專利名稱：氨肽酶及其高產(chǎn)菌的高通量篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種氨肽酶及其高產(chǎn)微生物菌株的高通量篩選方法，屬于微生物育種、酶工程和發(fā)酵工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
氨肽酶(aminopeptidase)是蛋白水解酶中外肽酶的一類，它們能從蛋白質(zhì)和多肽鏈的N末端順序水解氨基酸，其催化機(jī)理可以用下式表示
權(quán)利要求
1.氨肽酶及其高產(chǎn)菌的高通量篩選方法，包括如下步驟 挑取氨肽酶產(chǎn)生菌的單菌落，接種于裝有液體種子培養(yǎng)基的深孔板I的孔中，蓋上深孔板的蓋子，于30 40°C、180 300rpm搖床培養(yǎng)4 IOh ;將深孔板I中的種子液對(duì)應(yīng)地接種到裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的深孔板II中，于30 40°C、180 300rpm搖床培養(yǎng)16 48h ;將深孔板II放置于孔板離心機(jī)，5000 IOOOOXg離心5 30min ;深孔板II的深孔中的上清液為粗酶液；以微量化梯度稀釋法將粗酶液適當(dāng)稀釋；用酶標(biāo)板法測(cè)定粗酶液的酶活，在酶標(biāo)板的微孔中加入緩沖液和顯色底物溶液或熒光底物溶液，加入稀釋的待測(cè)粗酶液，以蒸餾水作空白對(duì)照，于30 70°C水浴反應(yīng)10 30min，反應(yīng)結(jié)束立即加入30 50%乙酸溶液終止反應(yīng)；采用酶標(biāo)儀測(cè)定反應(yīng)液的吸光度或熒光強(qiáng)度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和粗酶液的稀釋倍數(shù)計(jì)算酶活；根據(jù)酶活測(cè)定結(jié)果，選擇對(duì)應(yīng)的菌株進(jìn)行搖瓶復(fù)篩，獲得氨肽酶高產(chǎn)菌株。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的氨肽酶高產(chǎn)菌的高通量篩選方法，其特征在于，所述氨肽酶產(chǎn)生菌的單菌落為自然界的含菌樣品或突變株。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的氨肽酶高產(chǎn)菌的高通量篩選方法，其特征在于，所述液體種子培養(yǎng)基為麥芽糊精8 15g/L、酵母粉2 10g/L、蛋白胨2 10g/L、磷酸二氫鉀0. 5 1. 5g/L、硫酸鎂 0.1 0. 5g/L、pH7. 0、0.1MPa 滅菌 30min。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的氨肽酶高產(chǎn)菌的高通量篩選方法，其特征在于，所述發(fā)酵培養(yǎng)基為麥芽糊精15 30g/L、酵母粉2 15g/L、蛋白胨2 10g/L、牛肉膏I 20g/L、磷酸二氫鉀 0. 5 3. Og/L、硫酸鎂 0. 05 0. 5g/L、氯化鈉 0. 5 1. 5g/L、pH6. 5 7. 5,0.1MPa滅菌30min。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的氨肽酶高產(chǎn)菌的高通量篩選方法，其特征在于，所述酶反應(yīng)所用的緩沖液為Tris-HCl緩沖液、磷酸二氫鉀緩沖液、磷酸鈉緩沖液、HEPES緩沖液和氨-氯化銨緩沖液之中的一種。所述緩沖液的pH為6. 5 8. 5 ;緩沖液濃度為0. 02 0.2mol/L。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的氨肽酶高產(chǎn)菌的高通量篩選方法，其特征在于，所述顯色底物是氨基酸對(duì)硝基苯胺。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的氨肽酶高產(chǎn)菌的高通量篩選方法，其特征在于，所述氨基酸對(duì)硝基苯胺為丙氨酸對(duì)硝基苯胺、精氨酸對(duì)硝基苯胺、天冬酰胺對(duì)硝基苯胺、天冬氨酸對(duì)硝基苯胺、半胱氨酸對(duì)硝基苯胺、谷氨酰胺對(duì)硝基苯胺、谷氨酸對(duì)硝基苯胺、組氨酸對(duì)硝基苯胺、異亮氨酸對(duì)硝基苯胺、甘氨酸對(duì)硝基苯胺、亮氨酸對(duì)硝基苯胺、賴氨酸對(duì)硝基苯胺、甲硫氨酸對(duì)硝基苯胺、苯丙氨酸對(duì)硝基苯胺、脯氨酸對(duì)硝基苯胺、絲氨酸對(duì)硝基苯胺、蘇氨酸對(duì)硝基苯胺、色氨酸對(duì)硝基苯胺、酪氨酸對(duì)硝基苯胺或纈氨酸對(duì)硝基苯胺。