一種防治芝麻枯萎病的生防菌、分離方法、菌劑及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種防治芝麻枯萎病的生防菌、分離方法、該生防菌菌劑及其應(yīng)用，其中該生防菌為地衣芽孢桿菌（Bacillus?licheniformis）SF3-33，保藏單位：中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址，湖北省武漢市武昌珞珈山武漢大學(xué)保藏中心，保藏日期：2012年11月28日，保藏號(hào)：CCTCC?NO:M?2012488。本發(fā)明的分離方法是通過(guò)對(duì)藎草根系土壤進(jìn)行微生物分離、對(duì)峙培養(yǎng)，分離得到防治芝麻枯萎病的生防菌。本發(fā)明分離得到的生防菌可以有效防治芝麻枯萎病同時(shí)促進(jìn)芝麻植株的生長(zhǎng)。將采用該生防菌制得的菌劑對(duì)芝麻植株灌根處理，芝麻植株的病害嚴(yán)重度最低可降至10%以下，防效可達(dá)80%以上，并具有明顯的對(duì)芝麻植株的促生效果。
【專利說(shuō)明】一種防治芝麻枯萎病的生防菌、分離方法、菌劑及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種防治芝麻枯萎病的生防菌，同時(shí)涉及該生防菌的分離方法、該生防菌菌劑及其應(yīng)用，屬于植物保護(hù)【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]芝麻(Sesamum indicum),隸屬于胡麻科胡麻屬，是世界上最古老的油料作物之一，也是我國(guó)重要的優(yōu)質(zhì)油料作物。我國(guó)芝麻年種植面積1200萬(wàn)畝左右，總產(chǎn)量約75萬(wàn)噸，在國(guó)際油料貿(mào)易中具有重要的地位。芝麻枯萎病是(Sesame Fusarium wilt, SFW)由尖孢鐮刀菌芝麻?；?Fusarium oxysporum f.sp.sesami (Zaprometoff)Castellani,FOS)病菌侵染引起的一種土傳真菌病害。芝麻在全生育期均可被尖孢鐮刀菌侵染。該病屬于世界性病害，印度、蘇丹、埃及和巴基斯坦等許多芝麻生產(chǎn)國(guó)每年均有不同程度發(fā)生。該病在我國(guó)主要發(fā)生在東北、華北、西北、黃淮以及江淮部分地區(qū)，常年發(fā)生率15%左右，嚴(yán)重發(fā)生時(shí)可達(dá)30%以上，常導(dǎo)致芝麻種子不成熟、籽粒瘦癟，易在收獲前炸落，嚴(yán)重威脅和阻礙著芝麻的生產(chǎn)與發(fā)展。由于芝麻種質(zhì)資源遺傳基礎(chǔ)狹窄，目前未發(fā)現(xiàn)對(duì)枯萎病表現(xiàn)免疫的芝麻種質(zhì)資源，高抗枯萎病材料比例亦較低，加之芝麻枯萎病屬于土傳病害，采用農(nóng)業(yè)防治和化學(xué)藥劑防治效果不夠明顯。至今，國(guó)內(nèi)外對(duì)芝麻枯萎病尚無(wú)較好的防控技術(shù)方法。開發(fā)新型、高效和安全的微生物殺菌劑是芝麻枯萎病防控研究的重要方向，也是實(shí)現(xiàn)我國(guó)芝麻產(chǎn)業(yè)安全可持續(xù)發(fā)展的需要，符合社會(huì)發(fā)展需求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的是提供一種防治芝麻枯萎病的生防菌。
[0004]為了實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是提供一種防治芝麻枯萎病的生防菌，所述生防菌為地衣芽孢桿菌(Bacillusl`icheniformis)SF3_33,保藏日期:2012年11月28日，保藏單位:中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址，湖北省武漢市武昌珞珈山武漢大學(xué)保藏中心，保藏號(hào):CCTCC N0:M2012488o
[0005]本發(fā)明的目的還在于提供一種防治芝麻枯萎病的生防菌的分離方法。
[0006]本發(fā)明所采用的技術(shù)方案還在于提供一種防治芝麻枯萎病的生防菌的分離方法，包括以下步驟:
[0007]I)病原菌及土壤微生物的分離:
[0008]a)病原菌的分離:
