專利名稱：一種銀杏酚酸的生物降解方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明旨在建立一種漆酶生物降解銀杏酚酸的方法，涉及到酶工程及食品領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
銀杏葉提取物(EGB)的主要成分為黃酮和內(nèi)酯類化合物，具有抗氧化、抗血小板激活因子(PAF)作用和拮抗PAF特異性受體作用。大量的藥理分析和臨床實(shí)驗(yàn)證實(shí)，銀杏葉提取物對(duì)冠心病、高血壓、心絞痛、動(dòng)脈硬化、腦功能減退、老年性癡呆、老年性記憶減退、衰老等與心腦血管循環(huán)有關(guān)的疾病都有顯著的預(yù)防和治療效果。銀杏葉提取物廣泛用于醫(yī)藥、保健品、食品與化妝品中，德、法等國(guó)每年從東亞幾個(gè)國(guó)家(主要是韓國(guó)、中國(guó))大量進(jìn)口銀杏葉，作為制藥原料，成品銷售全世界。但銀杏酚酸存在于銀杏外種皮、銀杏葉和銀杏果中，在外種皮中含量最高。其結(jié)構(gòu)可看作是水楊酸分子在苯環(huán)C6位上有較長(zhǎng)側(cè)鏈的系列化合物，該長(zhǎng)鏈分烷基和烯基兩大類，一般由13-17個(gè)碳原子組成，屬細(xì)胞毒素，可能與誘導(dǎo)機(jī)體突變和致癌有關(guān)，能引起皮膚、粘膜等處的過敏性炎癥反應(yīng)。因此，銀杏酚酸(Ginkgolic acids)是銀杏葉提取物中關(guān)鍵的限量指標(biāo)。但在提取銀杏葉黃酮和內(nèi)酯類化合物等活性物質(zhì)過程中，銀杏酚酸也會(huì)同時(shí)被浸提出來。其含量隨提取工藝、純化工藝不同而不同。但國(guó)內(nèi)絕大部分銀杏葉提取物中銀杏酚酸嚴(yán)重超標(biāo)，嚴(yán)重危害著人們的健康。目前，國(guó)際上對(duì)銀杏葉提取物中銀杏酚酸含量的嚴(yán)格控制，促進(jìn)了人們對(duì)選擇性脫除銀杏酚酸類物質(zhì)的研究力度。目前，所報(bào)導(dǎo)的方法主要是改進(jìn)提取工藝、強(qiáng)化提純環(huán)節(jié)。無疑降低了活性物質(zhì)的得率，增加了制備成本。漆酶是一種含銅的多酚氧化酶，該酶在白腐菌中普遍存在，少數(shù)低等真菌和植物中也產(chǎn)生，多為分泌型糖蛋白。由于漆酶是一種氧化還原酶，其作用主要是催化氧化還原反應(yīng)，能夠催化很多酚型化合物的氧化反應(yīng)，但由于其氧化還原電勢(shì)較低，對(duì)非酚類結(jié)構(gòu)化合物卻不能夠直接氧化降解，或?qū)υS多酚型化合物降解效率不高。若在某些小分子氧化還原介質(zhì)幫助下，漆酶作用的底物范圍可進(jìn)一步擴(kuò)大，能夠氧化非酚型的有機(jī)化合物，也能夠顯著地提高酚型化合物的降解效率。漆酶氧化還原介質(zhì)系統(tǒng)(LMS)是指漆酶在介體和氧的存在下進(jìn)行生物催化的過程。介體在酶的作用下會(huì)形成活性高且有一定穩(wěn)定性的中間體，這些活性中間體能從氧分子中獲得電子傳遞給底物，從而使底物降解。漆酶/氧化還原介質(zhì)系統(tǒng)作為一種具有很大潛在應(yīng)用價(jià)值的體系越來越受到國(guó)內(nèi)外的關(guān)注。鑒于國(guó)內(nèi)絕大部分銀杏葉提取物中銀杏酚酸嚴(yán)重超標(biāo)，嚴(yán)重危害著人們的健康。目前，所報(bào)導(dǎo)的方法主要是改進(jìn)提取工藝、強(qiáng)化提純環(huán)節(jié)。不僅降低了活性物質(zhì)的得率，增加了制備成本，而且效果不夠明顯，難以達(dá)到國(guó)際上對(duì)銀杏葉提取物中銀杏酚酸含量的限量標(biāo)準(zhǔn)。且到目前為止，利用漆酶或漆酶介質(zhì)系統(tǒng)對(duì)銀杏酚酸進(jìn)行生物降解在國(guó)內(nèi)外還未見研究報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
解決的技術(shù)問題
本發(fā)明的目的是建立一種生物降解銀杏酚酸的方法，旨在將一些銀杏制品在經(jīng)過漆酶降解后有效地除去銀杏酚酸。技術(shù)方案一種銀杏酚酸的生物降解方法，利用漆酶LacC，降解體系中漆酶LacC的濃度為
