促進雜交瘤生長的培養(yǎng)基及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種促進雜交瘤生長的培養(yǎng)基及其制備方法。該促進雜交瘤生長的培養(yǎng)基，包括1640完全培養(yǎng)基和添加在所述1640完全培養(yǎng)基中的TLR3激動劑Poly(I:C)，且所述TLR3激動劑Poly(I:C)在所述促進雜交瘤生長的培養(yǎng)基中的濃度為25μg/ml。上述培養(yǎng)基在配制的RPMI?1640完全培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，添加了TLR3激動劑Poly(I:C)，并使其在培養(yǎng)基中的最終濃度控制在每毫升25微克，不僅能通過促進B細胞增殖來促進雜交瘤細胞的生長，同時也可以通過促進B細胞分泌特異性抗體這一特性來促進雜交瘤細胞分泌所需單克隆抗體。
【專利說明】促進雜交瘤生長的培養(yǎng)基及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]細胞培養(yǎng)基及其制備方法，更具體地說涉及的是一種能夠為雜交瘤細胞提供更好的生長條件的培養(yǎng)基及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]單克隆抗體以其高度的特異性和靈敏度，在免疫學(xué)檢測、目的蛋白的親和純化和腫瘤治療領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。淋巴細胞雜交瘤技術(shù)是生產(chǎn)單克隆抗體過程中極為重要的一個環(huán)節(jié)，但是，用該技術(shù)制備單克隆抗體，其實驗環(huán)節(jié)多，周期長，影響因素復(fù)雜，容易遭受挫折。尤其是在雜交瘤產(chǎn)生早期，由于新出現(xiàn)的雜交瘤生活力差，其生長情況容易因環(huán)境的變化而變化，不能很好地適應(yīng)體外組織培養(yǎng)條件，很容易夭折。即便獲得了生長良好的雜交瘤細胞，也可能會因為雜交瘤細胞不能分泌特異性抗體而導(dǎo)致實驗失敗。因此，在現(xiàn)有條件下增強新生成的雜交瘤細胞生長能力，提高雜交瘤細胞的克隆化效率及抗體產(chǎn)量就顯得十分必要了。
[0003]現(xiàn)有的培養(yǎng)基只注重了對雜交瘤細胞生長的促進作用，并沒有做到同時加強雜交瘤細胞分泌特異性抗體的能力，且配制方法較為復(fù)雜，操作不夠簡便。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]基于此，有必要提供一種既促進雜交瘤細胞生長，又促進雜交瘤細胞分泌所需單克隆抗體的培養(yǎng)基及其制備方法。
[0005]—種促進雜交瘤生長的培養(yǎng)基，包括1640完全培養(yǎng)基和添加在所述1640完全培養(yǎng)基中的TLR3激動劑Poly (1:C)，且所述TLR3激動劑Poly (1: C)在所述促進雜交瘤生長的培養(yǎng)基中的濃度為25 μ g/ml。
[0006]一種促進雜交瘤生長的培養(yǎng)基的制備方法，包括如下步驟:
[0007]制備1640完全培養(yǎng)基；及
[0008]往所述1640完全培養(yǎng)基中加入TLR3激動劑Poly(I = C)，并使所述TLR3激動劑Poly (1: C)的終濃度為 25 μ g/ml。
[0009]在其中一個實施例中，所述制備1640完全培養(yǎng)基的方法包括:
[0010]將10.4克RPMI 1640干粉，3.574克4-羥乙基哌嗪乙磺酸，2克碳酸氫鈉粉末用900毫升去離子水溶解，將pH值調(diào)至7.0后定容到1000毫升，在生物安全柜中用0.22微米濾膜過濾除菌后分裝待用，即為1640無血清培養(yǎng)基；
