專利名稱：季也蒙畢赤酵母發(fā)酵酒糟水解液生產(chǎn)木糖醇的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種發(fā)酵法生產(chǎn)木糖醇的工藝，尤其是一種季也蒙畢赤酵母發(fā)酵酒糟水解液生產(chǎn)木糖醇的方法。
背景技術(shù)：
木糖醇(Xylitol)也叫戊五醇，是一種五碳糖醇。它的分子式為C5H12O5，是木糖代謝的正常中間產(chǎn)物，外形為結(jié)晶性白色粉末，它可用作甜味劑、營養(yǎng)劑和藥劑在化工、食品、 醫(yī)藥等工業(yè)中廣泛應(yīng)用。同時(shí)木糖醇是一種無致齲性的甜味劑，已廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域；在體內(nèi)代謝不需胰島素參與，因此適合作為糖尿病患者的甜味替代品。生產(chǎn)木糖醇的原料多來源于富含多縮戊糖的玉米芯、棉子殼、甘蔗渣、樺木片等農(nóng)副產(chǎn)品，這些原料經(jīng)過高溫水解后成為含大量木糖的水解液。工業(yè)上一般采用加氫催 化經(jīng)過高度純化的木糖溶液生產(chǎn)木糖醇。該方法產(chǎn)率低、成本高、污染較嚴(yán)重。
酒糟成分復(fù)雜，但主要是以稻殼等半纖維素物質(zhì)為主，而稻殼中多縮戊糖的含量占169Γ22%。近幾年，我國酒糟的年產(chǎn)量約為1000萬t，數(shù)量相當(dāng)可觀。以酒糟為原料，利用季也蒙畢赤酵母發(fā)酵生產(chǎn)木糖醇的研究還未見報(bào)道。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明在于克服背景技術(shù)中存在的現(xiàn)有木糖醇生產(chǎn)工藝成本高、污染較嚴(yán)重的問題，而提供一種季也蒙畢赤酵母發(fā)酵酒糟水解液生產(chǎn)木糖醇的方法。該季也蒙畢赤酵母發(fā)酵酒糟水解液生產(chǎn)木糖醇的方法，選擇以酒糟為原料，工藝條件溫和、能耗低、環(huán)境污染低、 產(chǎn)品質(zhì)量更加安全可靠，大大降低了生產(chǎn)成本。
本發(fā)明解決其問題可通過如下技術(shù)方案來達(dá)到一種季也蒙畢赤酵母發(fā)酵酒糟水解液生產(chǎn)木糖醇的方法，包括以下步驟(1)制備酒糟水解液將烘干后的酒糟粉碎至粒徑40目，按1:5的比例(w/v)與0.1%的NaOH溶液混合，攪拌下加熱煮沸I h，冷卻后用濾布過濾，棄去濾液，用清水洗滌濾渣，再將濾渣與1000 mL水共煮I h，過濾，除去灰分后的濾渣留待下步水解；采用由1%HC1和1% H3PO4K組成的混合酸水解酒糟，水解溫度100°C，固液比1:10(w/v)，水解2 h ;水解液85°C濃縮至木糖含量約40 g/L，再以1:10的比例(w/v)加入活性炭脫色；用石灰乳中和至pH 5.0，抽濾去除Ca3(PO4)2 沉淀后，所得水解液于4°C冷藏備用；(2)培養(yǎng)基YPD培養(yǎng)基配制YPD斜面培養(yǎng)基，用于菌種的活化；種子培養(yǎng)基含木糖約20g/ L的原始酒糟水解液lOOmL，酵母膏10 g/L，蛋白胨20 g/ L, MgSO4 · 7H20 O. 2 g/L, KH2PO4 5g/L, ρΗ5· 5，110°C滅菌 20 min ；發(fā)酵培養(yǎng)基含木糖約40g/L 90mL的濃縮的酒糟水解液中，補(bǔ)加10 mL有機(jī)氮源溶液， 有機(jī)氮源溶液為酵母膏10g/L及蛋白胨20g/L ;起始pH5. 0,110°C滅菌20 min ；(3)木糖醇發(fā)酵斜面培養(yǎng)將季也蒙畢赤酵母菌種接種于YPD試管斜面上；液體種子培養(yǎng)取斜面菌種I環(huán)，接入液體種子培養(yǎng)基中，250mL三角瓶裝種子培養(yǎng)基液量 50 mL,于 28°C，搖床 200 r /min 培養(yǎng) 24 h ；搖瓶發(fā)酵將液體種子接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，搖瓶內(nèi)種子培養(yǎng)的最優(yōu)工藝為裝液量為1/5;接種量5%，溫度為28 °C，轉(zhuǎn)速為180 r/min，發(fā)酵48 h結(jié)束，制得含木糖醇的發(fā)酵液；用高效液相色譜儀測定，得出保留時(shí)間和色譜峰面積，測得木糖醇的含量。