0.004U/mL-0. 006U/mL,降解體系的pH4. 0-6. 0，降解溫度為45°C 60°C，降解處理時(shí)間為10 24小時(shí)。降解體系中添加有終濃度0.1 ImM的2，2’-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)U-羥基苯并三唑(HOBT)、紫脲酸(VA)或愈創(chuàng)木酚。所述漆酶LacC由下述方法制得培養(yǎng)栓菌(Trametes versicolor),培養(yǎng)基為麩皮20g/L,葡萄糖5g/L,酒石酸銨120mmol/L, 200mmol/L pH 5. 0朽1檬酸緩沖液，Immol/L愈創(chuàng)木酚，0.1mL Tween 80，0. 3mmol/L Cu2+，培養(yǎng)條件為28°C培養(yǎng)5d ;將IL培養(yǎng)好發(fā)酵液置于IOOOOrpm的冷凍離心機(jī)中4°C下離心IOmin收集上清液即為漆酶粗酶液；然后在上清液中加入終濃度為80%wt 的硫酸銨，在4°C下放置24h后置于IOOOOrpm的冷凍離心機(jī)中4°C下離心30min,沉淀用20mM pH 7. 5Tris_HCl buffer溶解透析；透析處理過的酶液進(jìn)行 DEAES印harose CL-6B 離子交換柱層析，采用平衡液20mM pH 7. 5Tris_HCl buffer,洗脫緩沖液20mM pH 7. OTris-HCl buffer，NaCl的濃度梯度為0-0. 6mol/L，洗脫體積為800mL，洗脫速度1. 5mL/min，每4mL收集一管檢測(cè)漆酶活性，通過蛋白檢測(cè)儀檢測(cè)到三個(gè)蛋白峰，最后一個(gè)峰所收集的為漆酶LacC。所述漆酶LacC也可以由下述方法制得(I)栓菌(Trametes versicolor)的培養(yǎng)培養(yǎng)基為PDA :葡萄糖20g/L,馬鈴薯汁20%wt,接種新鮮的栓菌菌絲，28°C下180rpm培養(yǎng)3_4天過濾收集菌絲體；(2)栓菌總RNA的提取取收集的栓菌的菌絲體用PBS緩沖溶液清洗后，在液氮下研磨菌絲體至粉末狀，收集到2mL離心管中,加入ImL Trizol后劇烈震蕩，4°C下12000g離心IOmin后轉(zhuǎn)移上清液至2mL離心管，加入200 ii L氯仿震蕩15s混勻后30°C下孵育2-3min，4°C下12000g離心IOmin取上層清夜，加入上清液0. 8倍體積的異丙醇混勻后4°C下12000g離心lOmin，去凈上清后用75%wt乙醇水溶液清洗2次后4°C下7500g離心5min得到沉淀，使其自然干燥后，加入DEPC水溶解RNA沉淀，作為模板RNA，-20°C下保存；(3)栓菌cDNA的合成以栓菌總RNA為模板，利用逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈在微量離心管中配制下列模板RNA/Primer反應(yīng)液50 u M Oligo dTIuL,IOmM dNTP Mixture IuL,總RNAlug,DEPC-H2O7uL；混勻后6515C下保溫5min后冰上放置Imin ；在上述微量離心管中配制下列cDNA合成反應(yīng)液上述RNA/Primer 混合液10 u L,5 X PrimeScript Buffer4 u L,40U/ u L RNase Inhibiter0. 5 u L,200U/ u L PrimeScript RTase IuLRNase free H2O4. 5 U L;
上述反應(yīng)液混勻后在50°C下保溫lh，70°C下保溫15min后冰上冷卻，得到的反應(yīng)液立即用于cDNA第二鏈的合成；(4)栓菌基因的克隆設(shè)計(jì)LacC引物，載體為pPICZaB :P9:GGGGAATTCATGGGCAAGTTTCACTCTTTTGTGAA ；P10:GGGTCTAGATCAGAGGTCGGACGAGTCCAAA ；基因LacC的克隆利用引物P9和P10，反應(yīng)條件為94 °C，5min ;暫停計(jì)時(shí)，加ExTaq 聚合酶，加 40iiL 石蠟油密封；30 次循環(huán)(94°C，30s ；58°C,30s ；72°C,90s) ；72°C,IOmin ;反應(yīng)停止，4°C保溫；得到基因LacC，用EcoR I，Xba I酶切，同時(shí)表達(dá)載體也用相同的酶分別酶切，基因LacC和酶切后的載體分別連接過夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，得到重組質(zhì)粒pPICZa B-LacC；(5)重組漆酶LacC的制備將重組質(zhì)粒pPICZ a B-LacC線性化后，電轉(zhuǎn)化畢赤酵母得到重組菌，將重組酵母菌劃線于YPD平板上進(jìn)行活化，28°C培養(yǎng)2天，至長(zhǎng)出單菌落后接種于IOmL BMGY液體培養(yǎng)基中，于30°C，200r/min搖床培養(yǎng)48h，OD600達(dá)2 6，3000rpm離心5min收集菌體，棄上清，用無菌純凈水洗滌菌體f 2次；將菌體用BMMY誘導(dǎo)培養(yǎng)基稀釋至0D_=1,用4層紗布代替棉花塞,于28°C, 180r/min搖床培養(yǎng),每天補(bǔ)加甲醇至終濃度為0. 