFV、PRRSV和VSV的增殖，證 明了原核表達PoIFN-a的可行性及將基因工程原核表達的PoIFN-α真正用于生產(chǎn)實踐中作為抗病毒制劑可行性。曹瑞兵等對豬IFN-a I基因進行了改造，在保留編碼蛋白序列的同時，使用了大腸埃希菌的偏愛密碼子，將合成的豬IFN-a I成熟蛋白編碼基因插入原核單純表達載體PRLC中，實現(xiàn)了豬IFN-a I在大腸埃希菌中的高效表達，且重組豬IFN-a I具有較高的抗病毒活性，約為6.4X106U/mg。此外，葛麗等(2005)克隆了豬IFN-α基因，構(gòu)建了真核表達載體，初步對其做了畢赤酵母分泌表達研究。劉占通等對丹系長白和法系長白、英系大白和法系大白豬IFN-a基因進行克隆，得到了上述4個品系的豬IFN-a基因，證明核苷酸同源性均在97. 2%以上，氨基酸同源性均在92. 8%以上。在豬β干擾素基因研究方面，2000年夏春等首次對豬干擾素β基因進行分子克隆與測序，克隆片段長668個核苷酸，編碼186個氨基酸。其中，76 636位含有I個0RF，蛋白分子量為21.8KU。除此之外，溫納相(2005)和彭貴青(2005)也對豬干擾素β的基因進行了分子克隆與測序，并檢測其生物活性。在表達方面，曹瑞兵(2004)和吳陽(2006)分別對豬β干擾素的基因進行了原核表達，表達量分別為17. 3%和18%，表達產(chǎn)物均為融合蛋白。其中曹瑞兵用重組豬β干擾素處理豬腎傳代細胞ΡΚ-15后，細胞病變抑制法(CPE5tl)測定結(jié)果表明，重組豬β干擾素可顯著抑制豬流行性腹 寫病毒(Porcine Epidemic Diarrhea Virus,PEDV)的感染。而后，為了研制高活性的重組豬β干擾素，曹瑞兵(2006)對豬干擾素β進行畢赤酵母偏嗜性改造并構(gòu)建了酵母表達質(zhì)粒PPICZ α A-PIB, pPICZ a A-PIB電轉(zhuǎn)化導入畢赤酵母菌株Χ_33后經(jīng)甲醇誘導發(fā)酵高產(chǎn)量分泌表達豬IFN-β，其中BI株酵母的IFN-β產(chǎn)量最高，約為2. 5X IO5U/mL,其表達量約為60 μ g/mL,比活為4. 17 X 106U/mg。將發(fā)酵上清液用PEG20000濃縮后進行SDS-PAGE和Western-blot檢測，結(jié)果表明表達產(chǎn)物是分子量約為28Ku和25Ku蛋白的混合物，兩者均可與豬IFN-β陽性抗血清發(fā)生特異反應。表達產(chǎn)物比豬IFN-β理論推導分子量(約20.8KU)大，推測可能是表達產(chǎn)物發(fā)生了不同程度的糖基化。重組豬IFN-β對偽狂犬病毒在細胞中増殖可呈現(xiàn)抑制作用，并且豬IFN-β對偽狂犬病毒在牛腎細胞(MadenDarbyBovine Kidney cells, MDBK)上早期增埴的抑制效果最為明顯。在豬Y干擾素基因研究方面，IFN-Y雖然只有ー種基因，但其結(jié)構(gòu)更為復雜，如編碼人和鼠IFN-Y的基因長約6Kb，各包含有4個外顯子和3個內(nèi)含子。IFN-Y與I型干擾素(IFN-α與IFN-β)田在基因和蛋白質(zhì)水平上沒有明顯的相關性(DeGrado，etal，1991)。雖然IFN-Y具有其它干擾素大多數(shù)的生物學活性，但在特異性抗病毒活性方面比IFN-α和IFN-β要低10-100倍，而在免疫調(diào)節(jié)活性方面要高100-10000倍(Pace, etal, 1985)。豬IFN- Y全基因編碼166個氨基酸殘基，其中包括20aa的信號肽(Di jkmans，etal，1990)。信號肽切除后，產(chǎn)生146個氨基酸的IFN-γ単體，分子量為17. 