專利名稱：一種固定化赤霉菌并用于生物轉(zhuǎn)化制備煙酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種將赤霉菌CA3-1 (.Gibberella intermedia, CGMCC No. 4903)固定化并用于制備煙酸的方法，屬于生物工程應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
煙酸屬于維生素B系列化合物，是人體不可缺少的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，在促進(jìn)人體正常發(fā)育、促進(jìn)新陳代謝、擴(kuò)張血管、緩解末梢血管痙攣等方面具有廣泛的作用。同時(shí)，煙酸也是一種重要的醫(yī)藥中間體和化工中間體，可以作為醫(yī)藥中間體生產(chǎn)異煙肼、尼可剎米、及煙酸肌醇酯治療皮膚病、高血壓病、動(dòng)脈硬化和冠心病等疾病的藥物。傳統(tǒng)的煙酸生產(chǎn)主要是采用化學(xué)合成法，如氨氧化法、高錳酸鉀氧化法、硝酸氧化法、臭氧氧化法、氣相氧化法、電解氧化法等，化學(xué)合成法合成條件苛刻，往往需要聞溫聞壓，過程能耗較大，并且產(chǎn)生大量的廢氣廢渣等，對(duì)環(huán)境造成極大的污染，不符合原子經(jīng)濟(jì)性和綠化化學(xué)的發(fā)展方向，與可持續(xù)發(fā)展戰(zhàn)略相違背?；瘜W(xué)合成法本身存在的局限以及環(huán)境問題促進(jìn)了生物催化法制備煙酸的發(fā)展。利用腈水解酶轉(zhuǎn)化腈類化合物制備有機(jī)酸日益成為化工產(chǎn)品生產(chǎn)的重要工藝，并廣泛性應(yīng)用在制藥、食品等領(lǐng)域。腈 水解酶屬于腈類物質(zhì)代謝酶系中的一種，可以高效的將3-氰基吡啶轉(zhuǎn)化為煙酸。生物催化法生產(chǎn)煙酸的條件溫和，反應(yīng)過程易于控制，對(duì)環(huán)境的影響小，相比于化學(xué)合成法，生物法具有更大的優(yōu)勢(shì)。盡管如此，生物催化法由于采用細(xì)胞或酶為催化劑，活性容易受到外界擾動(dòng)的影響，在穩(wěn)定性以及后續(xù)產(chǎn)物分離方面不具有優(yōu)勢(shì)。尤其對(duì)于腈類化合物轉(zhuǎn)化體系，底物對(duì)細(xì)胞存在一定的毒害作用，從而造成催化劑使用周期短、成本投入高的問題。固定化技術(shù)的出現(xiàn)可以彌補(bǔ)生物催化的缺陷。通過細(xì)胞或酶的固定化，提高其對(duì)外界擾動(dòng)的抵抗能力，增強(qiáng)對(duì)底物的耐受性，同時(shí)便于產(chǎn)物的分離提取，以及催化劑的回收重復(fù)利用。固定化細(xì)胞與游離細(xì)胞相比，雖然酶活性因操作過程的影響而有所降低，但有利于產(chǎn)物的分離純化，而且固定化細(xì)胞容易回收重復(fù)利用，提高了單位利用效率，降低了生產(chǎn)成本。因此，選擇合適的固定化材料和固定方法制備保留活性高、操作和儲(chǔ)存穩(wěn)定性好、能多次重復(fù)利用的固定化細(xì)胞前景值得期待。但是，至今為止，從未有利用產(chǎn)腈水解酶的絲狀真菌制備固定化細(xì)胞用于腈類化合物生物轉(zhuǎn)化的任何專利及文獻(xiàn)報(bào)道。本發(fā)明將腈水解酶產(chǎn)生菌赤霉菌CA3-1固定化，通過與游離菌體相比較，考察催化轉(zhuǎn)化3-氰基批唳制備煙酸的能力。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種將產(chǎn)腈水解酶的赤霉菌CA3-1 (Gibberellaintermedia, CGMCC No. 4903)固定化用于制備煙酸的方法。