專利名稱：一種乳糖酶基因葡萄糖解阻遏敲除載體pMD19/HPT的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明公開一種乳糖酶基因葡萄糖解阻遏敲除載體PMD19/HPT，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
β-半乳糖苷酶(EC 3.2.1. 23)，通常稱為乳糖酶，可催化牛奶和奶制品中乳糖水解產(chǎn)生葡萄糖及半乳糖，并且具有半乳糖苷轉(zhuǎn)移作用。乳糖酶在食品、醫(yī)藥、能源工業(yè)和畜牧業(yè)等領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，因而受到越來越多的關(guān)注。通過牛奶和奶制品中乳糖的水解增加這些食品的營養(yǎng)價值，解決乳糖不耐癥食用牛奶和奶制品出現(xiàn)的問題，同時產(chǎn)乳糖酶的微生物可以用于處理乳清廢水，減少環(huán)境污染。許多細(xì)菌、絲狀真菌和酵母菌可以產(chǎn)生乳糖酶，其中克魯氏酵母菌如馬克斯克魯氏酵母(Jluyveromyces marxianus"),乳酸克魯氏酵母{Kluyveromyces lac ti51)和極地耐冷酵母菌Guehomyces pullulans 17_I菌株產(chǎn)生的乳糖酶受到廣泛重視。尤其馬克斯克魯氏酵母具有很強(qiáng)的同化乳糖和菊粉的能力、生長速率極快、代時短、生長時耐高溫、具有很強(qiáng)的分泌胞外產(chǎn)物的能力和是被美國食品藥物局確認(rèn)為最安全的微生物，而在許多方面得到了廣泛應(yīng)用。但是所有產(chǎn)乳糖酶的微生物乳糖酶基因表達(dá)和合成乳糖酶時會受到培養(yǎng)基中的葡萄糖嚴(yán)重阻遏，由于工業(yè)用培養(yǎng)基和含乳糖培養(yǎng)基中存在有葡萄糖，所以葡萄糖阻遏會嚴(yán)重影響有關(guān)微生物的乳糖酶產(chǎn)量。在葡萄糖阻遏過程中一種叫做Migl蛋白起非常重要的作用，這種蛋白是一種帶有C2H2的鋅指蛋白，能結(jié)合在受葡萄糖阻遏的各種基因啟動子上，被結(jié)合的基因啟動子必須含有(G/C) (C/T)GGGG序列，在該序列的5端還得有富含AT的區(qū)域(AT_rich region)?，F(xiàn)在發(fā)現(xiàn)Migl蛋白是細(xì)胞中具有廣泛調(diào)控作用的一種蛋白質(zhì)，只要這些蛋白基因啟動子含有(G/C) (C/T)GGGG序列，這些蛋白基因的表達(dá)都會受到Migl蛋白的調(diào)控作用。所以該細(xì)胞中基因被敲除后，許多蛋白基因的表達(dá)都會受到葡萄糖解阻遏作用，在有葡萄糖存在情況下有關(guān)蛋白質(zhì)或酶產(chǎn)量會大幅度提高。這樣構(gòu)建合適的敲除載體，敲除馬克斯克魯氏酵母#/似基因，對于提高該酵母菌的乳糖酶具有非常重要的生產(chǎn)實(shí)際意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種乳糖酶基因葡萄糖解阻遏敲除載體PMD19/HPT，可以用于敲除馬克斯克魯氏酵母#/似基因，用于敲除該酵母基因，獲得乳糖酶基因表達(dá)葡萄糖解阻遏菌株。本發(fā)明的技術(shù)解決方案如下構(gòu)建了可以用于敲除馬克斯克魯氏酵母基因的敲除載體PMD19-HPT，攜帶有潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因G7/T) 、用于同源重組的馬克斯克魯氏酵母基因啟動子序列和終止子序列和用于刪除逆?；虻腖oxp片段(5’ -ATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTAT- 3’)，在逆?；虮磉_(dá)框上下游各加入一個LoxP位點(diǎn)，并使二者同向，可以利用Cre重組酶將///T基因表達(dá)框刪除。在轉(zhuǎn)化敲除載體進(jìn)入產(chǎn)乳糖酶的馬克斯克魯氏酵母細(xì)胞之前，用DNA限制性內(nèi)切酶通ο 酶切質(zhì)粒？1 19-即1'，獲得#見7基因啟動子片段-///T基因-#Λ 7基因終止子片段；轉(zhuǎn)化該片段到產(chǎn)乳糖酶的馬克斯克魯氏酵母細(xì)胞后，通過同源重組插入到正常的#/似基因中，利用基因取代基因ORF框，并可以穩(wěn)定遺傳；獲得轉(zhuǎn)化子之后，把質(zhì)粒PKlNatCre (攜帶有酶切Loxp片段的酶基因)轉(zhuǎn)化到轉(zhuǎn)化子中，表達(dá)后刪除規(guī)T基因，獲得無規(guī)T基因和MIGl基因的敲除菌株。本發(fā)明公開的一種乳糖酶基因葡萄糖解阻遏敲除載體PMD19/HPT，其堿基序列見如SEQ No.1所示。該載體大小為4137 bp。本發(fā)明提供的一種乳糖酶基因葡萄糖解阻遏敲除載體pMD19/HPT制備方法如下 (I) PCR產(chǎn)物的擴(kuò)增
