專利名稱：紅蓋鱗毛蕨查耳酮合成酶基因及其編碼的蛋白質(zhì)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)、基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體說，本發(fā)明涉及一種在紅蓋鱗毛蕨中表達(dá)的DeCHS蛋白(紅蓋鱗毛蕨查耳酮合成酶，Dryopteris erythrosora ChalconeSynthase, DeCHS)及其核酸序列。
背景技術(shù)：
紅蓋鱗毛蕨(Dryopteris erythrosora (Eaton) 0. Ktze)屬于鱗毛蕨科鱗毛蕨屬，是一種大型的陸生蕨類。原產(chǎn)我國華南地區(qū)、臺(tái)灣，在日本、朝鮮及菲律賓等地有分布。其對(duì)氣候適應(yīng)性較強(qiáng)，能夠耐長時(shí)間的高溫和干燥，較耐寒。本種袍子囊為鮮紅色，葉片羽毛狀，新生葉銅色，后變?yōu)樯罹G色，具極高的觀賞價(jià)值。鱗毛蕨屬植物根狀莖的粉末和粗體物自古以來作為驅(qū)蟲藥物被延用，其成分問苯三酚類化合物具有強(qiáng)力的驅(qū)蟲作用。同時(shí)本屬 植物有顯著的抗菌活性，對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、傷寒桿菌、乳酸桿菌、真菌和革蘭氏陰性菌均有不同程度的抗菌活性。而作為中藥，具有增強(qiáng)子宮收縮、抗早孕以及墮胎作用。最新體外實(shí)驗(yàn)表明，鱗毛蕨屬植物提取物對(duì)多種移植性動(dòng)物腫瘤有較強(qiáng)的抑制作用藥物作用于癌細(xì)胞后，導(dǎo)致DNA單鏈斷裂，阻礙了 DNA的合成，并能損傷腫瘤細(xì)胞的線粒體，干擾瘤細(xì)胞的呼吸作用。蕨類植物生長較為緩慢，資源越來越匱乏，但其潛在的經(jīng)濟(jì)和藥用價(jià)值是巨大的。黃酮類化合物是形成植物花色的一個(gè)重要成分，除了在花中存在之外，該類化合物在植物體的各種器官和組織中都有不同程度的分布。日常飲食中有很多種食品都富含黃酮類化合物，如大豆含有異黃酮類，柑桔含有黃燒酮類，茶、蘋果和可可含有兒茶素類，Ir菜含有芹菜素類，洋蔥含有黃酮醇類以及草莓含有花青素類等。同時(shí)這些黃酮類化合物對(duì)人類的健康具有多種保健與藥用功能，它們可以清除自由基，抗氧化，抗炎，免疫調(diào)節(jié)，抗衰老，抗輻射，抗病毒，抗癌，保護(hù)心血管系統(tǒng)，發(fā)揮植物雌激素活性，抑制酒精嗜好癥，防止骨質(zhì)疏松等，這類化臺(tái)物作為一種天然保健品也已受到廣泛的關(guān)注。在鱗毛蕨屬植物中已經(jīng)確定發(fā)現(xiàn)的成分有黃酮類化合物，酚類化合物和萜類化合物。有研究報(bào)道，二氫楊梅素、芹菜素、木樨草素、大豆素、大豆苷元、黃岑苷、芒柄花黃素、兒茶素等14種黃酮在紅蓋鱗毛蕨中均存在。黃酮類化合物的生物合成途徑有可能是目前所了解的最為清楚的植物次生代謝途徑。查爾酮合成酶(Chalcone Synthase,CHS)屬于type III聚酮合成酶家族(polyketidesynthase enzyme, PKS),是結(jié)構(gòu)和催化機(jī)制中最簡單的聚酮合成酶。它催化丙二酰輔酶A的三個(gè)乙酸基和香豆酰輔酶A的一個(gè)乙酸基縮合，生成柚配基查爾酮(Naringeninchalcone)和生松素查爾酮(Pinocembrin chalcone)。柚配基查爾酮是黃酮類物質(zhì)合成的直接前體。CHS在黃酮類合成途徑中扮演著極為重要的角色，是關(guān)建酶，也是限速酶。該基因的沉默、基因突變或者超表達(dá)都會(huì)直接或間接的影響到該合成途徑。通過提高查耳酮合成酶的活性或含量，可以間接的提高紅蓋鱗毛蕨中黃酮類化合物次生代謝產(chǎn)物或其前體的含量。