3ku，天然活性狀態(tài)的IFN-Y是由兩個IFN-Y單體經(jīng)非共價交聯(lián)形成的同源ニ聚體糖蛋白((Boehm, etal, 1997)。豬 IFN- Y 與人、小鼠、貓和犬的 IFN- Y 分別具有 60%，41%, 72%和 72%的同源性，而與IFN-β及IFN-α家族沒有明顯的同源性(Farrar and Schreiber, 1993)。國外最早于1990年由Roger等從基因水平開展了對豬Y干擾素的研究，他們以人Y干擾素的cDNA為探針，克隆了豬Y干擾素基因，發(fā)現(xiàn)與人Y干擾素在DNA和氨基酸的水平上分別有75%和59%的同源性(Di jkmans et al.，1990)。隨后,Vandenbroeck等利用原核表達系統(tǒng)表達了豬Y干擾素(Vandenbroeck et al.，1991)。在我國，郭錸軍等于2001年首次克隆報道了豬Y干擾素基因序列(郭稼軍等，2001)。迄今為止，夏春，曹瑞兵(吳文學等，2002;曹瑞兵等，2003;曹瑞兵等，2004)等人以原核系統(tǒng)表達的干擾素具有較好的生物學活性。曹瑞兵等從經(jīng)刀豆蛋白A (ConcanavalinA，ConA)誘導培養(yǎng)的豬外周血白細胞中擴增出豬IFN-Y基因，經(jīng)改造后插入原核表達載體pRLC，并實現(xiàn)了在大腸桿菌中的高效表達。表達產(chǎn)物以包涵體形式存在，經(jīng)變性、復性、脫鹽、凝膠層析純化處理，重組豬IFN-Y具有較高的干擾素活性。趙英杰等成功構(gòu)建了表達重組豬IFN-Y的大腸埃希氏菌基因工程菌株，亞細胞定位分析表明，目的蛋白經(jīng)原核表達后主要以不溶性包涵體形式存在，其他少量可溶性目的蛋白存在于細胞漿中。其對長白豬Y-干擾素基因的原核表達與分析，說明幾種我國地方豬IFN-Y在基因的核苷酸以及蛋白的氨基酸水平上不存在差異和突變，同時也證實了長白豬干擾素-Y基因的正確、完整克隆。為了研究和應用豬重組干擾素-Y預防和治療病毒性疫病，夏春將大白豬IFN-Y基因插入到酵母整合載體PHIL-S1，構(gòu)建了重組GSl 15工程菌。經(jīng)過SDS-PAGE、Western_blot分析和抗水泡性口炎病毒(VSV)活性測定，證實豬IFN-Y分子量為18Ku，在GS115中的表達量為18%，具有抗VSV的活性。用豬IFN- Y處理豬肺巨噬細胞系Marc-145后，經(jīng)細胞病變抑制法測定，豬IFN-γ可以抵抗豬藍耳病病毒(PorcineReproductive and RespiratorySyndrome Virus, PRRSV)感染。但以上技術均具有原基因密碼子的表達量低、抗病毒活性低的缺陷。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是依據(jù)畢赤酵母表達系統(tǒng)密碼子的偏嗜性，選擇高表達密碼子對豬α、β和Y干擾素成熟肽核苷酸序列進行基因修飾和改造，并構(gòu)建出重組酵母表達質(zhì)粒pPICZ a C-IFN-a、pPICZa C-IFN-β 和 pPICZ a C-IFN-γ，其可以在畢赤酵母中對豬 α、β和Y干擾素正確且高效表達。密碼子改造后所分泌的蛋白干擾素具有更好的抗病毒活性。干擾素具有很高的生物活性，Img即具有I億個活性単位?；蛑亟M豬a、β干擾素都屬于I型干擾素，具有廣譜抗病毒活性；基因重組豬Y干擾素屬于II型干擾素，具有很好的免疫調(diào)節(jié)作用。通過基因工程方法，根據(jù)密碼子的偏嗜性，重新合成豬α、β、Y三種干擾素基因核苷酸序列，在優(yōu)化誘導表達條件的基礎上，提高干擾素蛋白在畢赤酵母菌中的表達量，為大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)奠定了基礎。