[0009]取芝麻枯萎病發(fā)病植株，對(duì)芝麻植株的病桿進(jìn)行消毒、清洗，再將病感中央維管束組織放入含有50 μ g/mL氯霉素的PDA培養(yǎng)基上，在26_28°C條件下培養(yǎng)3_4d，然后將優(yōu)勢(shì)菌落在PDA培養(yǎng)基中培養(yǎng)3-4d后，進(jìn)行單孢分離純化，保存?zhèn)溆茫?br> [0010]b) 土壤微生物的分離:
[0011]稱取藎草根部土壤，加入無(wú)菌水，采用濃度梯度法稀釋土壤懸液，取濃度梯度土壤懸液均勻涂布在1/10TSA培養(yǎng)平板上，在26-28°C條件下，倒置培養(yǎng)l_2d ;將生長(zhǎng)出的菌落接種于TSA培養(yǎng)基進(jìn)行分離純化，然后將純化的細(xì)菌與50%甘油等量混合_70°C冷凍保存?zhèn)溆茫?br> [0012]2)拮抗菌篩選:
[0013]將培養(yǎng)的不同土壤細(xì)菌與尖孢鐮刀菌芝麻?；驮赑DK培養(yǎng)基上對(duì)峙培養(yǎng)，判斷有無(wú)拮抗作用；
[0014]3 )對(duì)拮抗菌進(jìn)行鑒定分類。
[0015]所述芝麻植株病桿為芝麻桿病健交界處的莖桿。
[0016]所述PDA培養(yǎng)基:馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂粉15g，蒸餾水1000mL,ρΗ7.0-7.2，121 °C濕熱滅菌 20min。
[0017]所述1/10TSA 培養(yǎng)基為:TSB (Trypticase Soya Broth, Difc0.) 3g,瓊脂 15g,蒸懼水 1000mL, ρΗ7.0-7.2，121 °C濕熱滅菌 20min。
[0018]所述TSA 培養(yǎng)基為:TSB (Trypticase Soya Broth, Difc0.) 30g,瓊脂 15g,蒸懼水1000mL, ρΗ7.0-7.2，121 °C濕熱滅菌 20min。
[0019]所述PDK培養(yǎng)基:馬鈴薯200g，葡萄糖20g，蛋白胨10g，瓊脂15g，蒸餾水1000mL,ρΗ7.0-7.2，121 °C濕熱滅菌 20min。
[0020]本發(fā)明的目的還在于提供一種防治芝麻枯萎病的生防菌菌劑。
[0021]本發(fā)明所采用的技術(shù)方案還在于提供一種防治芝麻枯萎病的生防菌菌劑，將生防菌接種在LB液體培養(yǎng)基中，在30-33°C條件下振蕩培養(yǎng)2-3d，離心，取沉淀加入無(wú)菌水即得。
[0022]所述LB液體培養(yǎng)基為:酵母提取物5g,蛋白胨IOg,氯化鈉IOg,瓊脂15g,蒸懼水1000mL, ρΗ7.0-7.2，121 °C濕熱滅菌 20min。
[0023]本發(fā)明的目的還在于提供一種防治芝麻枯萎病的生防菌在促進(jìn)芝麻生長(zhǎng)方面的應(yīng)用。
[0024]本發(fā)明所采用的技術(shù)方案還在于提供一種防治芝麻枯萎病的生防菌在促進(jìn)芝麻生長(zhǎng)方面的應(yīng)用。
[0025]本發(fā)明通過(guò)對(duì)藎草根系土壤進(jìn)行微生物分離、對(duì)峙培養(yǎng)，分離得到一種防治芝麻枯萎病的生防菌，該生防菌可以有效防治芝麻枯萎病同時(shí)促進(jìn)芝麻植株的生長(zhǎng)。將采用該生防菌制得的菌劑對(duì)芝麻植株灌根處理，芝麻植株的病害嚴(yán)重度最低可降至10%以下，防效可達(dá)80%以上，并具有明顯的對(duì)芝麻植株的促生效果。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0026]圖1為本發(fā)明的生防菌與尖孢鐮刀菌芝麻?；蛯?duì)峙培養(yǎng)；
[0027]圖2為本發(fā)明的生防菌在培養(yǎng)平板上的菌落形態(tài)；
[0028]圖3為本發(fā)明的生防菌對(duì)芝麻植株生長(zhǎng)促進(jìn)作用效果圖，
[0029]圖中，圖3左:為本發(fā)明的溫室盆缽試驗(yàn)生防菌對(duì)芝麻植株生長(zhǎng)促進(jìn)作用的效果圖，
