專利名稱：一種扁座殼孢發(fā)酵生產(chǎn)漆酶的培養(yǎng)基及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及真菌的發(fā)酵培養(yǎng)基及工藝。更具體地，本發(fā)明涉及一種扁座殼孢發(fā)酵生產(chǎn)漆酶的培養(yǎng)基及方法。
背景技術(shù)：
漆酶(Laccase)是一種含銅多酚氧化酶，它能催化一系列有機(jī)和無機(jī)化合物發(fā)生一個(gè)電子氧化，同時(shí)伴隨有氧還原成水。目前已發(fā)現(xiàn)多種生物能產(chǎn)生漆酶，包括植物、真菌、 昆蟲、細(xì)菌等。其中，以真菌中的白腐菌分布最多(鈔亞鵬等，2001)。
漆酶具有廣泛的底物作用范圍，可催化多種酚類和芳香胺類化合物的氧化，降解多環(huán)芳烴。因此,在生物降解、制漿造紙中、廢水處理、生物漂白、污染物脫毒、土壤修復(fù)等方面，漆酶具有重要的應(yīng)用價(jià)值。目前，漆酶的研究己在多領(lǐng)域、多水平上展開。許多由真菌引起的植物病害中，漆酶被顯示是一個(gè)重要的毒力因子[8]。揭示蟲生真菌是否能產(chǎn)漆酶，可為蟲生真菌生防作用的深入研究提供依據(jù)。對蟲生真菌漆酶的研究結(jié)果若能應(yīng)用在對害蟲的生物防治，無疑能更大限度地開發(fā)利用生物資源。
扁座殼孢是一種重要的昆蟲病原真菌,在農(nóng)林害蟲生物防治中具有廣泛的應(yīng)用前景。該菌屬子囊菌門(Ascomycota)糞菌綱i^orchriomycetes) 肉座菌目(Hypocreales)麥角菌科ijOlsvicipitsceeie)座殼孢屬(Aschersonia),而對扁座殼孢發(fā)酵生產(chǎn)漆酶國內(nèi)鮮有報(bào)道，具有較大的發(fā)展前景。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種扁座殼孢發(fā)酵生產(chǎn)漆酶的培養(yǎng)基及方法。
本發(fā)明首先提供了一種扁座殼孢發(fā)酵生產(chǎn)漆酶的培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基的原料含有葡萄糖 O. 5-2wt%, (NH4)2SO4 l-4wt%, Zn2+O. 5X 1(T4_4X l(T4mol/L，VB4 I X 10義1 X l(T3wt%， 培養(yǎng)基初始pH=3. 8-4. 4。
更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基的原料按重量分?jǐn)?shù)計(jì)，含有葡萄糖O. 5wt%, (NH4) 2S044wt%, Zn2+O. 5X 1(T4 mol/L, VB4 5Χ 1(Γ4 wt%,培養(yǎng)基初始 pH=4. 4。
其次，本發(fā)明還提供了一種扁座殼孢發(fā)酵生產(chǎn)漆酶的方法，所述方法包含以下步驟(a)將扁座殼孢接種種子培養(yǎng)基，制得發(fā)酵種子液；(b)將步驟(a)中制得的發(fā)酵種子液按接種于所述的培養(yǎng)基，250mL的三角瓶裝液量為 50mL，接種量lmL，于25°C，轉(zhuǎn)速160 r/min下培養(yǎng)。
所述種子培養(yǎng)基的原料含有按培養(yǎng)基重量計(jì)，20% 土豆汁1L、葡萄糖2%、酵母膏 1%，自然pH。
本發(fā)明采用的座殼孢為扁座殼孢(何學(xué)友等，油茶黑膠粉虱及扁座殼孢對其自然控制作用，中國森林病蟲，2011年7月)。
采用本發(fā)明優(yōu)化后的培養(yǎng)基，菌齡4d，發(fā)酵周期3d，玻璃珠O個(gè)，發(fā)酵產(chǎn)生結(jié)果扁座殼孢產(chǎn)漆酶為45U/mL以上。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明的發(fā)酵方法有發(fā)酵周期短；條件溫和，易于控制；提供的用于扁座殼孢發(fā)酵生產(chǎn)漆酶的培養(yǎng)基，具有漆酶產(chǎn)率高，漆酶活力高等優(yōu)點(diǎn)。