所述的采用高效液相色譜儀測定時(shí)色譜條件為=Thermo-NH2柱；柱溫常溫；流動相乙腈水=85 15 ;流速lmL/min ;示差折光檢測器檢測,進(jìn)樣量為20μ 。
季也蒙畢赤酵母發(fā)酵酒糟水解液生產(chǎn)木糖醇機(jī)理為酒糟水解液作為木糖原料(基質(zhì))，在木糖還原酶的作用下還原成木糖醇，在此反應(yīng)中的催化劑主要利用了輔酶 NADPH,季也蒙畢赤酵母細(xì)胞內(nèi)NADP主要通過戊糖磷酸的代謝路線轉(zhuǎn)化成NADPH。另一方面，細(xì)胞內(nèi)的NADH在好氣條件下經(jīng)過呼吸反應(yīng)鏈的反應(yīng)后再生成NAD+。木糖還原酶利用 NADPH和NADH兩者而存在，催化木糖反應(yīng)生成木糖醇。
發(fā)酵過程中，起始pH對木糖醇轉(zhuǎn)化影響較大的原因是在較低pH (<4. O)的條件下，酒糟水解液中含有濃度較高的有機(jī)酸，這些物質(zhì)會強(qiáng)烈抑制酵母生長及阻遏木糖還原酶的誘導(dǎo)合成力和比活力。在pH 5.(Te.O的微酸環(huán)境下，木糖還原酶與木糖脫氫酶的酶活力達(dá)到最大，木糖醇生成率大幅提聞，而pH值過聞不利于木糖醇的積累，并且容易染菌，不利于發(fā)酵。
接種量必須適中，接種量過小，季也蒙畢赤酵母發(fā)酵時(shí)間會延長，木糖醇的得率下降；接種量過大，則在 發(fā)酵初期會消耗過多的底物，不利于木糖醇的積累。
轉(zhuǎn)速的提高則是大大加大了菌液中各種有機(jī)物質(zhì)及季也蒙畢赤酵母菌和空氣的接觸機(jī)會，從而最大程度的保證了木糖醇的最大生成量。
溫度可以使還原酶和木糖脫氫酶等酶保持在最大的活力，從而促使季也蒙畢赤酵母能夠最大程度的發(fā)酵酒糟水解液生產(chǎn)木糖醇，溫度在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中都是非常重要的， 是不可忽略的重要因素。
在測定時(shí)，采用高效液相色譜法示差折光檢測器檢測無紫外吸收的糖類化合物， 樣品無需衍生處理，過濾后，便可以直接進(jìn)樣檢測。采用Thermo-NH2分析柱分離發(fā)酵液中的木糖醇，一次進(jìn)樣，IOmin左右即完成色譜分離過程，有分離效果好，分析速度快，操作簡便的優(yōu)點(diǎn)，最適合檢測分離木糖醇的樣品。
本發(fā)明與上述背景技術(shù)相比較可具有如下有益效果該季也蒙畢赤酵母發(fā)酵酒糟水解液生產(chǎn)木糖醇的方法，采用季也蒙畢赤酵母發(fā)酵酒糟水解液，得到較高產(chǎn)量的木糖醇， 對利用酒糟這種生物廢棄物成為生產(chǎn)木糖醇的原料的可能性提供理論依據(jù)；工藝條件溫和、能耗低、環(huán)境污染低、產(chǎn)品質(zhì)量更加安全可靠大大降低了生產(chǎn)成本。采用季也蒙畢赤酵母進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)木糖醇具有菌體密度高，反應(yīng)快，抗干擾能力強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，可縮短發(fā)酵周期， 提高轉(zhuǎn)化率，節(jié)省人力、物力以及產(chǎn)物分離方便，菌體可重復(fù)連續(xù)使用


附圖1是本發(fā)明木糖醇標(biāo)準(zhǔn)品高效液相色譜圖；附圖2是本發(fā)明最佳條件下發(fā)酵液的高效液相色譜圖。