該菌株于2011年5月24日保藏在北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)的中國(guó)科學(xué)院微生物研究所中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，分類命名為Gibberella intermedia,保藏編號(hào)為CGMCC No.4903。本發(fā)明的技術(shù)方案為赤霉菌CA3-1 (.Gibberella intermedia, CGMCC No. 4903)通過液體培養(yǎng)得到菌液，經(jīng)過離心分離獲得菌體，用生理鹽水離心洗滌數(shù)次后重懸于生理鹽水中，加入海藻酸鈉溶液，混合均勻后逐滴滴入到CaCl2溶液中，固化，得到的固定化小球經(jīng)過濾、洗去表面未固定的菌體和CaCl2溶液。取定量的固定化小球參與反應(yīng)，加入PBS緩沖液(含有一定量的CaCl2),加底物3-氰基吡唳，在一定溫度、一定pH值的條件下反應(yīng)一定時(shí)間得到產(chǎn)物煙酸和副產(chǎn)物煙酰胺的混合溶液。上述過程中，腈水解酶產(chǎn)生菌的液體培養(yǎng)基(g/L)為磷酸二氫鉀2. 72，硫酸亞鐵0.0139，葡萄糖10，酵母粉7. 5，氯化鈉1. 16，己內(nèi)酰胺3. 39，pH值為7. O。培養(yǎng)條件為500mL三角瓶裝50mL培養(yǎng)基在30°C，220rpm，往復(fù)式搖床振蕩培養(yǎng)60h。離心分離所得菌體干重為O. 03g，海藻酸鈉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5. 5%，CaCl2溶液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%，固化時(shí)間7h，固化溫度0°C。形成的固定化小球用紗布過濾，用PBS緩沖液洗滌。轉(zhuǎn)化反應(yīng)時(shí)，PBS緩沖液的量為7mL，pH值為9. 0，其中含有30mM的CaCl2，底物3-氰基吡啶的濃度為IOOmM,溫度為40 °C，反應(yīng)時(shí)間為35min。


圖1固定化菌體生物轉(zhuǎn)化3-氰基吡啶的產(chǎn)物液相圖譜 圖2游離菌體生物轉(zhuǎn)化3-氰基吡啶的產(chǎn)物液相圖譜
具體實(shí)施例方式下面的實(shí)例將具體說明本發(fā)明的操作方法，但不能作為對(duì)本發(fā)明的限定。

實(shí)例一1、水解酶產(chǎn)生菌菌液的制備
液體培養(yǎng)基磷酸二氫鉀2. 72g，硫酸亞鐵O. 0139g,葡萄糖10g，酵母粉7. 5g，氯化鈉1.16g，己內(nèi)酰胺3. 39g，加水至1L，充分溶解后調(diào)pH值為7. O。培養(yǎng)方法從斜面菌種中用接種環(huán)挑取真菌，接種于搖瓶種子培養(yǎng)基中，500mL三角瓶裝50mL液體培養(yǎng)基，在30°C，220rpm條件下，培養(yǎng)60h。2、菌體固定化
將制備的菌液經(jīng)離心分離獲得菌體，用生理鹽水離心洗滌后，取O. 03菌體重懸于生理鹽水中，制備成9g/L的菌懸液，向其加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5. 5%的海藻酸鈉溶液，充分混合均勻后用注射器平穩(wěn)注入到質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1% ( 八)0&(12溶液中，(TC下固化7h，得到固定化小球經(jīng)過紗布過濾后用PBS緩沖液洗去未固定的菌體和CaCl2溶液，固化結(jié)束小球保存于含有30mM CaClJ^生理鹽水中。海藻酸鈉小球呈白色，直徑2mm左右。3、煙酸的生產(chǎn)方法
向上述制得的海藻酸鈉小球中，加入7mL的PBS緩沖液(含有30mM的CaCl2)，加入濃度為IOOmM的底物3-氰基吡啶7mL，40°C，pH9. O,反應(yīng)35min得到產(chǎn)物煙酸。液相檢測(cè)圖譜如圖1。作為對(duì)照，取與固定化菌體等量的游離菌體參與轉(zhuǎn)化反應(yīng)，加入7mL的PBS緩沖液，加入濃度為IOOmM的3-氰基吡啶7mL，40°C，pH9. O,反應(yīng)45min得到產(chǎn)物煙酸。液相檢測(cè)圖譜如圖2。
