專利名稱：乳酸乳球菌N8 Nisin免疫耐受相關(guān)基因irpT及應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種乳酸乳球菌Nisin免疫耐受相關(guān)基因，即irpT基因。
背景技術(shù)：
乳鏈菌肽Nisin高效、安全、無毒,是國際公認的最為安全的生物防腐劑，廣泛應用于食品和醫(yī)藥行業(yè)，對于提高食品安全性、防治細菌性疾病有著重要作用。Nisin可以抑制絕大多數(shù)革蘭氏陽性菌，主要通過抑制細胞壁合成，即形成穿膜孔道、引起胞內(nèi)小分子物質(zhì)外泄、誘導細菌自溶酶釋放或抑制孢子形成四種方式。為避免對自身菌體的破壞，由Nisin基因簇編碼的NisI和NisFEG四個蛋白協(xié)同作用，為產(chǎn)Nisin的乳酸乳球菌提供了免疫保護。但近幾年的研究表明，不產(chǎn)Nisin的乳酸乳球菌也可以被誘導產(chǎn)生對Nisin的耐受性，說明Nisin的免疫耐受系統(tǒng)是一個復雜的調(diào)控網(wǎng)絡。因此，在Nisin基因簇中的基因，乳酸乳球菌中還有很多基因參與免疫耐受性的調(diào)控。有許多基因共同參與，這些基因的功能有的是已知的，有些還有待研究，對Nisin免疫耐受性相關(guān)基因的研究有助于了解Nisin免疫耐受性的網(wǎng)絡調(diào)控機制，通過對Nisin耐受相關(guān)新基因的深入研究，可以進一步解釋Nisin耐受的網(wǎng)絡調(diào)控機制，為構(gòu)建Nisin基因工程菌、提高Nisin工業(yè)產(chǎn)量、降低生產(chǎn)成本提供理論指導，有著重要的理論和現(xiàn)實意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供與乳酸乳球菌Nisin免疫耐受相關(guān)的基因，即irpT基因，為構(gòu)建Nisin高產(chǎn)的基因工程菌提供理論依據(jù)。本發(fā)明提供的乳酸乳球菌Nisin免疫耐受相關(guān)的基因irpT基因，具有如序列表所示核苷酸序列，其基因長度為708bp。上述的提供的乳酸乳球菌Nisin免疫耐受相關(guān)的irpT基因，可以進一步解釋Nisin耐受的網(wǎng)絡調(diào)控機制，并且為構(gòu)建Nisin高產(chǎn)的基因工程菌提供理論依據(jù)。本發(fā)明基因的獲得方法使用人工Mu轉(zhuǎn)座技術(shù)(一種基于噬菌體Mu轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座技術(shù))，造成乳酸乳球菌N8基因突變，建立突變子文庫。篩選Nisin耐受增強的突變子，使用限制性內(nèi)切酶Pvu II對基因組DNA，酶切，酶切片段與pUC18載體連接，通過電轉(zhuǎn)化將連接產(chǎn)物導入大腸桿菌DH5 α，用氨芐青霉素LB平板篩選陽性轉(zhuǎn)化子，測定轉(zhuǎn)化子中插入片段的核苷酸序列，發(fā)現(xiàn)Mu插入的基因，確定此基因與Nisin免疫耐受有相關(guān)性。本發(fā)明的優(yōu)點和有益效果實驗發(fā)現(xiàn)本發(fā)明基因的失活能夠增強乳酸乳球菌對Nisin的免疫耐受性。Mu插入失活基因使細菌對Nisin的免疫耐受性顯著增強，說明此基因與乳酸乳球菌Nisin的免疫耐受性相關(guān)，這可以進一步解釋Nisin耐受的網(wǎng)絡調(diào)控機制，并且為構(gòu)建Nisin高產(chǎn)的基因工程菌提供理論依據(jù)。通過本發(fā)明，可以針對irpT基因設計突變及敲除方法，限制其正常表達，使得乳酸乳球菌對Nisin的免疫耐受性顯著增強，利于工業(yè)上的高效發(fā)酵生產(chǎn)。


