專(zhuān)利名稱(chēng)：草莓黃萎病的膏狀生防制劑、制備方法、應(yīng)用及其專(zhuān)用菌株的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物領(lǐng)域，具體而言，涉及一種草莓黃萎病的膏狀生防制劑、
制備方法、應(yīng)用及其專(zhuān)用菌株。
背景技術(shù)：
草莓(Fragaria ananassa)屬于薔薇科(Rosaceae)草莓屬多年生草本植物，目前世界草莓每年的產(chǎn)量已經(jīng)超過(guò)500萬(wàn)噸，在世界小漿果生產(chǎn)中其產(chǎn)量榮居首位，近年來(lái)大棚栽培草莓在逐漸興起，種植面積逐漸擴(kuò)大，但卻存在著輪作換地與設(shè)施固定的矛盾，連作 障礙日益明顯，草莓連作病害是目前制約草莓生產(chǎn)的主要因素，尤其是草莓黃萎病，世界各國(guó)草莓產(chǎn)區(qū)普遍流行此病，該病害的發(fā)生，輕者導(dǎo)致減產(chǎn)減收，重者絕收，嚴(yán)重制約了草莓的可持續(xù)發(fā)展。草莓黃萎病(Fusariumoxysporum Schl. f. sp.1agenaria Winks et Wi)是草莓種植中一種常見(jiàn)的土傳性病害，由大麗花輪枝孢菌(Verticllium albo-atrum Reinke dtBerthold和Verticillium dahliae Klrmahn)病原菌侵染引起病害。據(jù)調(diào)查顯不，第二年連茬栽種草莓地草莓黃萎病發(fā)病率達(dá)82.9%，第三年發(fā)病率可達(dá)100 %。為此，草莓黃萎病的生物防治特別是生物農(nóng)藥的研究與開(kāi)發(fā)是草莓生產(chǎn)可持續(xù)發(fā)展的需要。微生物農(nóng)藥對(duì)環(huán)境的選擇壓力較小，且不易使靶標(biāo)病原菌產(chǎn)生抗藥性，因此，生物源農(nóng)藥的研究將會(huì)為人們提供更安全更高效的防治草莓黃萎病的途徑?，F(xiàn)在已用于防治草莓黃萎病的微生物主要有枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、假單胞菌(Pseudomonas sp.)、沙雷氏菌(Serratia sp. )、VAM 真菌等，劑型主要為可濕性粉劑、懸浮劑、油懸浮劑等。但是到目前為止，尚沒(méi)有用棘孢木霉菌株(Trichoderma asperellum)及其膏狀生防制劑防治草莓黃萎病的相關(guān)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于解決上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足和問(wèn)題，提供一種用于防治高效防治草莓黃萎病的基因工程菌菌株、含該菌株的膏狀生防制劑及其制備方法和應(yīng)用。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明提供了一株基因工程菌菌株，其分類(lèi)命名為棘孢木霉(Jrichoderma asperellum) GY20,其保藏編號(hào)為CGMCC NO :4899。本發(fā)明還提供了一種草莓黃萎病的膏狀生防制劑，其中，所述制劑的活性成分為上述提及的所述棘孢木霉(Trichoderma asperellum ) GY20的菌絲與厚垣孢子。進(jìn)一步地，所述菌絲與厚垣孢子的比例，由以下培養(yǎng)方法決定
將在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上長(zhǎng)好的棘孢木霉(斤icAoofe/ma asperellum) GY20孢子用無(wú)菌水洗下，調(diào)節(jié)成孢子含量為IO5孢子/mL的接種液，按5% (V/V)接種量接種于馬
鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)48小時(shí)；將上步所得培養(yǎng)液以10% (V/V)的接種量再次接種于馬鈴薯葡萄液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)48小時(shí)進(jìn)一步擴(kuò)增后，再將所得培養(yǎng)液以10%(V/V)的接種量再次接種于含20L發(fā)酵培養(yǎng)液的發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)后離心得到。