6%(V/V);將培養(yǎng)好的培養(yǎng)基置于IOOOOrpm的冷凍離心機(jī)中4°C下離心IOmin收集上清液即為漆酶粗酶液；首先超濾裝置對(duì)漆酶粗酶液濃縮；然后在濃縮液中加入終濃度為80%wt的硫酸銨，在4°C下放置24h后置于IOOOOrpm的冷凍離心機(jī)中4°C下離心30min，沉淀用20mM pH 7. OTris-HCl buffer溶解透析；透析處理過的酶液進(jìn)行DEAE Sepharose CL-6B離子交換柱層析，采用平衡液20mM pH 7. OTris-HCl buffer，洗脫緩沖液含0. 4、
0.6、1. OM 的 20mM pH 7. OTris-HCl buffer，洗脫速度0. 5mL/min，每 6min 收集一管，檢測(cè)漆酶活性，得到重組漆酶LacC。所述降解溫度為50°C。所述2，2’ -聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽的濃度為0. 6mM。降解反應(yīng)時(shí)間為12h。漆酶LacC在降解銀杏酚酸中的應(yīng)用。具體方案內(nèi)容為本發(fā)明所建立的一種降解銀杏酚酸的方法是用漆酶對(duì)其進(jìn)行生物降解，為了提高降解效率，加入介體，構(gòu)成漆酶-介體系統(tǒng)，可以高效的降解銀杏酚酸。本發(fā)明所采用的降解體系為銀杏酚酸+IOOmM的pH4. 5檸檬酸緩沖液+漆酶+介體，共5mL。反應(yīng)溫度50°C，水浴搖床轉(zhuǎn)速lOOrmp，反應(yīng)時(shí)間12小時(shí)。降解后的反應(yīng)體系用IOmL的正己燒萃取,共萃取三次,每次吸取上清ImL于小試管中，合并三次萃取液(3mL)用N2吹干，加入ImL的色譜甲醇，過0. 45 ii m有機(jī)濾膜后做HPLC。HPLC的條件為Agilent1260，Eclipse XDB-C18 色譜柱(4. 6 X 250mm，5 y m)，流動(dòng)相為 V (甲醇)V (3% 冰醋酸)=92:8，柱溫為40°C，檢測(cè)波長(zhǎng)為310nm，流速為1. 5mL/min，進(jìn)樣量20 y L，運(yùn)行時(shí)間lOmin。本發(fā)明所采用的漆酶酶活的測(cè)定方法為用紫外分光光度計(jì)測(cè)量，檢測(cè)波長(zhǎng)為420nm，緩沖液為IOOmM的pH4. 5的檸檬酸緩沖液，反應(yīng)體系為1980 y L緩沖液+lmLlmMABTS+20 u L漆酶，緩沖液和ABTS加入后先在50°C水浴鍋中預(yù)熱5min，加酶液后計(jì)時(shí)3min (包括加酶后在水浴鍋中振蕩30s)，每分鐘記下A值，計(jì)算公式為漆酶酶活(U/L) = It(A3-A1)/2] X5000/12} X 稀釋倍數(shù)。
有益效果單純的用漆酶對(duì)銀杏酚酸進(jìn)行降解，其降解效率不到30%，加入介體物質(zhì)后，特別是加入ABTS后，其降解效率最高可達(dá)100%。


圖1為不同重組漆酶同工酶降解銀杏酚酸的結(jié)果；圖2為加入不同的小分子介體對(duì)漆酶LacC降解銀杏酚酸的影響；圖3為不同的ABTS濃度對(duì)漆酶LacC降解銀杏酚酸的影響；圖4為不同的酶用量對(duì)漆酶LacC降解銀杏酚酸的影響；圖5為不同pH值對(duì)漆酶LacC降解銀杏酚酸的影響；圖6為溫度對(duì)漆酶LacC降解銀杏酚酸的影響。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)說明，所列實(shí)施例僅在于說明本發(fā)明而不限制本發(fā)明。實(shí)施例1漆酶的制備1.1 雜色云芝(Coriolus versicolor)重組漆酶 Lccl 和 Lcc2 的制備1.1.1 雜色云芝(Cori olus versicolor)的培養(yǎng)雜色云芝(Coriolus versicolor,該微生物可以從自然界中篩選獲得，也可以從商業(yè)途徑購買得到(例如可以購自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心))的培養(yǎng)基為PDA :葡萄糖20g/L,馬鈴薯汁20%wt,接種新鮮的雜色云芝菌絲,28°C下180rpm培養(yǎng)3_4天過濾收集菌絲體。1.1. 