圖I是乳酸乳球菌N8和乳酸如球菌irpT: :Mu N8 Nisin MIC (IU/ml)檢測。圖2是Mu轉(zhuǎn)座子PCR產(chǎn)物電泳圖(用PCR方法檢測轉(zhuǎn)化子的Mu轉(zhuǎn)座子)；泳道I為負對照，模板為乳酸乳球菌NS基因；泳道2為正對照，模板為Mu轉(zhuǎn)座子DNA的質(zhì)粒pLEB620 ；泳道M 為 DNAmarker ；泳道4-6為隨機挑選的乳酸乳球菌N8突變株。
用EeyMul和EeyMu2作為引物，可以擴增出730bp的特異性片段，確認Mu轉(zhuǎn)座復合物DNA片段的存在。圖3是乳酸乳球菌N8irpT: :Mu N8基因組單點插入Southern雜交檢測；泳道I為PvuII酶解的乳酸乳球菌N8基因組；泳道2為紅霉素Mu轉(zhuǎn)座子片段；泳道3為PvuII酶解的乳酸乳球菌N8 irpT: :Mu N8基因組；泳道4為EcoRI酶解的乳酸乳球菌N8 irpT: :Mu N8基因組。
具體實施例方式實施例I :使用Mu轉(zhuǎn)座技術(shù)進行突變子文庫的建立(I)Mu轉(zhuǎn)座復合物的制備在25 μ I反應體系內(nèi)，加入I. Ipmol人工Mu轉(zhuǎn)座子DNA，4. 9pmolMuA轉(zhuǎn)座酶和
2.5μ I 的 IOX 反應緩護液(150mM Tris. Hcl, pH6. 0,50%(V/V)甘油，O. 025 (W/V) TritonX-OO, 150mM NaCl，0. ImM EDTA)，30°C水浴中，反應 2h，制得 Mu 轉(zhuǎn)座復合物。(2) Mu轉(zhuǎn)座酶復合物的檢測取5 μ I按上述方法制備的Mu轉(zhuǎn)座復合物，在含有87 μ g/mL BSA, 87 μ g/mL肝素的2%(w/V)瓊脂糖凝膠中電泳，電泳緩沖液為ΙχΤΑΕ，電場強度為4V/cm，電泳時間為2. 5h。I)取I μ IMu轉(zhuǎn)座復合物，用無菌去離子水適當稀釋，加入到L. Iactis Ν8感受態(tài)細胞中，每管細胞復合物用量從60ng到600ng，以30ng為間隔；2) 12kV/cm電壓電擊，30°C靜置培養(yǎng)2h，涂布SR平板；3)30°C靜置培養(yǎng)72h后，將轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)接到含5ug/mL紅霉素的SGM17平板，30°C靜置過夜培養(yǎng)。(3)從過夜培養(yǎng)的SGMl7平板上挑取數(shù)個菌落，分別接種到Im L的SGMl7中，30°C靜置培養(yǎng)16-18h，取I μ I菌液做模板，以EryMul和EryMu2為引物，用PCR方法擴增Mu轉(zhuǎn)座子片段，引物序列為EryMul, 5J GGGATTCGTCATGTTGGT 3，EryMu2，5，GTGGTATGGCGGGTAAGT 3，。PCR 體系為PCR Buffer 2 μ 1，dNTPl. 5 μ 1，EryMul I μ I, EryMu2 I μ I,菌液
Iμ I, Taq酶O. 2 μ I,用無菌去離子水補至20 μ I。擴增條件為，94°C預變性15min，94°C變性lmin，55°C退火lmin，72°C延伸lmin，共30個循環(huán)，最后72°C延伸IOmin。PCR產(chǎn)物用O. 8%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色后紫外燈下觀察結(jié)果并留照片，具有Ery抗性基因的轉(zhuǎn)化子即為Mu轉(zhuǎn)座復合物轉(zhuǎn)化子。實施例2 = Nisin耐受性檢測米用最小抑菌濃度(MinimumInhibitory Concentrations,MIC)檢測.配制含有一系列Nisin效價(0-7000IU/mL)的液體SGM17培養(yǎng)基，按1%比例將30°C靜置過夜培養(yǎng)的乳酸球菌菌液接種到這些SGM17培養(yǎng)基中，注入無菌96孔板中，密封30°C靜置培養(yǎng)24h后觀察乳酸乳球菌的生長情況，并用酶標儀在595nm下檢測培養(yǎng)基濁度，濁度增長不超過10%的作為耐受性的臨界值。