優(yōu)選地，所述發(fā)酵罐中的發(fā)酵培養(yǎng)液各組分的重量份含量為甜菜液380-420、七水硫酸鎂3-5、磷酸二氫鉀38-42 ;所述發(fā)酵的條件為溶氧100%，攪拌速度為300-400轉(zhuǎn)/分，發(fā)酵溫度25-27攝氏度，發(fā)酵時(shí)間48小時(shí)，pH 7. 0-7. 2 ;所述振蕩培養(yǎng)的條件均為140-160轉(zhuǎn)/分、25-27攝氏度；所述發(fā)酵培養(yǎng)后離心的條件為7500-8500轉(zhuǎn)/分，離心10分鐘。最佳條件為所述發(fā)酵罐中的發(fā)酵培養(yǎng)液含量為甜菜液400. 0g、七水硫酸鎂4. 0g、磷酸二氫鉀40. Og ;所述發(fā)酵的條件為溶氧100%，攪拌速度為350轉(zhuǎn)/分，發(fā)酵溫度26攝氏度，發(fā)酵時(shí)間48小時(shí)，pH 7.0-7. 2。優(yōu)選地，所述振蕩培養(yǎng)的條件均為150轉(zhuǎn)/分、26攝氏度；所述發(fā)酵培養(yǎng)后離心的條件為8000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘。 優(yōu)選地，所述膏狀生防制劑還包括O. 00Γ0. 05%的銅離子抑制劑。優(yōu)選地，所述膏狀生防制劑還包括5 10%的可溶性淀粉。優(yōu)選地，所述可溶性淀粉為土豆淀粉。本發(fā)明還提供了一種制備上述草莓黃萎病的膏狀生防制劑的方法，其中，所述方法包括
I)將在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上長(zhǎng)好的棘孢木霉(Trichoderma asperellum) GY20孢子用無(wú)菌水洗下，調(diào)節(jié)成孢子含量為IO5孢子/mL的接種液，按5% (V/V)接種量接種于馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)48小時(shí)；將上步所得培養(yǎng)液以10% (V/V)的接種量再次接種于馬鈴薯葡萄液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)48小時(shí)進(jìn)一步擴(kuò)增后，再將所得培養(yǎng)液以10%(V/V)的接種量再次接種于含20L發(fā)酵培養(yǎng)液的發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)后離心得到。2)調(diào)節(jié)pH值將上述菌絲與厚垣孢子混合體的pH值調(diào)節(jié)為3. (Γ4. O ；
3)制得膏狀生防制劑向所述步驟2)得到的混合體中加入0. 00Γ0. 05%的銅離子抑制劑，最后加入5 10%的可溶性淀粉，攪拌均勻即可。優(yōu)選地，所述發(fā)酵罐中的發(fā)酵培養(yǎng)液各組分的重量份含量為甜菜液380-420、七水硫酸鎂3-5、磷酸二氫鉀38-42 ;所述發(fā)酵的條件為溶氧100%，攪拌速度為300-400轉(zhuǎn)/分，發(fā)酵溫度25-27攝氏度，發(fā)酵時(shí)間48小時(shí)，pH 7. 0-7. 2 ;所述振蕩培養(yǎng)的條件均為140-160轉(zhuǎn)/分、25-27攝氏度；所述發(fā)酵培養(yǎng)后離心的條件為7500-8500轉(zhuǎn)/分，離心10分鐘。最佳條件為所述振蕩培養(yǎng)的條件均為150轉(zhuǎn)/分、26攝氏度；所述發(fā)酵罐中的發(fā)酵培養(yǎng)液含量為甜菜液400. 0g、七水硫酸鎂4. 0g、磷酸二氫鉀40. Og ;所述發(fā)酵的條件為溶氧100%，攪拌速度為350轉(zhuǎn)/分，發(fā)酵溫度26攝氏度，發(fā)酵時(shí)間48小時(shí)，pH 7. 0-7. 2 ；所述發(fā)酵培養(yǎng)后離心的條件為8000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘；所述可溶性淀粉為土豆淀粉。再者，本發(fā)明還提供了所述的基因工程菌菌株棘孢木mTrichodermaasperellum) GY20及所制得的膏狀生防制劑在防治草莓黃萎病中的應(yīng)用。本發(fā)明用于防治草莓黃萎病的含基因工程菌菌株棘孢木霉(Trichodermaasperellum^ GY20的膏狀生防制劑與現(xiàn)有的“EM菌根”相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)1、本發(fā)明膏狀生防制劑由活性組分與輔料組成，活性組分為棘孢木霉(Tri ch ο dermaasperellum)GY20菌絲與厚垣孢子,其厚垣孢子分散在木霉菌絲中,其制備成的膏狀生防制劑產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定，可室溫保存18個(gè)月，冷藏條件下保存3年；2、本發(fā)明膏狀生防制劑對(duì)草莓黃萎病有良好防效溫室試驗(yàn)結(jié)果表明，GY20對(duì)草莓黃萎病的防治效果均可達(dá)90%以上，顯著高于“EM菌根”對(duì)草莓黃萎病的防治效果45. 93% ；
