專利名稱：甜高粱高糖基因的scar標記的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及甜聞梁聞糖基因的SCAR標記,特別是甜聞梁聞糖基因的標記的RAPD標記以及由該標記轉化的SCAR標記,屬于生物技術領域。
背景技術：
隨著全球工業(yè)水平的提高能源消耗越來越大，石油化工等不可再生資源短缺是人們普遍關注的問題。我國是世界第二大能源消費國，對于再生能源物質的開發(fā)已成為農業(yè)生產中的重點。酒精是清潔汽油生產的主要替代物，車用乙醇汽油是在現有的車用汽油中加入改性后的燃料酒精，汽車動力性能增加，可防止在北方冬季汽油管凍結，也可大大減輕對臭氧層的危害，植物燃料酒精的利用具有環(huán)境和經濟的雙重效益。目前我國解決能源短缺問題主要是利用可再生能源來代替石化燃料，甜高粱酒精燃料的開發(fā)將對我國產業(yè)機構的調整、能源安全和環(huán)境保護起到舉足輕重的作用。在我國農業(yè)生產中，甜高粱以其優(yōu)良的品種特性已越來越受到關注，當前已經推廣到24個省、市、自治區(qū)，僅北京、天津二市種植面積就達6萬畝以上。甜高粱耐澇，耐旱，耐鹽堿，被稱為作物中的“駱駝”，甜高粱是C4植物，具有極高的光合速率，生物學產量極高，它不僅每畝收獲100 400kg的糧食，更重要的是每畝可產4000 5000kg富含糖分(含糖17% 21%)的莖桿。研究表明，每畝甜高粱每天合成的碳水化合物可生產3. 2L酒精，是玉米的3. 2倍、小麥的16倍。從榨汁后的殘渣中還可獲得占總收獲量50%以上的酒精。所以說提高甜高粱的含糖量可以增加酒精的合成量，有助于降低生產乙醇燃料的成本，從而促使乙醇燃料可以在世界范圍內廣泛地使用。除此之外，甜高粱的糖料價值和飼料價值也主要體現在其含糖量高于甜菜、玉米等經濟作物。進一步提高甜高粱的含糖量即可迅速提升其利用價值，在生產實踐中具有極其重要的意義，因此選育高含糖量的優(yōu)良品種是科研工作者面臨的重要的課題。選育甜高粱的優(yōu)良品種是提高莖桿含糖量的最有效途徑，而應用生物技術中的分子標記方法鑒選甜高粱新材料。通過加強對甜高粱抗病、抗蟲、特別是含糖量等性狀的遺傳規(guī)律和分子標記研究，實現在實驗室內的選擇鑒定，將會大幅度提高選育的準確性和效率。長期以來，作物育種的選擇都是依靠表現型進行的，而分子標記輔助選擇MMAS(Molecular Marker-Assisted Selection),將給傳統(tǒng)的育種研究帶來深刻變革。本發(fā)明應用RAro和SCAR技術相結合，對高糖基因進行分子標記研究，以期通過標記篩選獲得甜高粱高含糖量的新材料。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是針對上述現有技術的不足，而將RAPD和SCAR兩種標記技術結合起來，以甜高粱LTR102 (母本)，高粱654 (父本)以及它們雜交的F5代為試材，篩選和甜高粱高糖基因緊密連鎖的分子標記，并獲得了一條甜高粱高糖基因的DNA特異譜帶。本發(fā)明的目的一應用PCR擴增技術獲得了一個與甜高粱高糖基因緊密連鎖的S3361119 標記。本發(fā)明的目的二 將RAro標記轉化為穩(wěn)定性、重復性強的SCAR標記，并用此標記對F5代進行了檢測，建立甜高粱高糖品種篩選的快速鑒定標準，為實踐了分子標記輔助育種、縮短育種周期提供了技術保障。(I) F5群體的構建本發(fā)明以甜高粱LTR102為母本，高粱654為父本，雜交獲得F5代，其中87株高糖及33株低糖。應用分離群體分組分析法(Bulked Segregation Analysis)即BSA法。將？5代分為高池及低池，高池和低池是分別由F5代87株高糖株葉片及33株低糖株葉片提取DNA混勻而成，制備時每株均取lOngDNA。 (2)確定提取甜高粱葉片總DNA的最佳方法。即CTAB-1I法。(3)應用PCR擴增儀，建立并優(yōu)化了高粱RAPD反應體系，獲得了穩(wěn)定高效的RAPD擴增結果。(4)首次獲得了與甜高粱高糖基因緊密連鎖的RAro標記。應用RAro技術篩選400條隨機引物，其中引物S3361119與甜高粱高糖基因緊密連鎖。(5)首次對甜高粱高糖基因的RAPD標記進行克隆測序。將特異的S3361119DNA片段回收純化之后，測序結果表明，片段長分別為1119bp。