并按.照Takala和Saris所述生長曲線檢測法，檢測在不同Nisin效價(0-7000IU/mL)下乳酸乳球菌的耐受性(見圖I)。 實施例3 :乳酸乳球菌N8Nisin免疫耐受相關(guān)基因的克隆I、Mu轉(zhuǎn)座復合物轉(zhuǎn)化子基因組DNA的提取I)從菌種甘油保存管中接菌至含相應抗生素的SGM17平板，30°C靜置過夜培養(yǎng)；挑取新鮮劃線培養(yǎng)的單菌落，接種到5mL含相應抗生素的SGM17液體培養(yǎng)基中，30°C靜置培養(yǎng) 16-20h;2)按1:100接種于201^含相應抗生素的561117液體培養(yǎng)基中，301靜置培養(yǎng)811;3)將菌液轉(zhuǎn)移至50mL離心管中，4°C , 12000rpm離心lmin,收集菌體；4)在離心管中加入 2mL 裂解緩沖液(IOmM Tris. Hcl, O. lmol/L EDTA, O. 5%SDS)，充分懸浮菌體，再加入40 μ I溶菌酶(10mg/mL)和40 μ IRNA酶(10mg/mL)，37°C水浴3h;5)加入2mL2%的SDS’顛倒混勻至溶液澄清，再加10 μ I蛋白酶K，混勻后56°C水浴過夜，使蛋白酶K能充分水解蛋白；6)加入等體積的Tris飽和苯酚/氯仿/異戊醇混合液(25:24:1)，劇烈振蕩，12000rpm離心IOmin;用剪掉尖頭的ImL槍頭吸取上層水相轉(zhuǎn)移至新離心管中，重復用酚/氯仿/異戊醇混合液(25:24:1)抽提I次；7)吸取上清，加入2. 5倍體積無水乙醇，用玻璃棒或槍頭攪出沉淀，放置于新的離心管中；用70%乙醇洗兩次，真空干燥lOmin，充分溶解于2mLTEN溶液8)加入20 μ IRNase (10mg/mL), 37°C水浴Ih;用等體積的Tris飽和苯酹/氯仿/異戊醇混合液(25:24:1)進行抽提，操作步驟同步驟6;9)吸取上清，加入2. 5倍體積無水乙醇，-20 °C靜置lh，40 V，12000rpm離心IOmin;10)棄去上清，用70%乙醇洗兩次，真空干燥lOmin，溶于適量ΤΕ(ΡΗ7·5)中，于0. 8%的瓊脂糖凝膠(含0. 5 μ g/mLEB)電泳檢測DNA的質(zhì)量及濃度。2、大量提取大腸桿菌質(zhì)粒pUC18(l)25mL液體LB培養(yǎng)基，接入攜帶質(zhì)粒pUC18的大腸桿菌單菌落，30°C、200r/min培養(yǎng)過夜。(2)菌液的OD6tltl值大于6000r/min離心10分鐘,棄上清。(3)加 STE 溶液(IOOmM NaCl, IOmM Tris. Cl pH8. O, ImM EDTA) 12. 5mL 洗細胞，4°C 6000r/min離心10分鐘，棄上清。(4)加溶液 I (50mM 葡萄糖，IOmM EDTA, 25mM Tris. Cl, ρΗ8· 0) 0. 5mL 再向各管中加入溶菌酶(反應濃度20 μ g/mL)，輕微混，37°C水浴15_30min。(5)加溶液II (0.2MNa0H，l%SDS) ImL輕輕混勻至透明，冰浴10分鐘。(6)加入溶液III (3M KAc, 5M乙酸，ρΗ4· 8) O. 75mL劇烈振蕩后，冰浴30分鐘。(7) 4°C 12000r/min 離心 5 分鐘，取上清。(8)加入O. 7體積的異丙醇，室溫放置15分鐘。(9) 4°C 12000r/min 離心 10 分鐘,棄上清。(10)加入100 μ L TE溶液溶解核酸。(11)加入RNase (反應濃度為100 μ g/mL) 37°C水浴30分鐘。 (12)等體積苯酹:氯仿(I: I),抽提,振蕩均勻，4°C 12000r/min離心15分鐘,取上清。(13)加入2倍體積的無水乙醇和1/10體積的3mol/L NaAc (pH4. 8)，_20°C放置20分鐘沉淀DNA。(14) 4°C 12000r/min 離心 10 分鐘，棄上清。(15)加入lmL70%的冷乙醇洗DNA沉淀兩次，干燥。