專利名稱：一種用枯草芽孢桿菌生產(chǎn)靛藍(lán)色素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
:本發(fā)明涉及一種本發(fā)明涉及一種產(chǎn)生天然靛藍(lán)色素的方法。
背景技術(shù)：
:靛藍(lán)(indigo)是一種顏色鮮艷而又穩(wěn)定的藍(lán)色色素。在結(jié)構(gòu)上，靛藍(lán)是一種芳香族化合物，主要用于布料的染色，如牛仔褲是通過靛藍(lán)將紡織物染色處理后得到的。除了作為染料，靛藍(lán)和靛玉紅(一種靛藍(lán)類的色素)在醫(yī)藥行業(yè)也有重要應(yīng)用，能夠?qū)σ恍┘膊“ò┌Y相關(guān)疾病、老年癡呆癥、遲發(fā)過敏癥等，有重要的治療效果。在食品工業(yè)中，親監(jiān)可以作為食品著色的一類添加劑添加到食品中。傳統(tǒng)的靛藍(lán)生產(chǎn)主要從植物中提取，一些植物如菘藍(lán)、寥藍(lán)、馬藍(lán)、野青樹等葉片中含有豐富的靛藍(lán)色素。通過植物提取的靛藍(lán)安全性高，污染少，但其產(chǎn)量和純度較低，限制了靛藍(lán)的生產(chǎn)。化學(xué)合成法產(chǎn)量高，純度高，生產(chǎn)工藝相對簡單。目前，靛藍(lán)主要通過化學(xué)合成法生產(chǎn)。然而，化學(xué)合成靛藍(lán)，由于合成中合成原料、催化劑、中間產(chǎn)物等均具有一定的毒性，不但對人體健康有嚴(yán)重影響，而且產(chǎn)生了大量的副產(chǎn)物，如苯胺、硝基苯和金屬鹽等。這類物質(zhì)的排放，導(dǎo)致嚴(yán)重的環(huán)境污染。微生物催化合成天然靛藍(lán)主要是應(yīng)用微生物細(xì)胞內(nèi)的酶，在體內(nèi)或體外催化特定反應(yīng)，實現(xiàn)生物轉(zhuǎn)化。因其催化反應(yīng)條件溫和、對作用底物有高選擇性、降低生產(chǎn)成本、減少能耗、對環(huán)境無污染以及綠色安全等特點(diǎn)引起了科學(xué)工作者的關(guān)注。目前，所報道的微生物催化在靛藍(lán)色素的生產(chǎn)應(yīng)用中也存在諸多問題:如菌株的培養(yǎng)周期較長，色素分泌能力低，酶在反應(yīng)介質(zhì)中不穩(wěn)定等，故進(jìn)一步開發(fā)微生物資源，篩選親監(jiān)聞廣菌株具有重要意義
發(fā)明內(nèi)容
:本發(fā)明的目的在于提供一種生產(chǎn)靛藍(lán)色素的枯草芽孢桿菌菌株。本發(fā)明所述的一種產(chǎn)靛藍(lán)的菌株JWDL，其特征在于所述的菌株為BacillusSubtilis，為枯草芽孢桿菌，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，保藏日期:2012年I月9日，保藏號為=CGMCC 5698。本發(fā)明所述菌株在LB固體培養(yǎng)基上37°C培養(yǎng)24h，菌落呈藍(lán)黑色，圓形，不透明，表面褶皺不光滑，邊緣不規(guī)則擴(kuò)展。利用透射電鏡觀察，周生鞭毛，無莢膜，有芽孢，菌體大小為(0.7 0.9) ii mX (3 3) ii m。生理生化特征見表I。表I菌株JWDL的 生理生化特征
權(quán)利要求
1.一種生產(chǎn)靛藍(lán)色素的方法，其特征在于，包括如下步驟: (1)菌株發(fā)酵培養(yǎng):將枯草芽孢桿菌(BacillusSubtilis)CGMCC5698的種子液接入已滅菌的液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，于26-34°C恒溫培養(yǎng)46-60h，搖床轉(zhuǎn)速200r/min ； (2)提取枯草芽孢桿菌靛藍(lán)色素。
2.如權(quán)利要求1所述的一種生產(chǎn)靛藍(lán)色素的方法，其特征在于，所述菌株發(fā)酵培養(yǎng)18h后加入吲哚乙醇溶液，使發(fā)酵液中噴哚濃度達(dá)到180mg/L。
3.如權(quán)利要求1所述的一種生產(chǎn)靛藍(lán)色素的方法，其特征在于，所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成，以重量體積百分比計，單位g/100ml，其中蛋白胨0.5，葡萄糖0.5，酵母粉0.5，(NH4)2SO40.25，MgSO4.7Η200.01，F(xiàn)eSO4.7Η200.04，NH4NO30.1，pH 為 7.0-9.0。