2 雜色云芝(Coriolus versicolor)總 RNA 的提取取收集的雜色云芝(Coriolus versicolor)的菌絲體用PBS緩沖溶液清洗一次后，在液氮下研磨菌絲體至粉末狀，收集到2mL離心管中，加入ImL Trizol后劇烈震蕩，4°C下12000g離心IOmin后轉(zhuǎn)移上清液至2mL離心管，加入200 u L氯仿震蕩15s混勻后30°C下孵育2-3min,4°C下12000g離心IOmin取上層清夜,加入上清液0. 8倍體積的異丙醇混勻后4°C下12000g離心lOmin，去凈上清后用75%wt乙醇水溶液(DEPC處理過的，去除了 mRNA酶)清洗2次后4°C下7500g離心5min得到沉淀，使其自然干燥后，加入DEPC水溶解RNA沉淀，作為模板RNA，-20°C下保存。1.1. 3 雜色云芝(Coriolus versicolor) cDNA 的合成以雜色云芝(Coriolus versicolor)總RNA為模板,利用逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈(以下各逆轉(zhuǎn)錄所用試劑均來自于試劑盒“PrimeScriptTMlstStrand cDNA SynthesisKit”,購自 Takara 公司)。在微量離心管中配制下列模板RNA/Primer反應(yīng)液50 U M Oligo dTIuL,IOmM dNTP Mixture IuL,總RNAI u g,DEPC-H2O7u L ；混勻后65°C下保溫5min后冰上放置Imin
在上述微量離心管中配制下列cDNA合成反應(yīng)液上述RNA/Primer 混合液10 ii L，5XPrimeScript Buffer4 U L,40U/u L RNase Inhibiter0. 5 U L,200U/ u L PrimeScript RTase IuLRNase free H2O4. 5 U L;上述反應(yīng)液混勻后在50°C下保溫lh,70°C下保溫15min后冰上冷卻,得到的反應(yīng)液立即用于cDNA第二鏈的合成。1.1. 4 雜色云芝(Coriolus versicolor)基因的克隆根據(jù)NCBI公布的雜色云芝(Coriolus versicolor)漆酶基因序列(Lccl:HMl37002 和 Lcc2:D84235)分別設(shè) 計(jì)引物Pl :GCGGAATTCGCTATCGGGCCTGTGACC,下劃線表示 EcoR I 位點(diǎn)；P2 GGGTCTAGATTAGAGGTCGGATGAGTC,下劃線表示 Xba I 位點(diǎn)；P3 CCCATCGATAGCCATTGGGCCCGTC,下劃線表示 Cla I 位點(diǎn)；P4 CCCTCTAGATCAGAGGTCGGACGAG,下劃線表示 Xba I 位點(diǎn)?；騆ccl的克隆利用引物Pl和P2，基因Lcc2的克隆利用引物P3和P4。反應(yīng)條件為94°C，5min ;暫停計(jì)時(shí)，加Ex Taq聚合酶，加40 y L石蠟油密封；35次循環(huán)(94°C，50s ；55°C,90s ；72°C,80s) ；72°C, IOmin ;反應(yīng)停止，4°C保溫。得到基因 Lccl 和 Lcc2，分別用EcoR I，XbaI和Cla I和Xba I酶切，同時(shí)表達(dá)載體pPICZ a A也用相同的酶分別酶切，基因Lccl，Lcc2和酶切后的載體pPICZ a A分別連接過夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，得到重組質(zhì)粒pPICZa A-Lccl 和 pPICZaA_Lcc2。1.1.5重組漆酶的制備將重組質(zhì)粒pPICZ a A-Lccl線性化后，電轉(zhuǎn)化畢赤酵母得到重組菌，將重組酵母菌劃線于YPD平板上進(jìn)行活化，28°C培養(yǎng)2天，至長(zhǎng)出單菌落后接種于IOmL BMGY液體培養(yǎng)基中，于30°C，200r/min搖床培養(yǎng)48h，OD600達(dá)2 6，3000rpm離心5min收集菌體，棄上清，用無菌純凈水洗滌菌體f 2次。將菌體用BMMY誘導(dǎo)培養(yǎng)基稀釋至0D_=1，用4層紗布代替棉花塞，于28°C，180r/min搖床培養(yǎng)，每天補(bǔ)加甲醇至終濃度為0. 6%(V/V)。將培養(yǎng)好(培養(yǎng)至第13天為最佳)的培養(yǎng)基置于IOOOOrpm的冷凍離心機(jī)中4°C下離心IOmin收集上清液即為漆酶粗酶液。