(16)加入50 μ L TE溶解質(zhì)粒，_20°C保存。3、基因組的酶切和基因克隆基因組的酶切體系基因組DNA 10 μ g，限制性內(nèi)切酶Buffer 5 μ 1，限制性內(nèi)切酶(如Pvu II、Sma I) 3 μ I,用無菌去離子水補體積至50 μ I,水浴反應過夜。酶切反應后處理I)、70°C水浴反應，IOminJp 250 μ I無菌去離子水；2)加入300 μ ITris飽和苯酚/氯仿/異戊醇混合液(25:24:1)，顛倒混勻，4°C，12000rpm離心5min,將上清轉(zhuǎn)移至另一新管；3)加入1/10體積的3M NaAc (pH4. 5)，充分混勻后加入2. 5倍體積無水乙醇，_20°C靜置Ih;4) 4°C, 12000rpm 離心 IOmin,棄上清；5)加入lmL70%乙醇,4°C, 12000rpm離心5min,棄上清并重復一次,盡量吸凈殘留的液體；6)真空抽干，基因組DNA溶于10 μ I無菌去離子水中，于O. 8%的瓊脂糖凝膠(含O. 5 μ g/mLEB)電泳檢測DNA的質(zhì)量及濃度。4、載體的酶切和去磷酸化克隆載體pUC18酶切體系質(zhì)粒DNA 5 μ g，限制性內(nèi)切酶Buffer 5 μ 1，限制性內(nèi)切酶(如SmaI) 2. 5 μ 1，用無菌去離子水補體積至50 μ 1，水浴反應過夜。為了降低酶切后線性載體DNA分子自身連接成環(huán)的比率并同時提高連接效率，用小腸堿性磷酸單酷酶(CIAP)除去線性化的載體分子5’末端的磷酸基團。酶促反應體系為酶切后回收的PUC18載體46. 5 μ 1，IOx 堿性磷酸酶 Buffer 5 μ I, CIAP I. 5 μ 1，37°C水浴反應 lh。5去磷酸化酶的除去 (I) TE 補足至 200L,加入 2 μ L O. 5mol/L EDTA。(2) 75°C水浴10分鐘，使酶失活，并降至室溫。(3)等體積的苯酚氯仿(I: I)抽提一次。
(4)加入2倍體積的無水乙醇和1/10體積的3mol/L NaAc (pH4. 8)，_20°C放置20分鐘沉淀DNA。(5) 4°C 12000r/min 離心 10 分鐘，棄上清。(6)加入lmL70%的冷乙醇洗DNA沉淀兩次，真空干燥。(7 )沉淀溶于 5 μ L ddH20 中。6基因組DNA和質(zhì)粒pUC18的連接(15 μ I體系)DNA 10. 9 μ LpUC18 2 μ L·
混勻，45°C水浴5分鐘后，迅速冰浴，再加T4連接酶O. 6 μ L, IOXbuffer I. 5 μ L，用無菌去離子水補至15 μ I,混勻，16°C水浴過夜。7大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細胞的制備(I)將大腸桿菌單菌落接種于5mLLB液體培養(yǎng)基中，37 °C >200轉(zhuǎn)/分鐘過夜培養(yǎng)。(2)過夜培養(yǎng)的菌液按I :100接種于IOOmL LB液體培養(yǎng)基中，37°C、220r/min振
蕩培養(yǎng)。(3)菌液OD6tltl在O. 5-0. 6之間時終止培養(yǎng)并置于冰上。(4)轉(zhuǎn)移至250mL離心中，4°C、6000r/min離心lOmin,收集菌體。(5) IOOmL預冷的ddH20懸浮洗滌細胞，4°C 6000r/min離心10分鐘，收集菌體。(6)50mL預冷的10%甘油懸浮洗滌細胞，4°C 6000r/min離心10分鐘，收集菌體。(7)用2mL預冷的10%甘油懸浮洗漆細胞,4°C 6000r/min離心10分鐘,棄上清,盡量吸干管壁上的殘留液體。(8)用200 μ L預冷的10%甘油培養(yǎng)基重懸細胞。(9) 100倍稀釋后測菌液OD6c ，用預冷的10%甘油培養(yǎng)液將菌液稀釋至濃度為