在對(duì)現(xiàn)有文獻(xiàn)分析中，“Plant Science (植物科學(xué))，2005，168 :1525 - 1531”報(bào)道了從銀杏中克隆了 CHS基因，NCBI網(wǎng)站上公布了玉米等的CHS基因的序列，在此專利公布之前，尚未有任何公開或報(bào)道本專利申請(qǐng)中提及的紅蓋鱗毛蕨DeCHS蛋白序列及其核酸序列。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種紅蓋鱗毛蕨查耳酮合成酶基因(DeCHS)0本發(fā)明第二個(gè)目的是提供該基因編碼的蛋白質(zhì)。本發(fā)明還提供了含有紅蓋鱗毛蕨查耳酮合成酶基因的重組載體及宿主細(xì)胞。
本發(fā)明所提供的紅蓋鱗毛蕨查耳酮合成酶，其氨基酸序列包括SEQ ID No. 3所示的氨基酸序列。優(yōu)選的，其氨基酸序列如SEQ ID No. 3所示。本發(fā)明所提供的紅蓋鱗毛蕨查耳酮合成酶基因，是編碼紅蓋鱗毛蕨查耳酮合成酶的核苷酸序列。優(yōu)選的，CDNA開放閱讀框的核苷酸序列如上述SEQ ID No. 2所示。優(yōu)選的，該基因的全長cDNA分子序列包括SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；更優(yōu)選的，其全長cDNA分子序列如SEQ IDNo.1所不。優(yōu)選的，紅蓋鱗毛蕨查耳酮合成酶基因，核苷酸序列包括如SEQ ID No. 4所示的核苷酸序列。更優(yōu)選的，紅蓋鱗毛蕨查耳酮合成酶基因，核苷酸序列如SEQID No.4所示。本發(fā)明還提供了含有上述基因的重組載體和宿主細(xì)胞。本發(fā)明技術(shù)方案中涉及的概念具體內(nèi)容如下本發(fā)明所說的紅蓋鱗毛蕨查耳酮合成酶基因的cDNA分子為編碼具有紅蓋鱗毛蕨查耳酮合成酶基因活性的多肽的核苷酸序列該基因的全長cDNA分子為編碼紅蓋鱗毛蕨查耳酮合成酶基因的mRNA全長對(duì)應(yīng)的cDNA核苷酸序列。在本發(fā)明中，mRNA全長是指由DNA經(jīng)hnRNA (核內(nèi)不均一 RNA)剪接而成，攜帶遺傳信息的能指導(dǎo)蛋白合成的一類單鏈核糖核酸。它具有完整的5'非編碼區(qū)、編碼區(qū)、3'非編碼區(qū)、polyA尾巴區(qū)域序列。在本發(fā)明中，“分離的”、“純化的”的DNA或cDNA是指，該DNA或片段已從天然狀態(tài)下位于兩側(cè)的序列中分離出來，還指該DNA或片段已經(jīng)與天然狀態(tài)下伴隨核酸的組分分開，而且已經(jīng)與細(xì)胞中伴隨其蛋白質(zhì)分開。在本發(fā)明中，可選用本領(lǐng)域已知的各種載體，如市售的載體，包括質(zhì)粒、粘粒等。在產(chǎn)生本發(fā)明的紅蓋鱗毛蕨查耳酮合成酶基因時(shí)，可以將紅蓋鱗毛蕨查耳酮合成酶基因編碼序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，從而形成紅蓋鱗毛蕨查耳酮合成酶基因的表達(dá)載體?！翱刹僮鞯剡B于”指這樣一種狀況，即線性DNA序列的某些部分能夠影響同一線性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信號(hào)肽DNA作為前體表達(dá)并參與多肽的分泌，那么信號(hào)肽(分泌前導(dǎo)序列)DNA就是可操作地連于多肽DNA ;如果啟動(dòng)子控制序列的轉(zhuǎn)錄，那么它是可操作地連于編碼序列；如果核糖體結(jié)合位點(diǎn)被置于能使其翻譯的位置時(shí)，那么它是可操作地連于編碼序列。一般，“可操作地連于”意味著相鄰，而對(duì)于分泌前導(dǎo)序列則意味著在閱讀框中相鄰。