故將這個標記命名為S3361119。(6)首次將甜高粱高糖基因的RAPD標記轉化為SCAR標記。對F5代個體進行SCAR檢測。高糖個體中也得到了 S3361119特異譜帶，而低糖個體則未見，從而為分子標記輔助育種提供了可靠的依據。本發(fā)明的特點在于將該標記應用于甜高粱高糖品種的早期選擇，淘汰低糖品種基因型，加快育種進程，節(jié)省選育所需的試驗用地和成本，具有較大的實用價值。為分子標記輔助育種提供了依據，克服了那些由于表型鑒定困難用通常的方法輔助選擇工作量非常巨大的困難，為實踐分子標記輔助育種、縮短育種周期提供了技術保障。同時填補甜高粱高糖基因分子標記輔助選擇研究的國、內外空白。


圖1為本發(fā)明的RAPD引物S3361119標記擴增甜高粱DNA的電泳圖譜。圖2是S3361119的回收克隆片段的電泳圖譜。圖3是S3361119SCAR標記對部分單株的檢測結果。
具體實施例方式參照圖1，如圖所示高粱654 (父本)(1)，甜高粱LTR102 (母本)(2)，F5高糖基因池(3) ,F5 低糖基因池(4) ,Marker (M)0參照圖2，如圖所示回收圖片(1)，母本(2)，Marker (M)0參照圖3，父本(1)，母本(2)，高糖基因池(3)，低糖基因池(4)，F5高含糖單株(5-9)，F5 低含糖單株(10-14)，Marker (M)01.材料和方法1.1試驗材料
甜高粱LTR102 (母本)，高粱654 (父本)以及它們雜交的F5代個體。1. 2藥品、儀器與設備400條隨機引物(S1-S400)，由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。IU/μ ITaq酶(Fermantous) ;10mmol/L dNTPs，均購于上海生工生物工程技術服務有限公司。PCR儀EN 61010-1。紫外透射反射分析儀，型號NT。1. 3實驗總體設計近等基因池的建立一基因組DNA的提取(CTAB法)一RAPD擴增一瓊脂糖電泳一電泳譜帶分析一數據處理分析一多態(tài)性片段的回收、純化、克隆與鑒定、序列分析一RAro標記轉化為SCAR標記一用于高含糖量品種鑒定一確定鑒定方法一選育新品種 1. 4近等基因池的建立應用分離群體分組分析法(Bulked Segregation Analysis)即BSA法。將F5代分為高糖基因池及低糖基因池，高糖基因池池和低糖基因池池是分別由F5代87株高含糖植株葉片及33株低含糖植株葉片提取DNA混勻而成，制備時每株均取lOngDNA。1. 5RAPD 分析PCR擴增反應系統(tǒng)總體積為25 μ L，含I倍擴增緩沖液，1. 5U Taq酶，50ng的模板DNA，100ymol/L的dNTP，0. 2ymol/L引物，上覆礦物油。反應程序為:預變性94°C 3min —變性 94°C 20s，退火 38°C 30s，延伸 72°C lmin，循環(huán) 35 次一延伸 72°C IOmin0用上海生物工程技術服務公司合成的400條隨機引物(S1-S400)，對親本及高糖基因池、低糖基因池4個樣品進行分析，如4個樣品擴增出的RAPD產物帶型相同，則無多態(tài)性，而如擴增產物中的帶型有差異，則對這些引物進行重復并進行連鎖分析。1. 6產物檢測擴增產物在1. 4%含O. 5 μ g/mLEB的瓊脂糖凝膠中電泳，電壓為每厘米3_4伏，電泳結果用紫外透射反射分析儀觀察。1. 7連鎖分析當某一引物在鑒定的甜高粱高糖基因的F5代分離群體(即高糖基因池及低糖基因池)及親本間選到穩(wěn)定的多態(tài)性片段(RAPD)標記后，取F5抗、感單株各10株，用篩選到的引物進行分析。如果存在連鎖關系進一步擴大群體分析，統(tǒng)計單株的RAro標記，計算重組率和遺傳距離。若RAPD標記與高糖基因緊密連鎖，則進行多態(tài)性片段回收。
交換型株數
重組率=高糖株數+低糖株Xl00%
數交換型株數=高含糖單株樣本群中不含多態(tài)性譜帶的株數+低含糖單株樣本群中含有多態(tài)性譜帶的株數。再通過Mapmaker 3. O計算機軟件分析，可將重組率轉換為遺傳距離即是圖距單位(centimorgan, cM)。1. 8多態(tài)性片段的回收、純化、克隆與鑒定將回收純化的片段克隆于pMD 18-T Vector載體上。在ABI PRISMTM 377XL測序儀上進行測序。