首先超濾裝置對(duì)漆酶粗酶液濃縮；然后在濃縮液中加入終濃度為80%wt的硫酸銨，在4°C下放置24h后置于IOOOOrpm的冷凍離心機(jī)中4°C下離心30min,沉淀用20mM Tris-HCl buffer (pH 7. 0)溶解透析；透析處理過的酶液進(jìn)行DEAE Sepharose CL-6B 離子交換柱層析,米用平衡液20mM Tris-HCl buffer (pH 7. 0),洗脫緩沖液含 0. 4,0. 6、1. OM 的 20mM Tris-HCl buffer (pH 7. 0)，洗脫速度:0. 5mL/min,每6min收集一管，檢測(cè)漆酶活性，得到重組漆酶Lccl。用上述同樣的方法，得到重組漆酶Lcc2。1. 2用原始菌栓菌(Trametes versicolor)直接培養(yǎng)發(fā)酵制備漆酶LacA和LacB和 LacC培養(yǎng)栓菌(Trametes versicolor),培養(yǎng)基為麩皮20g/L,葡萄糖5g/L,酒石酸銨 120mmol/L,朽1 樣酸緩沖液(200mmol/L, pH 5. 0), lmmol/L 愈創(chuàng)木酌 ，0.1mL Tween 80,0.3mmol/L Cu2+，培養(yǎng)條件為28°C培養(yǎng)5d。將培養(yǎng)好發(fā)酵液(IL)置于IOOOOrpm的冷凍離心機(jī)中4°C下離心IOmin收集上清液即為漆酶粗酶液。然后在上清液中加入終濃度為80%wt的硫酸銨，在4°C下放置24h后置于IOOOOrpm的冷凍離心機(jī)中4°C下離心30min，沉淀用20mMTris_HCl buffer (pH 7. 5)溶解透析；透析處理過的酶液進(jìn)行DEAE Sepharose CL-6B離子交換柱層析，采用平衡液20mM Tris-HCl buffer (pH 7. 5)，洗脫緩沖液20mMTris-HCl buffer (pH 7. 0)，NaCl 的濃度梯度為 0_0. 6mol/L，洗脫體積為 800mL，洗脫速度1. 5mL/min，每4mL收集一管檢測(cè)漆酶活性，通過蛋白檢測(cè)儀檢測(cè)到三個(gè)蛋白峰圖，分別收集三種漆酶，并命名為漆酶LacA和LacB和LacC。1. 3 檢菌 Trametes versicolor 重組漆酶 LacA、LacB 和 LacC 的制備1. 3.1 栓菌 Trametes versicolor 的培養(yǎng)栓菌Trametes versicolor該微生物可以從自然界中篩選、誘變獲得,也可以從商業(yè)途徑購買得到(例如可以購自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心)，培養(yǎng)方法同1.1.1。1. 3. 2 栓菌 Trametes versicolor 總 RNA 的提取方法同1.1. 2。ld3. 3 栓菌 Trametes versicolor cDNA 的合成方法同1.1. 3。1. 3. 4 栓菌 Trametes versicolor 基因的克隆根據(jù)NCBI 公布的檢菌Trametes versicolor 漆酶基因序列(LccA:AB212732; LccB:AB212722;LccC:AB212734)分別設(shè)計(jì)引物L(fēng)acA 引物(載體 pPICZ a B)P5:GGGGAATTCATGGGTCTGCAGCGATT ； 下劃線表示 EcoR I 位點(diǎn)P6:GGGTCTAGATCACTGGTTAGCCTCGCTCA ；下劃線表示 Xba I 位點(diǎn)LacB 引物(載體 pPICZ a C)P7:GGGGAATTCATGGGCAGGGTCTCATCTCTCTG ；P8:GGGTCTAGATTAGAGGTCGGATGAGTCAAGAGCG ；LacC 引物(載體 pPICZ a B)P9:GGGGAATTCATGGGCAAGTTTCACTCTTTTGTGAA ；P10:GGGTCTAGATCAGAGGTCGGACGAGTCCAAA ；反應(yīng)條件為94°C，5min ;暫停計(jì)時(shí)，加Ex Taq聚合酶，加40 y L石蠟油密封；30次循環(huán)(94°C，30s ;58°C，30s ;72°C，90s) ；72°C, IOmin ;反應(yīng)停止，4°C保溫。得到基因 LacA、LacB和LacC，均用EcoR I，Xba I酶切，同時(shí)表達(dá)載體也用相同的酶分別酶切，基因LacA、LacB和LacC和酶切后的載體分別連接過夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，得到重組質(zhì)粒pPICZ a B-LacA,pPICZa C-LacB 和 pPICZa B-LacC01. 3. 5重組漆酶LacA、LacB和LacC的制備方法同1.1. 5，得到重組漆酶LacA、LacB和LacC的純酶。實(shí)施例2不同重組漆酶同工酶降解銀杏酚酸的結(jié)果以0. 02%wt銀杏酚酸作為底物，在含有該底物的反應(yīng)體系中分別加入五種漆酶至0. 5U/mL ;用檸檬酸緩沖液調(diào)節(jié)pH至4. 5，控制溫度在50°C;在水浴搖床中以IOOrpm的轉(zhuǎn)速下反應(yīng)12h后檢測(cè)銀杏酚酸的殘留量。