[0011]取79毫升1640無血清培養(yǎng)基，加入20毫升胎牛血清，再加入I毫升雙抗溶液，即為1640完全培養(yǎng)基。
[0012]上述培養(yǎng)基在配制的RPMI 1640完全培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，添加了 TLR3激動劑Poly (1:C),并使其在培養(yǎng)基中的最終濃度控制在每毫升25微克，不僅能通過促進B細胞增殖來促進雜交瘤細胞的生長，同時也可以通過促進B細胞分泌特異性抗體這一特性來促進雜交瘤細胞分泌所需單克隆抗體。【具體實施方式】
[0013]雜交瘤細胞是B細胞與骨髓瘤細胞融合產(chǎn)生的，同時擁有B細胞和骨髓瘤細胞的特性。淋巴細胞雜交瘤技術(shù)是生產(chǎn)單克隆抗體過程中的一個重要技術(shù)，但是，用該技術(shù)制備單克隆抗體，其實驗環(huán)節(jié)多，周期長，影響因素復(fù)雜，容易遭受挫折。尤其是在雜交瘤產(chǎn)生早期，由于新出現(xiàn)的雜交瘤尚未適應(yīng)體外組織培養(yǎng)條件，很容易夭折或不能很好地分泌特異性抗體。
[0014]針對上述問題，本實施例在配制的RPMI 1640完全培養(yǎng)基基礎(chǔ)上，添加終濃度為每毫升25微克的TLR3激動劑Poly (1:C)，不僅能通過促進B細胞增殖來促進雜交瘤細胞的生長，同時也可以通過促進B細胞分泌特異性抗體這一特性來促進雜交瘤細胞分泌所需單克隆抗體。
[0015]本實施例的促進雜交瘤生長的培養(yǎng)基，包括1640完全培養(yǎng)基和添加在所述1640完全培養(yǎng)基中的TLR3激動劑Poly (1:C)，且所述TLR3激動劑Poly (1: C)在所述促進雜交瘤生長的培養(yǎng)基中的濃度為25 μ g/ml。
[0016]TLR3(Toll樣受體3)是To ll樣受體家族成員之一，它能夠特異性識別病毒的雙鏈RNA及其類似物Poly (1: C)。已有研究表明，體內(nèi)多種免疫細胞均可表達TLR3，而Poly (1: C)作為TLR3的激動劑，能夠促進B細胞的生長增殖及抗原呈遞功能。并且，在無特異性抗原刺激的情況下，TLR3激動劑Poly (1:C)能夠直接誘導(dǎo)B細胞產(chǎn)生IgGl κ抗體。雜交瘤細胞是B細胞與骨髓瘤細胞融合產(chǎn)生的，同時擁有B細胞和骨髓瘤細胞的特性，促進B細胞增殖分化以及特異性抗體的產(chǎn)生，對促進雜交瘤細胞的生長以及抗體產(chǎn)生有著很有益的作用。
[0017]上述促進雜交瘤生長的培養(yǎng)基的制備方法，包括如下步驟:
[0018]步驟S100、制備1640完全培養(yǎng)基。
[0019]其中，制備1640完全培養(yǎng)基的方法包括:
[0020]步驟S110、將10.4克RPMI 1640干粉(購自Gibco公司)，3.574克分析純4_羥乙基哌嗪乙磺酸(購自Sigma公司)，2克分析純碳酸氫鈉粉末(購自上海生工)用900毫升去離子水溶解，將PH值調(diào)至7.0后定容到1000毫升，在生物安全柜中用0.22微米濾膜過濾除菌后分裝待用，即為1640無血清培養(yǎng)基。
[0021]步驟S120、取79毫升1640無血清培養(yǎng)基，加入20毫升胎牛血清(購自Gibco公司)，再加入I毫升雙抗溶液(青霉素及鏈霉素溶液)(100X )(購自Hyclone公司)，即為1640
完全培養(yǎng)基。
[0022]步驟S200、往所述1640完全培養(yǎng)基中加入TLR3激動劑Poly (1:C)，并使所述TLR3激動劑Poly (1: C)的終濃度為25 μ g/ml。
[0023]向上述配制好的每100毫升1640完全培養(yǎng)基中加入2.5毫克TLR3激動劑Poly(IiC)(購自Sigma公司)，使TLR3激動劑Poly(I = C)的終濃度為每毫升25微克，即為可促進雜交瘤生長的培養(yǎng)基。以下用Poly (1:C)-1640命名配制成的該培養(yǎng)基。