圖1不同碳源對產(chǎn)酶活性的影響。注圖中Dex、D-Sor、Ma1、Fru、Sue、Myc、SS、Car、L-Ara, CK分別表示葡萄糖、D-山梨醇、麥芽糖、果糖、蔗糖、海藻糖、可溶性淀粉、羧甲基纖維素鈉、L-阿拉伯糖和對照組。圖2不同氮源對產(chǎn)酶活性的影響。注圖中YE、YEP、Try、PN、Cas, AS、SN、P印、Ure, CK分別表示酵母膏、酵母粉、胰蛋白胨、KNO3、干酪素、(NH4) 2S04、NaNO3、蛋白胨、尿素和 對照組。圖3不同維生素對產(chǎn)酶活性的影響。圖4不同無機(jī)鹽離子對產(chǎn)酶活性的影響。圖5不同初始pH對產(chǎn)酶活性的影響。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明用下列實(shí)施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不限于下列實(shí)施例。實(shí)施例1
單因素實(shí)驗(yàn)確定培養(yǎng)基最優(yōu)成分
(I)種子培養(yǎng)基和基礎(chǔ)培養(yǎng)基配制
(a)種子培養(yǎng)基20%土豆汁1L、葡萄糖2%、酵母膏1%，自然pH。1. OlMPa，滅菌20min。(b)基礎(chǔ)培養(yǎng)基20% 土豆汁1L、葡萄糖2%、酵母膏1%，自然pH。l.OlMPa，滅菌20mino(2)發(fā)酵種子的制作將扁座殼孢接種于馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基上，于25°C下培養(yǎng)5d，待其產(chǎn)孢子，即活化；將活化后的菌株用接種針將孢子粉接種至種子培養(yǎng)基，25°C，轉(zhuǎn)速160r/min下培養(yǎng)24h，即為發(fā)酵液。(3)酶液的制備取步驟(2)下的發(fā)酵液在4°C下，5000 r/min離心，15min，得上清液即為粗酶液待用。按酶活性測定在在波長465nm處測定吸光值。換算成酶活單位U/
mLo(4)漆酶酶活測定取O. 2mL發(fā)酵上清液加入3. 3mL醋酸緩沖液(pH4. 4)和O. 5mL4. OmmoI/L愈創(chuàng)木酚中(以熱滅活上清液作為對照)，25°C水浴5min，冰浴加入2mL 16. 5%三氯乙酸試劑終止反應(yīng)，離心后取上清液在波長465nm下測吸光度。
IO6、V總....ΔΑ
酶活力(U/g或UML)= -
F 酶ε-- Δ
式中，X為樣品的吸光度分別代表反應(yīng)體系總體積及反應(yīng)酶液的體積；ε為吸光系數(shù)(ε 465 =1. 21 X 10_4mol/L · cm)；以每分鐘氧化底物1. O μ mo I來定義酶活。
(5)不同碳源、氮源、維生素、無機(jī)鹽離子、初始pH對產(chǎn)漆酶的影響。
(a)碳源對酶產(chǎn)量的影響，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別添加2%葡萄糖、D-山梨醇、麥芽糖、果糖、蔗糖、海藻糖、可溶性淀粉、羧甲基纖維素鈉和L-阿拉伯糖，接入相同的扁座殼孢菌液，在25°C、160r/min的搖床中培養(yǎng)，設(shè)置對照組，每天檢測發(fā)酵液中漆酶活性。
(b)氮源對產(chǎn)酶的影響，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別添加1%的酵母膏、酵母粉、胰蛋白胨、KNO3、干酪素、(NH4) 2S04、NaNO3、蛋白胨和尿素，接入相同的扁座殼孢菌液，在25°C、160r/ min的搖床中培養(yǎng)，設(shè)置對照組，每天檢測發(fā)酵液中漆酶活性。
(c)維生素對酶產(chǎn)量的影響，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別添加O. 01% VB1, VB2、Vb4、Vb6, Vc, VE、，接入等量的扁座殼孢菌液，在25°C、160r/min的搖床中培養(yǎng)，設(shè)置對照組，每天檢測發(fā)酵液中漆酶活性。