本發(fā)明中宿主細(xì)胞為原核細(xì)胞。常用的原核宿主細(xì)胞包括大腸桿菌。本發(fā)明的紅蓋鱗毛蕨查耳酮合成酶基因全長核苷酸序列或其片段通常可以用PCR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。對(duì)于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設(shè)計(jì)引物，并用市售的cDNA庫或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。當(dāng)序列較長時(shí)，常常需要進(jìn)行兩次或多次PCR擴(kuò)增，然后再將各次擴(kuò)增出的片段按正確次序拼接在一起。獲得有關(guān)序列后，用重組法來大批量的獲得有關(guān)序列。通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。 此外，還可以用人工化學(xué)合成的方法來合成有關(guān)序列。除了用重組法產(chǎn)生之外，本發(fā)明蛋白的片段還可用固相技術(shù)，通過直接合成肽而加以生產(chǎn)。在體外合成蛋白質(zhì)可以用手工或自動(dòng)進(jìn)行。可以分別化學(xué)合成本發(fā)明蛋白的各片段，然后用化學(xué)方法加以連接以產(chǎn)生全長的分子。利用本發(fā)明的紅蓋鱗毛蕨查耳酮合成酶，通過各種常規(guī)篩選方法，可篩選出與紅蓋鱗毛蕨查耳酮合成酶發(fā)生相互作用的物質(zhì)，或者受體、抑制劑或拮劑等。 通過提高查耳酮合成酶的活性或含量，可以間接的提高紅蓋鱗毛蕨中黃酮類化合物次生代謝產(chǎn)物或其前體的含量。本發(fā)明提供的查耳酮合成酶基因是首次從紅蓋鱗毛蕨中克隆制備的，填補(bǔ)了從我國藥物植物紅蓋鱗毛蕨中分離克隆出查耳酮合成酶的空白?？梢酝ㄟ^基因工程技術(shù)用來提高紅蓋鱗毛蕨等植物中黃酮類化合物的含量，查耳酮合成酶基因可通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)來提高黃酮含量的研究和產(chǎn)業(yè)化中，尤其可用于中藥材的品質(zhì)改良，對(duì)于緩解黃酮藥源嚴(yán)重醫(yī)乏問題具有較好的促進(jìn)作用，因此本發(fā)明具有很好的應(yīng)用前景。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)驗(yàn)室具體的試驗(yàn)數(shù)據(jù)和結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如例如J.薩姆布魯克等《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(科學(xué)出版社2002),F.奧斯伯等《精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》(科學(xué)出版社1998)所述條件，或按照所用產(chǎn)品制造廠商所建議的條件。實(shí)施例1紅蓋鱗毛蕨RNA的分離(RNA isolation)紅蓋鱗毛蕨幼嫩葉片來源于上海師范大學(xué)植物園(原植株采自上海市佘山，并經(jīng)曹建國副教授保存并鑒定為紅蓋鱗毛蕨)(Dryopteris erythrosora (Eaton) O. Ktze)。采取材料后，立即置于液氮中冷凍保存。取部分組織，織在液氮中迅速研磨成粉末，用植物RNA提取試劑盒(購自康為世紀(jì)公司)提取總RNA。然后用瓊脂糖凝膠電泳鑒定總RNA質(zhì)量，在分光光度計(jì)上測(cè)定RNA含量。實(shí)施例2紅蓋鱗毛蕨查耳酮合成酶基因的全長克隆(Cloning of Full-lengthcDNA)根據(jù)一些植物CHS的氨基酸保守序列，設(shè)計(jì)簡并引物，利用同源性基因克隆原理，采用RACE方法(invitrogen試劑盒)進(jìn)行cDNA全長克隆,分四個(gè)階段進(jìn)行(I)保守區(qū)域獲得根據(jù)Genebank中已經(jīng)登陸的植物的查爾酮合成酶(CHS)序列，同源性比對(duì)后，根據(jù)其中保守程度較高的300bp左右片段，設(shè)計(jì)出簡并引物。