銀杏酚酸的檢測(cè)方法如下首先對(duì)5mL的反應(yīng)體系，加入2倍體積的正己烷進(jìn)行液-液萃取，每個(gè)樣品萃取三次，以保證反應(yīng)體系中的銀杏酚酸完全萃取，靜置30min待溶液完全分層后分別取上層正己烷溶液lmL，氮吹儀吹干后用ImL甲醇溶解處理樣品。對(duì)上述反應(yīng)體系中的銀杏酹酸殘留量用HPLC進(jìn)行分析檢測(cè)。液相色譜儀為Agilent 1260,Eclipse XDB-C18 色譜柱(4. 6X250mm，5iim)，流動(dòng)相為 V (甲醇)V (3% 冰醋酸))=92:8，流速為1. 5mL/min，進(jìn)樣量20 y L，運(yùn)行時(shí)間lOmin。本發(fā)明銀杏酚酸降解率的計(jì)算公式為降解率(%) = [(初始濃度一殘留濃度)/初始濃度]X 100%。具體結(jié)果如圖1所示,在反應(yīng)進(jìn)行了 12h后五種漆酶LacA、LacB, LacC、Lccl及Lcc2對(duì)銀杏酚酸的降解率分別為15. 5%、8. 7%,27. 0%、11. 7%、4. 1%。表明單獨(dú)用這五種漆酶對(duì)銀杏酚酸進(jìn)行降解，降解效果相對(duì)較好的為漆酶LacC。實(shí)施例3研究加入不同的小分子介體對(duì)漆酶LacC降解銀杏酚酸的影響以0. 02%wt銀杏酚酸作為底物，在含有該底物的反應(yīng)體系中加入漆酶LacC至
0.5U/mL,分別加入小分子介體物質(zhì)ABTS、愈創(chuàng)木酚、HOBT及VA至ImM ;用檸檬酸緩沖液調(diào)節(jié)pH至4. 5，控制溫度在50°C;在水浴搖床中以IOOrpm的轉(zhuǎn)速下反應(yīng)12h后檢測(cè)銀杏酚酸的殘留量。具體結(jié)果如圖2所示，在反應(yīng)進(jìn)行了 12h后加入ABTS、愈創(chuàng)木酚、HOBT及VA的漆酶對(duì)銀杏酚酸的降解率分別為100%、86. 6%,54. 4%,57. 7%。表明加入小分子介體物質(zhì)后銀杏酚酸的降解效果顯著提高，加入ABTS的降解效果最好，達(dá)到100%，其次是愈創(chuàng)木酚，HOBT和VA的相對(duì)低些。實(shí)施例4研究不同的酶用量對(duì)漆酶LacC降解銀杏酚酸的影響以0. 02%wt銀杏酚酸作為底物，采用pH 4. 5的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，添加ABTS 至濃度為 0. 2mM,分別添加漆酶 LacC 至濃度為 0. 002U/mL、0. 004U/mL、0. 006U/mL、
0.008U/mL、0. 01U/mL、0. 025U/mL、0. 05U/mL、0. 075U/mL、0. lU/mL、0. 125U/mL,控制溫度在50°C，在水浴搖床中以IOOrpm的轉(zhuǎn)速下反應(yīng)12h后檢測(cè)銀杏酚酸的殘留量。具體試驗(yàn)結(jié)果如圖3所示可得上述濃度的酶量對(duì)應(yīng)的降解率分別為49. 4%,58. 1%、63. 4%,63. 5%,64. 5%、64. 0%、61. 3%,59. 2%,59. 9%,57. 7%。酶用量在 0. 004U/mL_0. 006U/mL 比較適宜。實(shí)施例5研究pH值對(duì)漆酶LacC降解銀杏酚酸的影響以0. 02%wt銀杏酚酸作為底物，添加ABTS至濃度為0. 2mM,添加漆酶至濃度為