3、無(wú)公害本發(fā)明棘孢木霉(TricAoofezmaGY20可安全釋放的真菌,故不會(huì)因農(nóng)藥的使用帶來(lái)的一系列環(huán)境負(fù)效應(yīng)，同時(shí)含該木霉的膏狀生防制劑的使用極大的減少了草莓生產(chǎn)中化學(xué)農(nóng)藥的施用量，不會(huì)產(chǎn)生任何廢水廢氣廢渣，為草莓無(wú)公害生物防治提供可靠保證，造福于現(xiàn)代高效農(nóng)業(yè)；
4、成本較低本發(fā)明棘孢木霉(TricAoofezmaGY20及其膏狀生防制劑生產(chǎn)成本很低，企業(yè)獲取的利潤(rùn)空間極大。。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明的生物材料棘孢木霉asperellum) GY20的保藏日期為2011年5月25日，保藏單位全稱(chēng)為中國(guó)微生物生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，簡(jiǎn)稱(chēng)CGMCC，地址為北京.中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，其保藏編號(hào)為CGMCC NO :4899。 所述棘孢木霉GY20具有如下特征25°C黑暗條件下培養(yǎng)4d，菌落直徑53-55mm，菌絲體白色，絮狀，茂盛；分生孢子結(jié)構(gòu)大量產(chǎn)生，產(chǎn)孢區(qū)均勻分布，灰綠色；瓶梗式產(chǎn)孢，分生孢子橢圓形、近球形，表面有細(xì)刺。木霉菌對(duì)多種重要植物病原真菌有作用，如腐霉菌、輪枝菌、鐮刀菌、長(zhǎng)孺孢菌、交鏈孢菌、絲核菌、葡萄孢菌等。一種草莓黃萎病的膏狀生防制劑，其中，所述制劑的活性成分為權(quán)利要求1所述棘抱木霉(Trichoderma asperellum ) GY20的菌絲與厚垣抱子。其中，所述菌絲與厚垣孢子的比例，由以下培養(yǎng)方法決定
將在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上長(zhǎng)好的棘孢木霉(斤icAoofe/ma asperellum) GY20孢子用無(wú)菌水洗下，調(diào)節(jié)成孢子含量為IO5孢子/mL的接種液，按5% (V/V)接種量接種于馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)48小時(shí)；將上步所得培養(yǎng)液以10% (V/V)的接種量再次接種于馬鈴薯葡萄液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)48小時(shí)進(jìn)一步擴(kuò)增后，再將所得培養(yǎng)液以10%(V/V)的接種量再次接種于含20L發(fā)酵培養(yǎng)液的發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)后離心得到。其中，所述發(fā)酵罐中的發(fā)酵培養(yǎng)液含量為甜菜液400.(^、七水硫酸鎂4.(^、磷酸二氫鉀40. Og ;所述發(fā)酵的條件為溶氧100%，攪拌速度為350轉(zhuǎn)/分，發(fā)酵溫度26攝氏度，發(fā)酵時(shí)間48小時(shí)，pH 7. 0-7. 2 ;所述振蕩培養(yǎng)的條件均為150轉(zhuǎn)/分、26攝氏度；所述發(fā)酵培養(yǎng)后離心的條件為8000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘。進(jìn)一步地，所述膏狀生防制劑的PH值為3. (Γ4. O，優(yōu)選PH值為3. 5。進(jìn)一步地，所述膏狀生防制劑還包括0. 00Γ0. 05%的銅離子抑制劑，優(yōu)選所述膏狀生防制劑包括0. 00Γ0. 05%的銅離子抑制劑，優(yōu)選0. 01%的MDA-5。進(jìn)一步地，所述膏狀生防制劑還包括5 10%的可溶性淀粉。優(yōu)選地，所述膏狀生防制劑還包括5 10%的可溶性淀粉。優(yōu)選地，所述可溶性淀粉為8%的土豆淀粉。另一方面，本發(fā)明保護(hù)一種制備上述所述的草莓黃萎病的膏狀生防制劑的方法，其中，所述方法包括