[0030]圖3右:為本發(fā)明的大田盆缽試驗(yàn)生防菌對(duì)芝麻植株生長(zhǎng)促進(jìn)作用的效果圖?！揪唧w實(shí)施方式】[0031]芝麻枯病病原菌株HSFO 09100是河南省芝麻研究中心與2009年從河南省封丘魯崗鄉(xiāng)和寨村芝麻病株中分離得到，并由河南省芝麻研究中心植物病理研究室保存?zhèn)溆谩?br> [0032]芝麻枯病病原菌株HSFO 10044是河南省芝麻研究中心與2010年從山西省晉中市榆次縣芝麻病株中分離得到，并由河南省芝麻研究中心植物病理研究室保存?zhèn)溆谩?br> [0033]藎草根部土壤為河南省西峽縣云臺(tái)村禾本科藎草根部土壤。
[0034]培養(yǎng)基的配制:
[0035]PDA培養(yǎng)基:馬鈴薯200g,葡萄糖20g,瓊脂粉15g，蒸餾水1000mL, ρΗ7.0-7.2，121 °C濕熱滅菌20min。
[0036]1/10TSA 培養(yǎng)基為:TSB (Trypticase Soya Broth, Difc0.) 3g,瓊脂 15g,蒸懼水1000mL, ρΗ7.0-7.2，121 °C濕熱滅菌 20min。
[0037]TSA 培養(yǎng)基為:TSB (Trypticase Soya Broth, Difc0.) 30g,瓊脂 15g,蒸懼水1000mL, ρΗ7.0-7.2，121 °C濕熱滅菌 20min。
[0038]PDK培養(yǎng)基:馬鈴薯200g，葡萄糖20g，蛋白胨10g，瓊脂15g，蒸餾水lOOOmL，ρΗ7.0-7.2，121 °C濕熱滅菌 20min。
[0039]LB液體培養(yǎng)基為:酵母提取物5g，蛋白胨10g，氯化鈉10g，瓊脂15g，蒸餾水1000mL, ρΗ7.0-7.2，121 °C濕熱滅菌 20min。
[0040]實(shí)施例1、病原菌的分離
[0041]在芝麻桿病健交界處用無(wú)菌切割刀將莖桿切成3cm的小段，75%酒精表面消毒30s, 3%次氯酸鈉表面消毒5min，然后用無(wú)菌水沖洗4次；再用無(wú)菌切割刀把莖桿小段從中部縱切成兩半，使維管束組織顯露出來(lái)；輕輕鑷取中央維管束組織，放于含有50 μ g/mL氯霉素的PDA培養(yǎng)基上。26-28 °C`恒溫箱中恒溫保濕培養(yǎng)3d后，挑選出優(yōu)勢(shì)菌落PDA培養(yǎng)3d后，進(jìn)行單孢分離純化，并保存?zhèn)溆谩?br> [0042]實(shí)施例2、土壤微生物的分離
[0043]取采集的藎草根部土壤lg，用無(wú)菌水梯度稀釋至10_5_10_3g/mL，將稀釋好的混合液均勻地涂布于1/10TSA培養(yǎng)平板上，于28°C恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)2d,待細(xì)菌菌落長(zhǎng)出后，用無(wú)菌牙簽挑取大小、顏色或形態(tài)不同的細(xì)菌在TSA培養(yǎng)基表面劃線分離純化。
[0044]實(shí)施例3、生防菌篩選
[0045]生防菌篩選采用平板對(duì)峙培養(yǎng)法，在PDK平板中央接尖孢鐮刀菌菌塊，離菌塊25mm處接待測(cè)菌，置于26_28°C恒溫箱培養(yǎng)6d，觀察有無(wú)抑菌圈產(chǎn)生，并測(cè)量抑菌圈大小，如圖1所示。
[0046]拮抗測(cè)試結(jié)果表明，藎草根系土壤中發(fā)現(xiàn)一種芝麻枯萎病生防菌，命名為SF3-33。
[0047]實(shí)施例4、生防菌形態(tài)學(xué)觀察
[0048]生防菌SF3-33菌落白色，近圓形，直徑2_3mm，表面干燥皺褶，不透明，較粘稠，易挑取，如圖2所示。
[0049]實(shí)施例5、生防菌的鑒定分類
[0050]對(duì)篩選出的生防菌進(jìn)行測(cè)序，鑒定結(jié)果為地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)。
[0051]16SrDNA 基因序列測(cè)定結(jié)果:gtgctagtacatgcagtcgagctgacagatgggagcttgctccctgatgttagcggcggacgggtgagtaacacgtgggtaacctgcctgtaagactgggataactccgggaaaccggggc
【權(quán)利要求】
1.一種防治芝麻枯萎病的生防菌，其特征在于，所述生防菌為地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis) SF3-33，保藏單位:中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址:湖北省武漢市武昌珞珈山武漢大學(xué)保藏中心，保藏號(hào)=CCTCC N0:M 2012488。