1. 9RAPD標記轉化為SCAR標記根據測序結果，從序列兩端按引物的要求設計出一對引物，引物由寶生物工程(大連)有限公司合成。SCAR的PCR基本反應體系10XBuffer 2. 5 μ l,25mmol/L MgCl2 2. 5 μ I, IOmmol/L dNTPs O. 5 μ 1,5υ/μ I Taq 酶 O. 5 μ 1，10 μ mol/μ I 上下游引物各 O. 2 μ 1，20ng/μ I DNA模版1. O μ I,用 ddwater 補足 25 μ I。擴增參數94°C3min — (94°C變性 30s — 60°C退火 30s — 72°C延伸 lmin) 35 次循環(huán)一72°C延伸IOmin — 4°C保存。用這對引物檢測甜高粱LTR102 (母本)、高粱654 (父本)及二者雜交后的F5高糖基因池、低糖基因池和F5單株，比較其與RAPD分析的一致性和可靠性。 實施實例1:與抗絲黑穗病基因連鎖的RAPD多態(tài)性標記的獲得本發(fā)明用400對(S1-S400) RAPD引物對親本及其F5代群體進行了標記分析。其中的337對引物擴增出產物，63對未擴增出產物，擴增率為84. 25%。其中引物S336在親本及其F5代群體擴增出一條穩(wěn)定的差異譜帶，根據Maker顯示片段大小大在1200bp左右，對這個差異譜帶進行了共分離分析，共分析了 120株F5代個體，其中高含糖個體87株，低含糖個體33株，分析結果表明，重組率為3.3% (見圖1)。實施實例2 :與高糖基因連鎖的RAPD標記的回收及測序將與高糖基因連鎖的S3361119多態(tài)性片段回收測序，測序結果表明差異片段大小為1119 (見圖2),故將這個標記命名為S3361119,該標記測序結果如下。多態(tài)性差異片段S3361119的測序結果
權利要求
1.甜高粱高含糖基因的SCAR標記S3361119，其序列為
2.如權利要求1所述的甜高粱高含糖基因的SCAR標記S3361119，其特征在于擴增該標記引物序列為S3361119F :5’ CTGTGTGATGTAGCCTC 3’S3361119R :5’ ATCCTAAACCCATCAGTG 3’。
3.—種檢測甜高粱含糖量的快速PCR方法，PCR反應體系中含有權利要求2所述的引物5336111；^和S3361119R的核苷酸序列，上述PCR反應體系為10XBuffer 2. 5 μ I, 25mmol/L MgCl2 2. 5 μ 1,10mmol/L dNTPs O. 5 μ l,5U/y I Taq酶O. 5 μ 1，10μπιο1/μ I 上下游引物各 O. 2 μ I, 20ng/ μ I DNA 模版1. O μ I,用 ddwater 補足 25 μ I。
擴增參數94°C 3min — (94°C變性30s — 60°C退火30s — 72°C延伸lmin) 35次循環(huán)—72°C延伸IOmin — 4°C保存。(用這對引物檢測甜高粱LTR102 (母本)、高粱654 (父本)及二者雜交后的F5高糖基因池、低糖基因池和F5單株中權利I的SCAR標記S3361119)。
全文摘要
甜高粱高糖基因的SCAR標記，以甜高粱LTR102為母本，高粱654為父本。應用BSA法和RAPD技術篩選400個隨機引物，其中引物S336擴增出差異譜帶，共分離分析結果表明，120株后代中S3361119有3株重組，重組率為3.3%。將引物S336擴增出的RAPD片段回收純化、克隆、測序。結果表明目的片段長度為1119bp。將這個標記命名為S3361119。根據測序結果設計一對特異性引物，進行特異性擴增將RAPD標記成功轉化為SCAR標記，并用此標記對F5代及部分高粱、甜高粱品種進行了快速的PCR檢測，從甜高粱和高粱品種中找到了分子標記特異譜帶，從而建立了甜高粱含糖量的SCAR標記快速檢測方法，為快速篩選高含糖量優(yōu)良品種的提供了依據，進而為實現分子標記輔助育種、縮短育種周期提供了技術保障。
文檔編號C12N15/11GK103013992SQ20121054966
公開日2013年4月3日 申請日期2012年12月17日 優(yōu)先權日2012年12月17日
發(fā)明者李玥瑩, 宇鑫, 魏鑫, 李雪梅, 馬蓮菊, 鄒劍秋, 邢慧清, 張云鶴, 常方照, 段可, 張寧 申請人:沈陽師范大學