[0024]本發(fā)明的培養(yǎng)基配制方法簡單，所需試劑容易獲得，使用方便。
[0025]以下為性能測試部分:
[0026]下列測試是以Poly (1: C)-1640培養(yǎng)基與常規(guī)1640完全培養(yǎng)基在培養(yǎng)克隆細胞上進行的比較。[0027]I) BALB/c小鼠腹腔巨噬細胞懸液的制備
[0028]取12周齡的BALB/c小鼠，拉頸法處死，于70%乙醇水溶液中浸泡10分鐘。在超凈工作臺的解剖盤中打開腹部皮膚，暴露出腹膜，向腹腔中注入10毫升的1640完全培養(yǎng)基，按摩腹部f 2分鐘后，用注射器抽出腹腔液，以每毫升2X 105個細胞的密度加入到96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔加入50微升腹腔巨噬細胞懸液。
[0029]2)將本發(fā)明的Poly (1:C)-1640培養(yǎng)基和常規(guī)1640完全培養(yǎng)基以每孔50微升的量加入到96孔細胞培養(yǎng)板中，每種培養(yǎng)基設(shè)置48個孔。
[0030]3)將處于對數(shù)生長期的鼠抗人IgG單克隆抗體分泌細胞和鼠抗人⑶4單克隆抗體分泌細胞分別用Poly (1: C)-1640培養(yǎng)基和常規(guī)1640完全培養(yǎng)基稀釋到每毫升20個，然后分別加入到含相同培養(yǎng)基的培養(yǎng)板孔中，每孔50微升，置于37攝氏度5% 二氧化碳條件下培養(yǎng)。每種細胞設(shè)置24個孔。
[0031]4)分別于第6天和第9天時每孔更換50微升相同培養(yǎng)基，到第12天時檢測克隆大小和分泌鼠抗人IgG單克隆抗體和鼠抗人CD4單克隆抗體的克隆細胞孔上清的效價。以相同培養(yǎng)條件下有克隆細胞生長孔細胞集落直徑(平均數(shù)土標準差)和抗體效價(OD45tl)作為判斷依據(jù)。
[0032]效果比較
[0033]比較結(jié)果如表1和表2所示。
[0034]表1
[0035]
【權(quán)利要求】
1.一種促進雜交瘤生長的培養(yǎng)基,其特征在于,包括1640完全培養(yǎng)基和添加在所述1640完全培養(yǎng)基中的TLR3激動劑Poly (1:C)，且所述TLR3激動劑Poly (1: C)在所述促進雜交瘤生長的培養(yǎng)基中的濃度為25μ g/ml。
2.一種促進雜交瘤生長的培養(yǎng)基的制備方法，其特征在于，包括如下步驟: 制備1640完全培養(yǎng)基；及 往所述1640完全培養(yǎng)基中加入TLR3激動劑Poly (1: C)，并使所述TLR3激動劑Poly (1: C)的終濃度為 25 μ g/ml。
3.如權(quán)利要求2所述的促進雜交瘤生長的培養(yǎng)基的制備方法，其特征在于，所述制備1640完全培養(yǎng)基的方法包括: 將10.4克RPMI 1640干粉，3.574克4-羥乙基哌嗪乙磺酸，2克碳酸氫鈉粉末用900毫升去離子水溶解，將PH值調(diào)至7.0后定容到1000毫升，在生物安全柜中用0.22微米濾膜過濾除菌后分裝待用，即為1640無血清培養(yǎng)基； 取79毫升1640無血清培養(yǎng)基，加入20毫升胎牛血清，再加入I毫升雙抗溶液，即為1640完全培養(yǎng)基。`
【文檔編號】C12N5/20GK103865879SQ201210548315
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2012年12月17日 優(yōu)先權(quán)日:2012年12月17日
【發(fā)明者】萬曉春, 張茜, 金言, 阮慶國 申請人:深圳先進技術(shù)研究院