2.一種如權(quán)利要求1所述的防治芝麻枯萎病生防菌的分離方法，其特征在于，包括以下步驟: 1)病原菌及土壤微生物的分離: a)病原菌的分離: 取芝麻枯萎病發(fā)病植株，對(duì)芝麻植株的病桿進(jìn)行消毒、清洗，再將病感中央維管束組織放入含有50 μ g/mL氯霉素的PDA培養(yǎng)基上，在26-28 °C條件下培養(yǎng)3_4d，然后將優(yōu)勢(shì)菌落在PDA培養(yǎng)基中培養(yǎng)3-4d后，進(jìn)行單孢分離純化，保存?zhèn)溆茫? b)土壤微生物的分離: 稱取藎草根部土壤，加入無(wú)菌水，采用濃度梯度法稀釋土壤懸液，取濃度梯度土壤懸液均勻涂布在1/10TSA培養(yǎng)平板上，在26-28°C條件下，倒置培養(yǎng)l_2d ;將生長(zhǎng)出的菌落接種于TSA培養(yǎng)基進(jìn)行分離純化，然后將純化的細(xì)菌與50%甘油等量混合_70°C冷凍保存?zhèn)溆茫? 2)拮抗菌篩選: 將培養(yǎng)的不同土壤細(xì)菌與尖孢鐮刀菌芝麻專化型在PDK培養(yǎng)基上對(duì)峙培養(yǎng)，判斷有無(wú)拮抗作用； 3)對(duì)拮抗菌進(jìn)行鑒定分類。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種防治`芝麻枯萎病生防菌的分離方法，其特征在于，所述芝麻植株病桿為芝麻桿病健交界處的莖桿。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種防治芝麻枯萎病生防菌的分離方法，其特征在于，所述PDA培養(yǎng)基:馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂粉15g，蒸餾水1000mL，pH7.0-7.2，121 °C濕熱滅菌 20min。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種防治芝麻枯萎病生防菌的分離方法，其特征在于，所述1/10TSA 培養(yǎng)基為:TSB (Trypticase Soya Broth, Difc0.) 3g,瓊月旨 15g,蒸懼水 1000mL,ρΗ7.0-7.2，121 °C濕熱滅菌 20min。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種防治芝麻枯萎病生防菌的分離方法，其特征在于，所述 TSA 培養(yǎng)基為:TSB (Trypticase Soya Broth, Difc0.) 30g,瓊脂 15g,蒸懼水 1000mL,ρΗ7.0-7.2，121 °C濕熱滅菌 20min。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種防治芝麻枯萎病生防菌的分離方法，其特征在于，所述PDK培養(yǎng)基:馬鈴薯200g,葡萄糖20g，蛋白胨IOg,瓊脂15g，蒸餾水1000mL, ρΗ7.0-7.2，121 °C濕熱滅菌20min。
8.—種如權(quán)利要求1所述的防治芝麻枯萎病的生防菌菌劑，其特征在于，將生防菌接種在LB液體培養(yǎng)基中，在30-33°C條件下振蕩培養(yǎng)2-3d，離心，取沉淀加入無(wú)菌水即得。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的防治芝麻枯萎病的生防菌菌劑，其特征在于，所述LB液體培養(yǎng)基為:酵母提取物5g，蛋白胨10g，氯化鈉10g，瓊脂15g，蒸餾水lOOOmL，pH7.0-7.2，121 °C濕熱滅菌20min。
10.一種防治芝麻枯萎病的生防菌在促進(jìn)芝麻生長(zhǎng)方面的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12R1/10GK103865824SQ201210538685
【公開日】2014年6月18日 申請(qǐng)日期:2012年12月13日 優(yōu)先權(quán)日:2012年12月13日
【發(fā)明者】張海洋, 苗紅梅, 常淑嫻, 段迎輝, 魏利斌 申請(qǐng)人:河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院