0.01U/mL,用檸檬酸緩沖液調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的pH分別至3. 0,4. 0,4. 5,5. 0,5. 5,6. 0，控制溫度在50°C，在水浴搖床中以IOOrpm的轉(zhuǎn)速下反應(yīng)12h后檢測(cè)銀杏酚酸的殘留量。具體試驗(yàn)結(jié)果如圖4所示反應(yīng)在pH4. 0-6. 0都有很好的降解效果。實(shí)施例6研究溫度對(duì)漆酶LacC降解銀杏酚酸的影響以0. 02%wt銀杏酚酸作為底物，采用pH 4. 5的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，添加ABTS至濃度為0. 2mM,添加漆酶至濃度為0. 01U/mL,控制溫度分別為30°C、35°C、40°C、45°C、50°C、55°C、60°C，在水浴搖床中以IOOrpm的轉(zhuǎn)速下反應(yīng)12h后檢測(cè)銀杏酚酸的濃度。具體試驗(yàn)結(jié)果如圖5所示漆酶在45°C 60°C的條件下對(duì)銀杏酚酸都有較好的降解效果，其中在50°C條件下銀杏酚酸的降解效率最好。實(shí)施例7研究不同的ABTS濃度對(duì)漆酶LacC降解銀杏酚酸的影響以0. 02%wt銀杏酚酸作為底物，采用pH 4. 5的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，添加漆酶LacC至濃度為0. 5U/mL，分別添加ABTS至濃度為0. 1,0. 2,0. 3,0. 4,0. 5,0. 6mM，控制溫度在50°C，在水浴搖床中以IOOrpm的轉(zhuǎn)速下反應(yīng)12h后檢測(cè)銀杏酚酸的殘留量。具體試驗(yàn)結(jié)果如圖6所示ABTS的濃度為0.1 0. 6mM時(shí)銀杏酚酸的降解率分別為55. 3%,58. 7%、73. 2%,88. 1%、96. 8%,99. 7%，可見隨著介體ABTS濃度的增加，銀杏酚酸降解率隨之增加，
0.6mM時(shí)就有近乎降解完全。
權(quán)利要求
1.一種銀杏酚酸的生物降解方法，其特征在于利用漆酶LacC，降解體系中漆酶LacC的濃度為O. 004U/mL-0. 006U/mL,降解體系的pH4. 0-6. O,降解溫度為45°C 60°C，降解處理時(shí)間為10 24小時(shí)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的銀杏酚酸的生物降解方法，其特征在于降解體系中添加有終濃度O.1 ImM的2，2’-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑_6_磺酸)二銨鹽(ABTS)、1-羥基苯并三唑(HOBT)、紫脲酸(VA)或愈創(chuàng)木酚。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的銀杏酚酸的生物降解方法，其特征在于所述漆酶LacC由下述方法制得培養(yǎng)栓菌(Trametes versicolor),培養(yǎng)基為麩皮20g/L,葡萄糖5g/L,酒石酸銨 120mmol/L, 200mmol/L pH 5. O 朽1 樣酸緩沖液，lmmol/L 愈創(chuàng)木酌·, O.1mL Tween.80,0. 3mmol/LCu2+，培養(yǎng)條件為28°C培養(yǎng)5d ;將IL培養(yǎng)好發(fā)酵液置于IOOOOrpm的冷凍離心機(jī)中4°C下離心IOmin收集上清液即為漆酶粗酶液；然后在上清液中加入終濃度為.80%wt的硫酸銨，在4°C下放置24h后置于IOOOOrpm的冷凍離心機(jī)中4°C下離心30min，沉淀用20mM pH 7. 5Tris_HCl buffer溶解透析；透析處理過的酶液進(jìn)行DEAE Sepharose CL-6B離子交換柱層析，采用平衡液20mM pH 7. 5Tris_HCl buffer，洗脫緩沖液20mMpH 7. OTris-HCl buffer, NaCl的濃度梯度為0-0. 6mol/L，洗脫體積為800mL，洗脫速度.1.5mL/min，每4mL收集一管檢測(cè)漆酶活性，通過蛋白檢測(cè)儀檢測(cè)到三個(gè)蛋白峰，最后一個(gè)峰所收集的為漆酶LacC。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的銀杏酚酸的生物降解方法，其特征在于所述漆酶LacC也可以由下述方法制得 (1)栓菌(Trametesversicolor)的培養(yǎng)培養(yǎng)基為PDA :葡萄糖20g/L,馬鈴薯汁.20%wt,接種新鮮的栓菌菌絲，28°C下180rpm培養(yǎng)3_4天過濾收集菌絲體； (2)栓菌總RNA的提取取收集的栓菌的菌絲體用PBS緩沖溶液清洗后，在液氮下研磨菌絲體至粉末狀，收集到2mL離心管中，加入ImL Trizol后劇烈震蕩，4°C下12000g離心IOmin后轉(zhuǎn)移上清液至2mL離心管，加入200 μ L氯仿震蕩15s混勻后30°C下孵育2_3min，.4°C下12000g離心IOmin取上層清夜，加入上清液0. 