(d)無機(jī)鹽離子對酶產(chǎn)量的影響，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別添加相同摩爾數(shù)的無機(jī)鹽離子(O. 4mmol NaH2PO4 · 2H20、KH2PO4、CuSO4 · 5H20、ZnSO4 · 7H20、FeCl3 · 6H20、MgSO4 · 7H20、 FeSO4 WH2CKCoCI2 ·6Η20、Μη504)，接入相同的扁座殼孢菌液，在25°C、160r/min的搖床中培養(yǎng)，設(shè)置對照組，每天檢測發(fā)酵液中漆酶活性。
(e)初始pH對酶產(chǎn)量的影響，用基礎(chǔ)培養(yǎng)基分別提供不同酸堿度的培養(yǎng)環(huán)境(pH 值 3. 5,4. 0,4. 5,5. 0,5. 5,6. 0,6. 5,7. 0,7. 5)，接入等量的扁座殼孢菌液，在 25°C、160r/ min的搖床中培養(yǎng)，設(shè)置對照組，每天檢測發(fā)酵液中漆酶活性。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果碳源對酶產(chǎn)量的影響如圖1所示，添加葡萄糖大幅提高了漆酶活性。在接種后第3d 就出現(xiàn)漆酶活性高峰，酶活性達(dá)到43. 27U/mL。添加D-山梨醇、果糖、可溶性淀粉的處理，在接種后第3d酶活分別達(dá)到14. 40U/mL、14. 43U/mL、16. 60U/mL,與對照組酶活15. 43U/mL相近；添加海藻糖、麥芽糖、羧甲基纖維素鈉、蔗糖和L-阿拉伯糖的處理都對供試菌產(chǎn)酶有不同程度的抑制作用。添加蔗糖和L-阿拉伯糖的處理檢測不到酶活。
氮源對產(chǎn)酶的影響如圖2所示，在所添加的不同氮源中，添加酵母膏、酵母浸粉和硫酸銨的處理有助于提高產(chǎn)酶水平，酶活性分別達(dá)到40. 55U/mL、39. 19U/mL、41. 62U/mL, 而添加干酪素、蛋白胨的處理較對照處理的酶活低，二者對供試菌產(chǎn)酶具有抑制作用。此夕卜，胰蛋白胨、硝酸鉀、硝酸鈉和尿素的處理對其有強(qiáng)烈的抑制作用。據(jù)此，硫酸銨是扁座殼孢菌產(chǎn)漆酶的最佳氮源。
維生素對酶產(chǎn)量的影響如圖3所示，在所添加的不同維生素里，與CK相比，維生素B4最有助于扁座殼孢菌提高產(chǎn)酶水平(圖5)，維生素C次之，然后是復(fù)合維生素，所測得酶活力分別為45. 22U/mL、37. 58U/mL、29. 06U/mL。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明添加維生素B1、維生素 B6均 能增加扁座殼孢菌產(chǎn)漆酶。而維生素B2與維生素E對產(chǎn)酶則有顯著的抑制作用，測得酶活僅為6. 54U/mL、6. 06U/mL。
初始pH對酶產(chǎn)量的影響如圖4所示，在所添加的相同摩爾數(shù)不同種無機(jī)鹽離子中，添加Na+、Zn2+、Fe2+、C02+的處理均有助于提高該菌產(chǎn)漆酶能力，酶活性分別達(dá)到19. 87U/ mL、36. 18U/mL、35. 23U/mL、23. 66U/mL，而添加 K+、Fe3+、Mg2+、Mn2+ 的處理較對照處理的酶活低，對供試菌產(chǎn)酶具有抑制作用。此外，Cu2+對扁座殼孢菌產(chǎn)漆酶無明顯的促進(jìn)作用。據(jù)此，Zn2+最能提高扁座殼孢菌產(chǎn)漆酶。無機(jī)鹽離子對酶產(chǎn)量的影響如圖5所示，在不同初始pH的培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，pH=4. O的處理有助于提高產(chǎn)漆酶能力，酶活性達(dá)到30. 93U/mL,初始pH=4. 5的處理，其酶活值也達(dá)23. 80 U/mL。據(jù)此，初始pH=4. 0-4. 5最能提高扁座殼孢菌產(chǎn)漆酶。實(shí)施例2
正交實(shí)驗(yàn)確定最優(yōu)發(fā)酵條件 (O正交實(shí)驗(yàn)確定最佳培養(yǎng)基