具體實(shí)施例方式下面將結(jié)合附圖及具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明實(shí)施例1(1)制備酒糟水解液將烘干后的酒糟粉碎至粒徑40目，按1:5的比例(w/v)與0.1%的NaOH溶液混合，攪拌下加熱煮沸I h，冷卻后用濾布過濾，棄去濾液，用清水洗滌濾渣，再將濾渣與1000 mL水共煮I h，過濾，除去灰分后的濾渣留待下步水解；采用由1%HC1和1% H3PO4所組成的混合酸水解酒糟，水解溫度100°C，固液比1:10 (w/v)，水解2 h ;水解液85°C濃縮至木糖含量約 40 g/L，再以1:10的比例(w/v)加入活性炭脫色，濃縮和脫色可提高水解液中的初始木糖濃度，同時(shí)也除去水解液中的有機(jī)酸、糠醛和色素等有害物質(zhì)；用石灰乳中和至PH 5. 0，抽濾去除Ca3(PO4)2沉淀后，所得水解液于4°C冷藏備用；(2)培養(yǎng)基YPD培養(yǎng)基配制Yro斜面培養(yǎng)基，用于菌種的活化；種子培養(yǎng)基含木糖20g/ L的原始酒糟水解液lOOmL，酵母膏10 g/L，蛋白胨20 g/L, MgSO4 · 7H20 O. 2 g/L, KH2PO4 5g/L, ρΗ5· 5，110°C滅菌 20 min ；發(fā)酵培養(yǎng)基含木糖40g/L 90mL的濃縮的酒糟水解液中，補(bǔ)加IOmL有機(jī)氮源溶液，有機(jī)氮源溶液為酵母膏10g/L及 蛋白胨20g/L ;起始pH5. 0,110°C滅菌20 min ；(3)木糖醇發(fā)酵斜面培養(yǎng)將季也蒙畢赤酵母菌種接種于YPD試管斜面上；液體種子培養(yǎng)取斜面菌種I環(huán)，接入液體種子培養(yǎng)基中，250mL三角瓶裝種子培養(yǎng)基液量100 mL,于28°C，搖床200 r /min培養(yǎng)24 h，以使畢赤酵母適應(yīng)酒糟水解液環(huán)境；搖瓶發(fā)酵將液體種子接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，搖瓶內(nèi)種子培養(yǎng)的最優(yōu)工藝為裝液量為1/5;接種量5%，溫度為28 °C，轉(zhuǎn)速為180 r/min，發(fā)酵48 h結(jié)束，制得含木糖醇的發(fā)酵液；分別準(zhǔn)確稱取木糖醇標(biāo)準(zhǔn)品O. 05,0. 2,0. 4,0. 6,0. 8、I g加入100 mL容量瓶中，用超純水溶解并定容至100 ml，制成木糖醇標(biāo)準(zhǔn)溶液，濃度分別為O. 5、2、4、6、8、10 g/L,同時(shí)設(shè)空白對照。上高效液相色譜儀測定，得出保留時(shí)間和色譜峰面積，計(jì)算木糖醇的含量。
取最佳條件下所獲得的發(fā)酵液以及木糖醇標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行高效液相色譜分析，色譜條件Thermo-NH2柱；柱溫常溫；流動相乙腈7jC =85 :15 ;流速lmL/min ;示差折光檢測器檢測，進(jìn)樣量為20μ 。
圖1、圖2分別是木糖醇標(biāo)準(zhǔn)品和最佳發(fā)酵條件下的發(fā)酵液的高效液相色譜圖，橫坐標(biāo)為保留時(shí)間，縱坐標(biāo)為色譜峰信號，圖1中標(biāo)記的a峰就是在高效液相色譜所檢測到木糖醇標(biāo)準(zhǔn)品的色譜峰，保留時(shí)間在8 min左右。通過保留時(shí)間定性確定圖2中標(biāo)記的b峰為最佳發(fā)酵條件下發(fā)酵液中所含木糖醇色譜峰。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出最佳發(fā)酵條件下所含木糖醇含量。表I為最佳條件的測定結(jié)果。