4.如權(quán)利要求1所述的一種生產(chǎn)靛藍(lán)色素的方法，其特征在于，所述的枯草芽孢桿菌CGMCC5698的種子液的制備方法如下:將平板培養(yǎng)所得的單菌落接入種子液培養(yǎng)基于30-34°C下恒溫培養(yǎng)18小時，搖床轉(zhuǎn)速為180r/min ;所述種子液培養(yǎng)基的組成，以重量體積百分比計，單位g/100ml，其中蛋白胨1，葡萄糖0.5，酵母粉0.5，NaCl0.2，(NH4)2SO40.2，NH4NO30.1，K2HPO40.01，MgSO4.7Η200.01，ρΗ7.5。
5.如權(quán)利要求1或2或3或4所述的一種生產(chǎn)靛藍(lán)色素的方法，其特征在于，所述的枯草芽孢桿菌CGMCC5698在接種前還經(jīng)過平板培養(yǎng)，在LB固體培養(yǎng)基上于30_37°C恒溫培養(yǎng)，所述LB固體培養(yǎng)基組成，以重量體積百分比計，單位是g/100ml，其中蛋白胨1、酵母粉0.5, NaCll, pH 值為 7.2。
6.如權(quán)利要求1所述的一種生產(chǎn)靛藍(lán)色素的方法，其特征在于，所述發(fā)酵培養(yǎng)溫度為32℃。
7.如權(quán)利要求1所述的一種生產(chǎn)靛藍(lán)色素的方法，其特征在于，所述步驟(2)中提取枯草芽孢桿菌靛藍(lán)色素的過程是:發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵液于室溫下12000r/min，離心15min，收集深藍(lán)色的菌體沉淀物；上清液加入等體積的丙酮，反復(fù)震蕩萃取后，12000r/min離心lOmin，收集含有靛藍(lán)色素的丙酮層；收集的菌體沉淀物用60ml20mmol/L pH7.5的磷酸緩沖溶液震蕩吹打懸浮，再12000r/min，離心IOmin ;如上反復(fù)洗滌3次，將非菌體雜質(zhì)洗掉，離心后的菌體用40ml的丙酮充分懸浮菌體，再在冰浴狀態(tài)下采用超聲法破碎菌體細(xì)胞；超聲功率600-800W，工作時間18s，間歇20s，工作次數(shù)25-35次；第一次超聲破碎后的懸浮液10000r/min離心lOmin，得到藍(lán)色的上清液和深色細(xì)胞碎片沉淀；再次向細(xì)胞碎片沉淀中加入丙酮10ml，重復(fù)以上超聲破碎細(xì)胞步驟1-2次；最后將每次超聲破碎后獲得的藍(lán)色上清液以及丙酮萃取的發(fā)酵上清液合并；采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，然后真空冷凍干燥除掉殘余丙酮，得到靛藍(lán)色素。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用枯草芽孢桿菌生產(chǎn)靛藍(lán)色素的方法，本發(fā)明涉及一種產(chǎn)生天然靛藍(lán)色素的方法。包括如下步驟(1)菌株發(fā)酵培養(yǎng)將產(chǎn)靛藍(lán)色素的枯草芽孢桿菌(Bacillus Subtilis)CGMCC5698的種子液接入已滅菌的液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，于26-34℃恒溫培養(yǎng)46-60h，搖床轉(zhuǎn)速200r/min；(2)提取枯草芽孢桿菌靛藍(lán)色素。優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明使用的枯草芽孢桿菌菌株，可在液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中高效合成靛藍(lán)，生產(chǎn)效率較高。菌株對碳源和氮源要求較低，遺傳穩(wěn)定性好，操作簡單。
文檔編號C12P17/16GK103146776SQ20121054464
公開日2013年6月12日 申請日期2012年12月14日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月14日
發(fā)明者高兆建, 劉全德, 紀(jì)偉, 陳尚龍, 巫永華, 吳如波 申請人:徐州工程學(xué)院