因此，在本發(fā)明基礎上，豬a、β、Υ三種干擾素推廣應用前景廣闊。本發(fā)明提供了一種編碼豬α干擾素的基因片段，其具有如SEQ IDN0. I所示的核苷酸序列。用于擴增其序列的上游引物Pa1具有如SEQID NO. 2所示的核苷酸序列；下游引物Pa2具有如SEQ ID NO. 3所示的核苷酸序列。所述的基因片段可用于構(gòu)建可表達豬α干擾素的重組畢赤酵母。本發(fā)明還提供了一種編碼豬β干擾素的基因片段，其具有如SEQID NO. 4所示的核苷酸序列。用于擴增其序列的上游引物PP1具有如SEQ ID Ν0.5所示的核苷酸序列；下游引物Ρβ2具有如SEQ ID Ν0.6所示的核苷酸序列。所述的基因片段可用于構(gòu)建可表達豬β干擾素的重組畢赤酵母。本發(fā)明還提供一種編碼豬Y干擾素的基因片段，其具有如SEQ IDN0.7所示的核苷酸序列。用于擴增其序列的上游引物P Y1具有如SEQID NO. 8所示的核苷酸序列；下游引物PY2具有如SEQ ID Ν0.9所示的核苷酸序列。所述的基因片段可用于構(gòu)建可表達豬Y干擾素的重組畢赤酵母。構(gòu)建重組酵母時，采用的表達載體優(yōu)選是pPICZ α C，重組質(zhì)粒優(yōu)選是 pMD-IFN- α、pMD-IFN- β 和 pMD-IFN- y。與傳統(tǒng)方法的表達的干擾素相比，本發(fā)明通過研究，達到了表達量高，成本較低，效價較高，質(zhì)量穩(wěn)定，因此為產(chǎn)品轉(zhuǎn)化創(chuàng)造了先決條件，具有很好的市場潛カ和較強的市場競爭力，更易在規(guī)模化豬場中廣泛推廣應用?；蛑亟M的豬α干擾素具有很好的抗病毒作用，可以單獨使用治療多種豬病毒性疾??；將表達的豬Y干擾素作為疫苗佐劑，與不同的疫苗聯(lián)合，可以研制出免疫效果更好的新型疫苗，將對豬病毒性疾病防治產(chǎn)生積極的影響。因此，本發(fā)明在市場上具有良好的應用前景。在預防和治療豬病毒性疾病方面具有潛在的應用價值。本發(fā)明通過精心設計，對豬三種干擾素進行了基因修飾和改造，經(jīng)顯示系統(tǒng)表明，密碼子改造后所分泌蛋白豬三種干擾素具有更好的抗病毒活性。


圖I是本發(fā)明實施例的PoIFN-α改造前后的氨基酸序列關聯(lián)性； 圖2是本發(fā)明實施例的PoIFN- α改造前后的堿基序列關聯(lián)性；圖3是本發(fā)明實施例的PoIFN-β改造前后的氨基酸序列關聯(lián)性；圖4是本發(fā)明實施例的PoIFN- β改造前后的堿基序列關聯(lián)性；圖5是本發(fā)明實施例的PoIFN- Y改造前后的氨基酸序列關聯(lián)性；圖6是本發(fā)明實施例的PoIFN- Y改造前后的堿基序列關聯(lián)性。
具體實施例方式下面結(jié)合附圖和實施例，對本發(fā)明的具體實施方式
作進ー步詳細描述。以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。(一)基因改造應用DNASTAR (Version 5. O)基因分析軟件，參照NCBI GenBank上登載的豬干擾素α基因成熟肽核苷酸序列(ΑΥ331298)、豬干擾素β基因成熟肽核苷酸序列(S41178)和豬干擾素Y基因成熟肽序列(EU249804)，參照趙翔等畢赤酵母菌的密碼子用法分析以及TaKaRa公司的Pichia酵母密碼子表等，按照該序列氨基酸順序不變，因此表達的蛋白質(zhì)不發(fā)生變化，同時根據(jù)畢赤酵母表達系統(tǒng)密碼子的偏嗜性，選擇高表達密碼子重新設計新序列，送由大連寶生物工程有限公司重新合成序列。I、豬α干擾素新序列，如SEQ ID NO. I所示，共501bp ;編碼166個氨基酸，如SEQID NO. 10 所示。