Pl :5’ -GARAARTTCAAGCGCATGTG-3’P2 :5， -CARCCHTGYTGGTACATCAT-3，將紅蓋鱗毛蕨RNA反轉(zhuǎn)錄(使用invitrogen公司的supercsript III RTase),得到的cDNA進(jìn)行PCR(P1+P2)得到DeCHS保守區(qū)(332bp)，回收，連接到pEasy_T5載體上(全式金公司)，用M13F或M13R作為通用引物，送由華大基因公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果用NCBI中的BLAST軟件搜索己有的數(shù)據(jù)庫，知其核酸序列與已知的銀杏(Ginkgo biloba)等的CHS基因的同源性很高，故初步認(rèn)為它是一個(gè)CHS基因。(2) 3'-RACE 根據(jù)DeCHS保守區(qū)域的序列，設(shè)計(jì)正向特異性引物。P3 :5， -TACTGAAAGCAAACCCGAGCA-3’將紅蓋鱗毛蕨RNA反轉(zhuǎn)錄(使用invitrogen公司的supercsriptIII RTase,并加入能與poly A結(jié)合的T17AP)，得到的cDNA進(jìn)行PCR(P3+AP)得到DeCHS3'端(1289bp)，回收，連接到pEasy-T5載體上(全式金公司)，用Ml3F或Ml3R作為通用引物，送由華大基因公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果經(jīng)過BLAST軟件搜索已有的數(shù)據(jù)庫，知其核酸序列已知的銀杏等的CHS基因的同源性很高。(3) 5'-RACE根據(jù)DeCHS保守區(qū)域序列和DeCHS3'端序列，配合5' RACE試劑盒(invitrogen公司)中提供的5’端引物設(shè)計(jì)要求，得到反向特異性引物。P4 :5，-TTCCATACTCCGATAGC-3，P5 :5， -GCAACTCTCATCACCGTTCCACCTG-3’P6 :5’ -CTCGGGTTTGCTTTCAGTATCTCCTCATT-3’按照試劑盒說明進(jìn)行PCR得到DeCHS5'端(354bp)，回收，連接到pEasy_T5載體上(全式金公司)，用M13F或M13R作為通用引物，送由華大基因公司測(cè)序。(4)將5' RACE測(cè)序結(jié)果與3' RACE測(cè)序結(jié)果比序并進(jìn)行拼接，得到全長片段序列信息，并設(shè)計(jì)一對(duì)特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增DeCHS編碼區(qū)(P7+P8)得到DeCHS編碼區(qū)(1212bp)(過程同(I))。P7 :5， -ATGGCTTCTCCTGCTTCGACTC-3，P8 :5， -TTTGCTTCAAGTTTGACACTCCT-3，BLAST的結(jié)果證明從紅蓋鱗毛蕨中新得到的基因確為一個(gè)植物CHS基因。通過組合使用上述4種方法，獲得了候選的DeCHS的全長編碼序列。在拼接得到全長(至少包含完整的開放讀框)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步設(shè)計(jì)引物P9為正向引物，P10為反向引物，以總RNA為模板，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，獲得擴(kuò)增片段長度為1617bp。然后按常規(guī)方法以PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行克隆、測(cè)序，獲得SEQ ID NO.1所示的序列。P9 :5， -TGCTTCCCTTCTGCTCTCCTAAT-3，PlO :5， -TTGAATGAAGCGTGCGAAAC-3，實(shí)施例3紅蓋鱗毛蕨查耳酮合成酶基因的序列信息與同源性分析本發(fā)明新的紅蓋鱗毛蕨查耳酮合成酶全長cDNA的長度為1617bp，詳細(xì)序列見SEQID No. 1，其中開放讀框位于86-1297位核苷酸，詳細(xì)序列見SEQ ID No. 2。