2X 1010-3 X IO10 個細胞 /mL (IOD600 約相當于 2. 5 X IO10 個細胞 /ml)。(10)將菌液分裝，每管95 μ L。用于電轉(zhuǎn)化或_70°C保存。8大腸桿菌DH5 α的電轉(zhuǎn)化方法(l)5uL DNA連接產(chǎn)物與95 μ L大腸桿菌感受態(tài)細胞混勻，冰浴5-10分鐘。(2)混合物轉(zhuǎn)移至預冷的O. 2cm電轉(zhuǎn)化杯中(陰性對照不加混合物，只加感受態(tài)細胞)，在Bio-Rad電轉(zhuǎn)化儀上設置2. 50kv，進行電擊。(3)從電轉(zhuǎn)化杯中吸出電轉(zhuǎn)化體系，并用ImL 37°C預熱的SOC液體培養(yǎng)基(20g/L胰蛋白胨，5g/L酵母粉，O. 5g/L NaCl 20mM葡萄糖，IOmM氯化鎂)稀釋后，37°C，150轉(zhuǎn)/分鐘培養(yǎng)I小時。(4)將復蘇液涂布于SOC或LB固體培養(yǎng)基平板(含紅霉素抗性和氨芐青霉素抗性)，37 °C靜置培養(yǎng)24h后選取轉(zhuǎn)化子。9克隆子的篩選與序列分析(I)從過夜培養(yǎng)的雙抗平板上挑取轉(zhuǎn)化子，小量提取質(zhì)粒，以EryMul和EryMu2為引物對克隆的轉(zhuǎn)化子進行PCR。(2)以DL2000為DNA標準，在O. 8%瓊脂糖凝膠中電泳檢測鑒定，若能擴增出730bp的特異性帶，則說明轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒中含有人工Mu轉(zhuǎn)座子DNA片段(電泳結(jié)果與圖2相同)，克隆成功。
10克隆子質(zhì)粒的DNA測序?qū)⒂?5%甘油管保存的轉(zhuǎn)化子菌液，根據(jù)人工Mu轉(zhuǎn)座子兩端的反同序列設計引物ErySeql和ErySeq2,測定轉(zhuǎn)座子插入位點側(cè)翼的核苷酸序列，委托上海英俊公司進行DNA測序，測序結(jié)果其核苷酸序列如序列表所示。引物序列為ErySeql，5’TTCCAAGAAGC TAAAGAG3’ ；ErySeq2，5，GGCATGCATCGATAGATC 3 ’
11基因推斷測序結(jié)果在GenBank 數(shù)據(jù)庫(http: IIwm. ncbi. nlm. nih. gov/)中進行 BLAST 比對相關(guān)基因的信息，獲得轉(zhuǎn)座一子插入位點側(cè)翼的核普酸序列。
權(quán)利要求
1.乳酸乳球菌NiSin免疫耐受相關(guān)的基因irpT，其核苷酸序列如序列表所示，其基因長度為708bp。
2.權(quán)利要求I所述的乳酸乳球菌對Nisin免疫耐受相關(guān)基因irpT的應用，用于構(gòu)建Nisin高產(chǎn)工程菌。
全文摘要
本發(fā)明公開了乳酸乳球菌Nisin免疫耐受相關(guān)基因irpT(其核苷酸序列如序列表所示)。屬于微生物生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明與乳酸乳球菌Nisin免疫耐受研究息息相關(guān)，此基因大小為708bp，國際上對該基因的功能沒有報道。實驗發(fā)現(xiàn)該基因的失活能夠使乳酸乳球菌對Nisin的耐受性增強，研究發(fā)現(xiàn)其作用機制通過調(diào)節(jié)細胞壁的合成來增強Nisin耐受性。通過對Nisin耐受相關(guān)新基因的深入研究，可以進一步解釋Nisin耐受的網(wǎng)絡調(diào)控機制，為構(gòu)建Nisin高產(chǎn)工程菌提供基礎(chǔ)及理論依據(jù)。
文檔編號C12N1/20GK102943079SQ20121054906
公開日2013年2月27日 申請日期2012年12月17日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月17日
發(fā)明者喬明強, 趙凱, 朱多龍, 張續(xù), 馮舟, 軒轅錚錚, 白艷玲, 徐海津, 張秀明 申請人:南開大學