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的氨肽酶高產(chǎn)菌的高通量篩選方法，其特征在于，所述熒光底物是氨基酸-7-氨基-4-甲基香豆素；所述氨基酸-7-氨基-4-甲基香豆素為下列化合物之一丙氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素、精氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素、天冬酰胺-7-氨基-4-甲基香豆素、天冬氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素、半胱氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素、谷氨酰胺-7-氨基-4-甲基香豆素、谷氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素、組氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素、異亮氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素、甘氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素、亮氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素、賴氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素、甲硫氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素、苯丙氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素、脯氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素、絲氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素、蘇氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素、色氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素、酪氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素、纈氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的氨肽酶高產(chǎn)菌的高通量篩選方法，其特征在于，所述顯色底物溶液濃度為2 20 ii mol/L,熒光底物溶液濃度2 20nmol/L ;顯色底物用于酶活測(cè)定比色的波長(zhǎng)為360 450nm ;熒光底物用于酶活測(cè)定的激發(fā)光波長(zhǎng)為340 400nm，發(fā)射光波長(zhǎng)為420 480nm。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的氨肽酶高產(chǎn)菌的高通量篩選方法，其特征在于，所述氨肽酶種類的判斷方法如下若底物為亮氨酸對(duì)硝基苯胺或亮氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素時(shí)有較高的酶活，而添加其它氨基酸對(duì)硝基苯胺或氨基酸-7-氨基-4-甲基香豆素底物時(shí)無酶活或者酶活較低，則表明所測(cè)樣品含有亮氨酸氨肽酶；若添加底物為甲硫氨酸對(duì)硝基苯胺或甲硫氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素時(shí)有較高的酶活，而添加其它氨基酸對(duì)硝基苯胺或氨基酸-7-氨基-4-甲基香豆素底物時(shí)無酶活或者酶活較低，則表明所測(cè)樣品含有甲硫氨酸氨肽酶，其它的氨肽酶如此類推。
全文摘要
本發(fā)明公開了氨肽酶及其高產(chǎn)菌的高通量篩選方法，涉及一種氨肽酶及其高產(chǎn)微生物菌株的高通量篩選方法。將單菌落接種于裝有液體種子培養(yǎng)基的深孔板I的孔中，搖床培養(yǎng)，將深孔板I深孔中的種子液對(duì)應(yīng)地接種到裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的深孔板II對(duì)應(yīng)的深孔中，搖床培養(yǎng)，將深孔板II離心，上清液為粗酶液。在酶標(biāo)板的微孔中加入緩沖液和顯色底物溶液或熒光底物溶液，再加入稀釋的待測(cè)粗酶液，于30～70℃水浴反應(yīng)10～30min，反應(yīng)結(jié)束時(shí)立即加入30～50％乙酸溶液并終止反應(yīng)。采用酶標(biāo)儀測(cè)定反應(yīng)液的吸光度或熒光強(qiáng)度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和粗酶液的稀釋倍數(shù)計(jì)算酶活。本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了高通量培養(yǎng)、粗酶液的高通量制備及酶活的高通量測(cè)定的目標(biāo)。
文檔編號(hào)C12N1/02GK102994387SQ20121054322
公開日2013年3月27日 申請(qǐng)日期2012年12月14日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月17日
發(fā)明者姜文俠, 楊玉蘭, 劉琦, 楊萍, 陳寧 申請(qǐng)人:天津工業(yè)生物技術(shù)研究所