I)將在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上長(zhǎng)好的棘孢木霉(Trichoderma asperellum) GY20孢子用無(wú)菌水洗下，調(diào)節(jié)成孢子含量為IO5孢子/mL的接種液，按5% (V/V)接種量接種于馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)48小時(shí)；將上步所得培養(yǎng)液以10% (V/V)的接種量再次接種于馬鈴薯葡萄液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)48小時(shí)進(jìn)一步擴(kuò)增后，再將所得培養(yǎng)液以10%(V/V)的接種量再次接種于含20L發(fā)酵培養(yǎng)液的發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)后離心得到。2)調(diào)節(jié)pH值將上述菌絲與厚垣孢子混合體的pH值調(diào)節(jié)為3. (Γ4. O ；
3)制得膏狀生防制劑向所述步驟2)得到的混合體中加入O. 00Γ0. 05%的銅離子抑制劑，最后加入5 10%的可溶性淀粉，攪拌均勻即可。其中，所述振蕩培養(yǎng)的條件均為150轉(zhuǎn)/分、26攝氏度；所述發(fā)酵罐中的發(fā)酵培養(yǎng)液含量為甜菜液400. 0g、七水硫酸鎂4. 0g、磷酸二氫鉀40. Og ;所述發(fā)酵的條件為溶氧100%，攪拌速度為350轉(zhuǎn)/分，發(fā)酵溫度 26攝氏度，發(fā)酵時(shí)間48小時(shí)，pH 7. 0-7. 2 ;所述發(fā)酵培養(yǎng)后離心的條件為8000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘；所述可溶性淀粉為土豆淀粉。具體地，本發(fā)明的防治草莓黃萎病菌株GY20制備的膏狀生防制劑，其制備方法包括以下步驟
(A)菌液的獲得
用無(wú)菌接種刀挑取事先在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)上培養(yǎng)好的GY20孢子，用無(wú)菌水洗下調(diào)節(jié)成孢子含量為IO5孢子/mL的接種液，按5% (V/V)接種量接種于裝有200ml馬鈴薯葡萄液體培養(yǎng)基(PD)的容積為750 ml的三角瓶中，于26 °C >150 rpm/min條件下振蕩培養(yǎng)48 h，將上步所得培養(yǎng)液200 ml等份接種于4個(gè)裝有500ml PD培養(yǎng)液的容積為2000 ml的三角瓶中，150 rpm、26°C條件下振蕩培養(yǎng)48 h ;把所得的2000ml培養(yǎng)液接種于裝有20L培養(yǎng)液的容積為30L的發(fā)酵罐(鎮(zhèn)江東方GUS-30)，20L發(fā)酵培養(yǎng)液含量為甜菜液400. 0g、七水硫酸鎂4. 0g、磷酸二氫鉀40. 0g，設(shè)置發(fā)酵條件為溶氧100%，攪拌速度為350rpm，發(fā)酵溫度26 °C，發(fā)酵時(shí)間48 h，pH 7· 0_7· 2。(B)膏狀生防制劑加工工藝
將發(fā)酵好的發(fā)酵液按如下方法加工成膏狀生防制劑先將發(fā)酵液在8000rpm/min條件下離心lOmin，得菌絲及厚垣孢子混合體，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至3. 0^4. O,并加入0. 00Γ0. 05%的銅離子抑制劑，最后加入5 10%的可溶性淀粉，攪拌均勻即制成了膏狀生防制劑。優(yōu)選地，上述步驟(B)中用鹽酸調(diào)節(jié)菌絲及厚垣孢子混合體pH至3. (Γ4. O后，力口入0. 001%的銅離子抑制劑，最后加入8%的可溶性淀粉。再一方面，本發(fā)明保護(hù)的是所述的基因工程菌菌株棘孢木霉(Trichodermaasperellum) GY20及上述任一所述的膏狀生防制劑在防治草莓黃萎病中的應(yīng)用。根據(jù)以下實(shí)施例，可以更好的理解本發(fā)明。實(shí)施案例中所描述的具體的物料配比，工藝條件及其結(jié)果僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會(huì)限制權(quán)利要求書(shū)中所詳細(xì)描述的本發(fā)明。實(shí)施例1膏狀生防制劑及其制備方法 膏狀生防制劑的組分為