根據(jù)全長cDNA推導(dǎo)出紅蓋鱗毛蕨DeCHS的氨基酸序列，共403個(gè)氨基酸多肽，分子量44289. ll，pl為6. 52，詳細(xì)序列見SEQ ID No. 3。將DeCHS的全長cDNA序列及其編碼蛋白質(zhì)用BLAST程序在數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行核苷酸和蛋白質(zhì)同源性檢索，結(jié)果發(fā)現(xiàn)它與銀杏查耳酮合成酶基因(GenBank :AY496931.1)在核苷酸水平上具有63%覆蓋率，72%的同源性(如表I所示)；在氨基酸水平上，它與銀杏查耳酮合成酶基因(GenBank AAT68477.1)有95%覆蓋率，75%的同源性(見表2)。由此可見，DeCHS與銀杏查耳酮合成酶基因無論從核酸還是蛋白水平上都存在較高的同源性，故可以認(rèn)為DeCHS在功能上也相似。表I為本發(fā)明的紅蓋鱗毛蕨DeCHS與銀杏GbCHS的核苷酸序列同源性比較表；表
2為本發(fā)明的紅蓋鱗毛蕨DeCHS與銀杏GbCHS的氨基酸序列的同源性比較表。其中相同的氨基酸在兩個(gè)序列之間用氨基酸單字符標(biāo)出。表I
權(quán)利要求
1.紅蓋鱗毛蕨查耳酮合成酶，其特征在于，包括如SEQID No. 3所示的氨基酸序列。
2.權(quán)利要求1所述紅蓋鱗毛蕨查耳酮合成酶，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNo. 3所示。
3.紅蓋鱗毛蕨查耳酮合成酶基因，其特征在于，編碼權(quán)利要求1所述的紅蓋鱗毛蕨查耳酮合成酶。
4.權(quán)利要求3所述紅蓋鱗毛蕨查耳酮合成酶基因，其特征在于，基因cDNA開放閱讀框的核苷酸序列如上述SEQ ID No. 2所示。
5.權(quán)利要求3所述紅蓋鱗毛蕨查耳酮合成酶基因，其特征在于，基因的全長cDNA分子序列包括SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。
6.權(quán)利要求3所述紅蓋鱗毛蕨查耳酮合成酶基因，其特征在于，基因的全長cDNA分子序列如SEQ ID No.1所示。
7.權(quán)利要求3所述紅蓋鱗毛蕨查耳酮合成酶基因，其特征在于，核苷酸序列包括如SEQID No. 4所示的核苷酸序列。
8.權(quán)利要求3所述紅蓋鱗毛蕨查耳酮合成酶基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQIDNo. 4所示。
9.一種重組載體，其特征在于，包括權(quán)利要求3 8任一項(xiàng)所述的紅蓋鱗毛蕨查耳酮合成酶基因。
10.一種宿主細(xì)胞，其特征在于，包括權(quán)利要求3 8任一項(xiàng)所述的紅蓋鱗毛蕨查耳酮合成酶基因。
全文摘要
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)、基因工程技術(shù)領(lǐng)域，公開了一種在紅蓋鱗毛蕨中表達(dá)的DeCHS蛋白(紅蓋鱗毛蕨查耳酮合成酶)及其基因，紅蓋鱗毛蕨查耳酮合成酶包括SEQ ID No.3所示的氨基酸序列。可通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)來提高紅蓋鱗毛蕨等植物中黃酮類化合物的含量，尤其可用于中藥材的品質(zhì)改良，對(duì)于緩解黃酮藥源嚴(yán)重醫(yī)乏問題具有較好的促進(jìn)作用。
文檔編號(hào)C12N1/21GK103013943SQ20121053189
公開日2013年4月3日 申請(qǐng)日期2012年12月11日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月11日
發(fā)明者陳雪菲, 謝穎華, 張敏, 王全喜, 曹建國 申請(qǐng)人:上海師范大學(xué)