表I最佳條件的測定結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種季也蒙畢赤酵母發(fā)酵酒糟水解液生產(chǎn)木糖醇的方法，其特征在于包括以下步驟(1)制備酒糟水解液將烘干后的酒糟粉碎至粒徑40目，按1:5的比例(w/v)與0.1%的NaOH溶液混合，攪拌下加熱煮沸I h，冷卻后用濾布過濾，棄去濾液，用清水洗滌濾渣，再將濾渣與1000 mL水共煮I h，過濾，除去灰分后的濾渣留待下步水解；采用由1%HC1和1% H3PO4所組成的混合酸水解酒糟，水解溫度100°C，固液比1:10(w/v)，水解2 h ;水解液85°C濃縮至木糖含量40 g/L，再以1:10的比例(w/v)加入活性炭脫色；用石灰乳中和至pH 5.0，抽濾去除Ca3(PO4)2 沉淀后，所得水解液于4°C冷藏備用；(2)培養(yǎng)基配制YPD培養(yǎng)基配制YPD斜面培養(yǎng)基，用于菌種的活化；種子培養(yǎng)基含木糖20g/ L的原始酒糟水解液lOOmL，酵母膏10 g/L，蛋白胨20 g/L, MgSO4 · 7H20 O. 2 g/L, KH2PO4 5g/L, ρΗ5· 5，110°C滅菌 .20 min ；發(fā)酵培養(yǎng)基含木糖40g/L的90mL濃縮酒糟水解液中，補(bǔ)加10 mL有機(jī)氮源溶液，有機(jī)氮源溶液為酵母膏10g/L及蛋白胨20g/L ;起始pH5. 0,110°C滅菌20 min ；(3)木糖醇發(fā)酵斜面培養(yǎng)將季也蒙畢赤酵母菌種接種于YPD試管斜面上；液體種子培養(yǎng)取斜面菌種I環(huán)，接入液體種子培養(yǎng)基中，250mL三角瓶裝種子培養(yǎng)基液量50 mL,于28°C，搖床200 r /min培養(yǎng)24 h，以使畢赤酵母適應(yīng)酒糟水解液環(huán)境；搖瓶發(fā)酵將液體種子接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，搖瓶培養(yǎng)的最優(yōu)工藝為裝液量為1/5 ； 接種量5%，溫度為28 °C，轉(zhuǎn)速為180 r/min，發(fā)酵48 h結(jié)束，制得含木糖醇的發(fā)酵液；用高效液相色譜儀測定，得出保留時(shí)間和色譜峰面積，測得木糖醇的含量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的季也蒙畢赤酵母發(fā)酵酒糟水解液生產(chǎn)木糖醇的方法,其特征在于所述的采用高效液相色譜儀測定時(shí)色譜條件為=Thermo-NH2柱；柱溫常溫；流動相 乙腈水=85 15 ;流速lmL/min ;示差折光檢測器檢測,進(jìn)樣量為20μ 。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種季也蒙畢赤酵母發(fā)酵酒糟水解液生產(chǎn)木糖醇的方法。主要解決了現(xiàn)有木糖醇生產(chǎn)成本高、污染嚴(yán)重的問題。包括以下步驟(1)制備酒糟水解液；(2)培養(yǎng)基配制；(3)木糖醇發(fā)酵搖瓶發(fā)酵將液體種子接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，搖瓶培養(yǎng)的最優(yōu)工藝為裝液量為1/5；接種量5%，溫度為28℃，轉(zhuǎn)速為180r/min，發(fā)酵48h結(jié)束，制得含木糖醇的發(fā)酵液；用高效液相色譜儀測定，木糖醇發(fā)酵液中木糖醇的濃度為9.016g/L，色譜分離純化后含量可達(dá)95%。該季也蒙畢赤酵母發(fā)酵酒糟水解液生產(chǎn)木糖醇的方法，工藝條件溫和、能耗低、環(huán)境污染低、產(chǎn)品質(zhì)量更加安全可靠，提高了農(nóng)副產(chǎn)品廢棄物酒糟的使用效率。
文檔編號C12R1/84GK102994575SQ201210551958
公開日2013年3月27日 申請日期2012年12月18日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月18日
發(fā)明者張麗媛, 姚笛, 王穎, 李秀波, 胡亞光 申請人:黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)