MIGl基因的啟動子用5'端帶有ZAoI酶切位點(diǎn)的引物Hl和與克隆基因的特殊引物H3有共同序列的引物H2以尤marxianus的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物Hl和H2是根據(jù)尤基因序列設(shè)計的。引物Η3和Η4是根據(jù)質(zhì)粒pCAMBIA 1381上規(guī)T基因序列設(shè)計的，利用這對引物通過PCR技術(shù)擴(kuò)增規(guī)T基因(1026 bp)部分。MIGl基因的終止子由引物H5和H6以尤marxianus的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到，弓丨物H6的5'端帶有XhoI酶切位點(diǎn)，引物H5和克隆逆?；虻奶厥夤颒4有共同序列，弓I物H5和H6也是根據(jù)尤marxianus MIGl基因設(shè)計的。PCR擴(kuò)增體系
權(quán)利要求
1.一種乳糖酶基因葡萄糖解阻遏敲除載體PMD19/HPT，堿基序列見如SEQ No.1所示。
2.權(quán)利要求1所述的乳糖酶基因葡萄糖解阻遏敲除載體PMD19/HPT制備方法，包括以下步驟 將擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物與載體pMD19-T Simple的連接；連接產(chǎn)物pMD19/HPT轉(zhuǎn)化E. ColiDm α感受態(tài)細(xì)胞； 質(zhì)粒的提取、酶切及回收用于轉(zhuǎn)化酵母的線性DNA片段 利用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，質(zhì)粒提取過程按照試劑盒說明進(jìn)行；用％01酶切PMD19/HPT 質(zhì)粒；37°C酶切 4 h 后，加入 2. O μ ΙΟX loading buffer 終止反應(yīng)，并用 O. 8%(w/v)的瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收目的片段； 轉(zhuǎn)化與篩選 (1)取80.O μ L的尤marXianus感受態(tài)細(xì)胞,加入濃縮并除鹽的線性DNA片段后混勻，轉(zhuǎn)至O. 2 cm冰預(yù)冷的電擊杯中；通過電擊的方法把線性DNA片段轉(zhuǎn)化到K. marxianus感受態(tài)細(xì)胞； (2)分別取10、25、50、100和200μ L混合液涂布在含有100. O μ g/mL潮霉素和O. 1%X-gal (w/v)的 YPD 平板上； (3)經(jīng)過培養(yǎng)挑取長出的藍(lán)色菌落接到含有100.O μ g/mL潮霉素、O. 1% X-gal (w/v)的YPD平板上進(jìn)行純化； (4)挑取純化后的菌落接種于100.O mL乳糖培養(yǎng)基中，于28 °C、180 rpm振蕩培養(yǎng)48h，測定乳糖酶活性，同時用沒有轉(zhuǎn)化的原始菌株作為對照，篩選出乳糖酶產(chǎn)量明顯提高的尚支除囷株。
3.制備權(quán)利I所述的乳糖酶基因葡萄糖解阻遏敲除載體PMD19/HPT，所涉及的引物序列如下
全文摘要
本發(fā)明的目的是提供一種乳糖酶基因葡萄糖解阻遏敲除載體pMD19/HPT，可以用于敲除馬克斯克魯氏酵母MIG1基因，用于敲除該酵母MIG1基因，獲得乳糖酶基因表達(dá)葡萄糖解阻遏菌株?？梢杂糜谇贸R克斯克魯氏酵母MIG1基因，用于敲除該酵母MIG1基因，獲得乳糖酶基因表達(dá)葡萄糖解阻遏菌株，能夠使許多蛋白基因的表達(dá)都會受到葡萄糖解阻遏作用，在有葡萄糖存在情況下有關(guān)蛋白質(zhì)或酶產(chǎn)量會大幅度提高，特別是乳糖酶，可以利用高產(chǎn)乳糖酶酵母菌通過發(fā)酵生產(chǎn)乳糖酶，降低乳糖酶生產(chǎn)成本和應(yīng)用乳糖酶的費(fèi)用，提高含乳糖牛奶和奶制品處理效果，對增加人類食用牛奶和奶制品的營養(yǎng)，增強(qiáng)身體健康具有重要的實(shí)際意義。
文檔編號C12N15/63GK103045629SQ201210538198
公開日2013年4月17日 申請日期2012年12月13日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月13日
發(fā)明者池振明, 池哲, 周海翔, 徐金利, 李慧娟 申請人:吉林巨潤生物技術(shù)有限公司