引物Pa1 (SEQ ID N02) CG GAATTCCTGTGACTTGCCACAAACCCACT(標有下劃線處為EcoRI限制性內(nèi)切酶)Pa2 (SEQ ID NO. 3) GG GGTACC TTACTCCTTCTTTCTCAATCTG(標有下劃線處為KpnI限制性內(nèi)切酶)上、下游引物的理論跨幅為518bp，退火溫度58°C2、豬β干擾素新序列，如SEQ ID NO. 4所示，共498bp ;編碼165個氨基酸，如SEQID NO. 11 所示。P^1 (SEQ ID NO. 5) CG GAATTC CATGTCCTACGACGTCT(標有下劃線處為EcoRI限制性內(nèi)切酶)Ρβ2 (SEQ ID NO. 6) GG GGTACC TTAGTTTCTCAAGTAGTCG(標有下劃線處為KpnI限制性內(nèi)切酶)上、下游引物的理論跨幅為513bp，退火溫度52°C3、豬Y干擾素新序列，如SEQ ID NO. 7所示，共432bp ;編碼143個氨基酸，如SEQID NO. 12 所示。Py1 (SEQ ID NO. 8) CG GAATTC CCAG GCT CCA TTT TTC AA(標有下劃線處為EcoRI限制性內(nèi)切酶)Py2 (SEQ ID NO. 9) GGGGTACC TTA CTT GGA GGC TCT CTG AC(標有下劃線處為KpnI限制性內(nèi)切酶)上、下游引物的理論跨幅為449bp，退火溫度50. 7V(ニ)重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建(以 pPICZ a C-IFN- α 為例，pPICZ a C-IFN- β、pPICZ a C-IFN- y 與此相同)I、重組質(zhì)粒與表達載體的雙酶切對重組質(zhì)粒pMD-IFN-α進行EcoR I和Kpn I雙酶切，雙酶切反應體系如下
權利要求
1.一種編碼豬β干擾素的基因片段，其特征在于，具有如SEQ IDN0.4所示的核苷酸序列。
2.如權利要求I所述的基因片段，其特征在于，用于擴增其序列的上游引物Ρβi具有如SEQ ID NO. 5所示的核苷酸序列；下游引物P β2具有如SEQ ID NO. 6所示的核苷酸序列。
3.如權利要求2所述的基因片段，其特征在于，用于擴增其序列的PCR方法的退火溫度為 52。。。
4.權利要求f3所述的基因片段在構(gòu)建可表達豬β干擾素的重組畢赤酵母中的應用。
5.如權利要求4所述的應用，其特征在于，采用的表達載體是pPICZα C，重組質(zhì)粒是pMD-IFN-β 。
6.一種豬β干擾素，其特征在于，其具有如SEQ ID NO. 11所示的氨基酸序列。
7.權利要求6所述的豬β干擾素在制備抗病毒藥物中的應用。
8.如權利要求7所述的應用，其特征在于，所述的抗病毒藥物為抗豬病毒性疾病的藥物。
9.一種抗病毒藥物，其特征在于，含有權利要求6所述的豬β干擾素。
全文摘要
本發(fā)明依據(jù)畢赤酵母表達系統(tǒng)密碼子的偏嗜性，選擇高表達密碼子重新設計合成新的豬β干擾素成熟肽核苷酸序列。成功地構(gòu)建了重組酵母表達質(zhì)粒pPICZαC-IFN-β，不僅在畢赤酵母中對豬β干擾素實現(xiàn)了正確表達，而且使豬β干擾素在畢赤酵母菌中表達更容易，表達量更高，為基因工程大規(guī)模生產(chǎn)發(fā)酵奠定了基礎。
文檔編號C12N15/22GK102978213SQ20121052975
公開日2013年3月20日 申請日期2010年3月26日 優(yōu)先權日2010年3月26日
發(fā)明者羅滿林, 陳瑞愛, 劉健, 張欣, 唐明森 申請人:華南農(nóng)業(yè)大學, 廣東大華農(nóng)動物保健品股份有限公司