從單因素實(shí)驗(yàn)確定的培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，改變各成分的溶度，和PH值，配置不同的培養(yǎng)基，方法同實(shí)施例1中步驟(I)、(2)。見表1，將相同量的接種量(10%)菌種接種于250mL， 裝有50mL培養(yǎng)液，在25°C，轉(zhuǎn)速160 r/min下培養(yǎng)培養(yǎng)3d。然后按實(shí)施例1步驟(3)、(4)測定酶活。選取正交實(shí)驗(yàn)最優(yōu)結(jié)果和其產(chǎn)酶量最高的實(shí)驗(yàn)組號，進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。為了避免累贅實(shí)施例中的培養(yǎng)基配法、粗酶液的制作、酶活測定方法均與實(shí)施例1的方法相同。表I扁座殼孢漆酶五因子四水平(45)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
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表2扁座殼孢漆酶五因子四水平(45)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種扁座殼孢發(fā)酵生產(chǎn)漆酶的培養(yǎng)基，其特征在于，所述培養(yǎng)基的原料中含有葡萄糖 O. 5-2wt%, (NH4)2SO4 l-4wt%, Zn2+O. 5X 1(T4_4X l(T4mol/L，VB4 I X 10義1 X l(T3wt%，培養(yǎng)基初始 pH=3. 8-4. 4。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的扁座殼孢發(fā)酵生產(chǎn)漆酶的培養(yǎng)基，其特征在于，所述培養(yǎng)基的原料按重量分?jǐn)?shù)計(jì)，含有葡萄糖 O. 5%，(NH4) 2S04 4%，Zn2+O. 5 X 10_4 mol/L, VB4 5 X 10_4%，培養(yǎng)基初始pH=4. 4。
3.一種扁座殼孢發(fā)酵生產(chǎn)漆酶的方法，其特征在于，所述方法包含以下步驟Ca)將扁座殼孢接種種子培養(yǎng)基，制得發(fā)酵種子液；(b)將步驟(a)中制得的發(fā)酵種子液按接種于權(quán)利要求1或2所述的培養(yǎng)基，250mL的三角瓶裝液量為50mL，接種量lmL，玻璃珠O個(gè)，于25°C，轉(zhuǎn)速160 r/min下培養(yǎng)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的扁座殼孢發(fā)酵生產(chǎn)漆酶的方法，其特征在于，所述種子培養(yǎng)基的原料含有按培養(yǎng)基的重量計(jì)算，含有20% 土豆汁1L、葡萄糖2%、酵母膏1%，自然pH。
全文摘要
本發(fā)明涉及真菌的發(fā)酵培養(yǎng)基及工藝。更具體地，本發(fā)明涉及一種扁座殼孢發(fā)酵生產(chǎn)漆酶的培養(yǎng)基及方法。所述培養(yǎng)基的原料含有葡萄糖1-4wt%，(NH4)2SO41-4wt%，Zn2+0.5×10-4-4×10-4mol/L，VB41×10-4-1×10-3wt%，培養(yǎng)基初始pH=3.8-4.4。該方法通過將發(fā)酵種子液按接種于培養(yǎng)基，250mL的三角瓶裝液量為50mL，接種量1mL，玻璃珠0個(gè)，于25℃，轉(zhuǎn)速160r/min下培養(yǎng)。本發(fā)明的發(fā)酵方法有發(fā)酵周期短；條件溫和，易于控制；提供的用于扁座殼孢發(fā)酵生產(chǎn)漆酶的培養(yǎng)基，具有漆酶產(chǎn)率高，漆酶活力高等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號C12N9/02GK102994464SQ20121054368
公開日2013年3月27日 申請日期2012年12月17日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月17日
發(fā)明者邱君志, 蘇禮超, 吳寶杰, 李小霞, 涂潔, 宋飛飛, 邱云鋒, 郭慶豐, 何肖云, 毛麗慧 申請人:福建農(nóng)林大學(xué)