表I液相檢測(cè)數(shù)據(jù)以及反應(yīng)時(shí)間對(duì)比
權(quán)利要求
1.一種利用固定化赤霉菌細(xì)胞生產(chǎn)煙酸的方法，其特征是赤霉菌CA3-1 (.Gibberellaintermedia)CGMCC No. 4903，通過液體培養(yǎng)得到菌液，離心分離獲得菌體，用生理鹽水離心洗滌后重懸于生理鹽水中，得到濃度為6-10g/L的菌懸液；取2-6mL菌懸液加入2-6mL 3. 5-6. 5%海藻酸鈉溶液，混合均勻后逐滴滴入到質(zhì)量濃度為O. 1-1%的CaCl2溶液中，于0-10°C下，固化2-8h，得到的固定化小球，經(jīng)過濾，洗去表面未固定的細(xì)胞和CaCl2溶液；最后將固定化小球保存在含有20-50mM CaCl2、0-10°C的生理鹽水中，用于轉(zhuǎn)化生產(chǎn)煙酸。
2.如權(quán)利要求1所述的利用固定化赤霉菌細(xì)胞生產(chǎn)煙酸的方法，其特征為，取4-10mL的固定化小球的生理鹽水溶液參與反應(yīng)，加入3-7mL pH值6. 0-10. O的PBS緩沖液，其中含有20-50mM的CaCl2，加50_150mM底物3-氰基吡啶，在30_50°C、pH值為6. 0-9. O的條件下反應(yīng)15-45min，得到產(chǎn)物煙酸和副產(chǎn)物煙酰胺的混合溶液。
3.如權(quán)利要求1所述的利用固定化赤霉菌細(xì)胞生產(chǎn)煙酸的方法，其特征是權(quán)利要求1中所述的赤霉菌CA3-1的液體培養(yǎng)如下培養(yǎng)基為葡萄糖6-12g,酵母粉5-10g,磷酸二氫鉀l_3g，氯化鈉l_2g，硫酸亞鐵O. 01-0.1g,己內(nèi)酰胺2-4g，加水至lL，pH為7. 0，培養(yǎng)條件為 500mL 三角瓶裝液 30-60mL，于 25_35°C、180_220rpm 搖床培養(yǎng) 36_72h。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的腈水解酶產(chǎn)生菌的固定化方法，其特征是用于固定化的腈水解酶產(chǎn)生菌為真菌-赤霉菌 CA3-1 (.Gibberella),保藏號(hào) CGMCC No. 4903。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域，具體涉及一種赤霉菌CA3-1(Gibberella intermedia)，保藏號(hào)CGMCC No. 4903固定化并應(yīng)用于生物轉(zhuǎn)化制備煙酸的方法。具體是將赤霉菌CA3-1固定化，加入適量的3-氰基吡啶，選擇固定化菌體的最適反應(yīng)條件，得到產(chǎn)物煙酸。菌體經(jīng)固定化后增強(qiáng)了菌體對(duì)底物的耐受性，提高了單位菌體的生產(chǎn)能力，并大大簡(jiǎn)化了產(chǎn)物的分離過程，重復(fù)利用次數(shù)顯著增多，為利用赤霉菌進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化法制備煙酸的工藝實(shí)現(xiàn)提供了基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C12R1/645GK103060397SQ20121053837
公開日2013年4月24日 申請(qǐng)日期2012年12月13日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月13日
發(fā)明者史勁松, 李恒, 楊濤, 龔勁松, 許正宏, 孫文敬, 周強(qiáng) 申請(qǐng)人:江南大學(xué), 江西省德興市百勤異Vc鈉有限公司