活性組分棘孢木霉(Trichoderma asperellum ) GY20菌絲及厚垣孢子混合體94. 999%
銅離子抑制劑MDA-5 0. 001%
土豆淀粉5%
PH值3
上述所述百分比為重量百分比。
上述膏狀生防制劑的制備方法包括以下步驟
(A)菌液的獲得
用無(wú)菌接種刀挑取事先在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)上培養(yǎng)好的GY20孢子，用無(wú)菌水洗下調(diào)節(jié)成孢子含量為IO5孢子/mL的接種液，按5% (V/V)接種量接種于裝有200ml馬鈴薯葡萄液體培養(yǎng)基(PD)的容積為750 ml的三角瓶中，于26 °C >150 rpm/min條件下振蕩培養(yǎng)48 h，將上步所得培養(yǎng)液200 ml等份接種于4個(gè)裝有500ml PD培養(yǎng)液的容積為2000 ml的三角瓶中，150 rpm、26°C條件下振蕩培養(yǎng)48 h ;把所得的2000ml培養(yǎng)液接種于裝有20L培養(yǎng)液的容積為30L的發(fā)酵罐(鎮(zhèn)江東方GUS-30)，20L發(fā)酵培養(yǎng)液含量為甜菜液400. 0g、七水硫酸鎂4. 0g、磷酸二氫鉀40. 0g，設(shè)置發(fā)酵條件為溶氧100%，攪拌速度為350rpm，發(fā)酵溫度26 °C，發(fā)酵時(shí)間48 h，pH 7· 0_7· 2。 (B)膏狀生防制劑加工工藝
將發(fā)酵好的發(fā)酵液按如下方法加工成膏狀生防制劑先將發(fā)酵液在8000rpm/min條件下離心lOmin，得菌絲及厚垣孢子混合體，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至3. O,并加入O. 001%的銅離子抑制劑，最后加入5%的可溶性淀粉，攪拌均勻即制成了膏狀生防制劑。實(shí)施例2-3
按照實(shí)施例1的方法制備實(shí)施例2-3，不同之處如表I所示。
表I實(shí)施例2-3制備方法
權(quán)利要求
1.一株基因工程菌菌株，其分類(lèi)命名為棘孢木霉aricAoiferffla asperellum) GY20, 其保藏編號(hào)為CGMCC NO :4899。
2.—種草莓黃萎病的膏狀生防制劑，其特征在于，所述制劑的活性成分為權(quán)利要求1 所述棘抱木霉(Trichoderma asperellum ) GY20的菌絲與厚垣抱子。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的膏狀生防制劑，其特征在于，所述菌絲與厚垣孢子的比例， 由以下培養(yǎng)方法決定將在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上長(zhǎng)好的棘孢木霉(斤icAoofe/ma asperellum) GY20孢子用無(wú)菌水洗下，調(diào)節(jié)成孢子含量為IO5孢子/mL的接種液，按V/V 5%接種量接種于馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)48小時(shí)；將上步所得培養(yǎng)液以V/V 10%的接種量再次接種于馬鈴薯葡萄液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)48小時(shí)進(jìn)一步擴(kuò)增后，再將所得培養(yǎng)液以V/V 10% 的接種量再次接種于含20L發(fā)酵培養(yǎng)液的發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)后離心得到。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的膏狀生防制劑，其特征在于，所述發(fā)酵罐中的發(fā)酵培養(yǎng)液各組分的重量份含量為甜菜液380-420、七水硫酸鎂3-5、磷酸二氫鉀38-42 ;所述發(fā)酵的條件為溶氧100%，攪拌速度為300-400轉(zhuǎn)/分，發(fā)酵溫度25-27攝氏度，發(fā)酵時(shí)間48小時(shí)， pH 7. 0-7. 2 ;所述振蕩培養(yǎng)的條件均為140-160轉(zhuǎn)/分、25-27攝氏度；所述發(fā)酵培養(yǎng)后離心的條件為7500-8500轉(zhuǎn)/分，離心10分鐘。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的膏狀生防制劑，其特征在于，所述發(fā)酵罐中的發(fā)酵培養(yǎng)液含量為甜菜液400. 0g、七水硫酸鎂4. 0g、磷酸二氫鉀40. Og ;所述發(fā)酵的條件為溶氧100%， 攪拌速度為350轉(zhuǎn)/分，發(fā)酵溫度26攝氏度，發(fā)酵時(shí)間48小時(shí)，pH 7. 0-7. 2 ;所述振蕩培養(yǎng)的條件均為150轉(zhuǎn)/分、26攝氏度；所述發(fā)酵培養(yǎng)后離心的條件為8000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘；所述膏狀生防制劑還包括重量百分比0. OOfO. 05%的銅離子抑制劑。
6.根據(jù)權(quán)利要求2或5所述的膏狀生防制劑，其特征在于，所述膏狀生防制劑還包括重量百分比5 10%的可溶性淀粉；所述的銅離子抑制劑為MDA-5。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的膏狀生防制劑，其特征在于，所述可溶性淀粉為土豆淀粉。
8.一種制備權(quán)利要求2 7所述的草莓黃萎病的膏狀生防制劑的方法，其特征在于，所述方法包括1)將在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上長(zhǎng)好的棘孢木霉(Trichodermaasperellum) GY20 孢子用無(wú)菌水洗下，調(diào)節(jié)成孢子含量為IO5孢子/mL的接種液，按V/V 5%接種量接種于馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)48小時(shí)；將上步所得培養(yǎng)液以V/V 10%的接種量再次接種于馬鈴薯葡萄液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)48小時(shí)進(jìn)一步擴(kuò)增后，再將所得培養(yǎng)液以V/V 10% 的接種量再次接種于含20L發(fā)酵培養(yǎng)液的發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)后離心得到；2)調(diào)節(jié)pH值將上述菌絲與厚垣孢子混合體的pH值調(diào)節(jié)為3.(Γ4. O ；3)制得膏狀生防制劑向所述步驟2)得到的混合體中加入0.00Γ0. 05%的銅離子抑制劑，最后加入5 10%的可溶性淀粉，攪拌均勻即可。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的膏狀生防制劑，其特征在于，所述振蕩培養(yǎng)的條件均為150 轉(zhuǎn)/分、26攝氏度；所述發(fā)酵罐中的發(fā)酵培養(yǎng)液含量為甜菜液400. 0g、七水硫酸鎂4. 0g、 磷酸二氫鉀40. Og;所述發(fā)酵的條件為溶氧100%，攪拌速度為350轉(zhuǎn)/分，發(fā)酵溫度26攝氏度，發(fā)酵時(shí)間48小時(shí)，pH 7. 0-7. 2 ;所述發(fā)酵培養(yǎng)后離心的條件為8000轉(zhuǎn)/分離心10 分鐘；所述可溶性淀粉為土豆淀粉。
10.權(quán)利要求1所述的基因工程菌菌株及權(quán)利要求2 7任一所述的膏狀生防制劑在防治草莓黃萎病中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種草莓黃萎病的膏狀生防制劑、制備方法、應(yīng)用及其專(zhuān)用菌株。所述專(zhuān)用菌株分類(lèi)命名為棘孢木霉(Trichodermaasperellum)GY20,其保藏編號(hào)為CGMCCNO4899。本發(fā)明膏狀生防制劑的所述制劑的活性成分為上述所述棘孢木霉(Trichodermaasperellum)GY20的菌絲與厚垣孢子。本發(fā)明的膏狀生防制劑最大的優(yōu)點(diǎn)是產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定，可室溫保存18個(gè)月，冷藏條件下保存3年，且對(duì)草莓黃萎病有良好防效，不產(chǎn)生任何廢水廢氣廢渣，利于環(huán)境保護(hù)。
文檔編號(hào)C12R1/885GK103013838SQ201210541989
公開(kāi)日2013年4月3日 申請(qǐng)日期2012年12月14日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月14日
發(fā)明者李楠, 張海軍, 羅志會(huì), 劉慕蘭, 李惠 申請(qǐng)人:江蘇耕耘化學(xué)有限公司