8倍體積的異丙醇混勻后4°C下12000g離心lOmin，去凈上清后用75%wt乙醇水溶液清洗2次后4°C下7500g離心5min得到沉淀，使其自然干燥后，加入DEPC水溶解RNA沉淀，作為模板RNA，-20°C下保存； (3)栓菌cDNA的合成以栓菌總RNA為模板，利用逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈 在微量離心管中配制下列模板RNA/Primer反應(yīng)液 .50 μ M Oligo dTI μ L, IOmM dNTP Mixture I μ L, 總 RNAI μ g， DEPC-H2O7 μ L ; 混勻后65°C下保溫5min后冰上放置Imin ； 在上述微量離心管中配制下列cDNA合成反應(yīng)液 上述RNA/Primer混合液IOuL, .5XPrimeScript Buffer4 μ L, .40U/μ L RNase Inhibiter0. 5 μ L, .200U/ μ L PrimeScript RTase IuLRNase free H2O4. 5 μ L; 上述反應(yīng)液混勻后在50°C下保溫lh，70°C下保溫15min后冰上冷卻，得到的反應(yīng)液立即用于cDNA第二鏈的合成； (4)栓菌基因的克隆設(shè)計(jì)LacC引物，載體為pPICZaB:P9:GGGGAATTCATGGGCAAGTTTCACTCTTTTGTGAA ；PlO:GGGTCTAGATCAGAGGTCGGACGAGTCCAAA ； 基因LacC的克隆利用引物P9和P10，反應(yīng)條件為94°C，5min ;暫停計(jì)時(shí)，加Ex Taq聚合酶，加 40 μ L 石蠟油密封;30 次循環(huán)(94°C，30s ；58°C,30s ；72°C,90s)；72°C, IOmin ;反應(yīng)停止，4°C保溫；得到基因LacC，用EcoR I，XbaI酶切，同時(shí)表達(dá)載體也用相同的酶分別酶切，基因LacC和酶切后的載體分別連接過夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，得到重組質(zhì)粒pPICZ a B-LacC ； (5)重組漆酶LacC的制備將重組質(zhì)粒pPICZa B-LacC線性化后，電轉(zhuǎn)化畢赤酵母得到重組菌，將重組酵母菌劃線于YPD平板上進(jìn)行活化，28°C培養(yǎng)2天，至長(zhǎng)出單菌落后接種于IOmL BMGY液體培養(yǎng)基中，于30°C，200r/min搖床培養(yǎng)48h，OD600達(dá)2 6，3000rpm離心5min收集菌體，棄上清，用無菌純凈水洗滌菌體f 2次；將菌體用BMMY誘導(dǎo)培養(yǎng)基稀釋至0D_=1,用4層紗布代替棉花塞,于28°C, 180r/min搖床培養(yǎng),每天補(bǔ)加甲醇至終濃度為O. 6%(V/V);將培養(yǎng)好的培養(yǎng)基置于IOOOOrpm的冷凍離心機(jī)中4°C下離心IOmin收集上清液即為漆酶粗酶液；首先超濾裝置對(duì)漆酶粗酶液濃縮；然后在濃縮液中加入終濃度為80%wt的硫酸銨，在4°C下放置24h后置于IOOOOrpm的冷凍離心機(jī)中4°C下離心30min，沉淀用20mM pH 7. OTris-HCl buffer溶解透析；透析處理過的酶液進(jìn)行DEAE Sepharose CL-6B離子交換柱層析，采用平衡液20mM pH 7. OTris-HCl buffer，洗脫緩沖液含O. 4、O. 6、1. OM 的 20mM pH 7. OTris-HCl buffer，洗脫速度0. 5mL/min，每 6min 收集一管，檢測(cè)漆酶活性，得到重組漆酶LacC。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的銀杏酚酸的生物降解方法，其特征在于所述降解溫度為50。。。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的銀杏酚酸的生物降解方法，其特征在于所述2，2’_聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽的濃度為O. 6mM。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的銀杏酚酸的生物降解方法，其特征在于所述降解反應(yīng)時(shí)間為12h。
8.漆酶LacC在降解銀杏酚酸中的應(yīng)用。
全文摘要
一種銀杏酚酸的生物降解方法，利用漆酶LacC，按比例，當(dāng)降解體系中含有一定濃度的銀杏酚酸，添加漆酶LacC的濃度為0.004U/mL-0.006U/mL，降解體系的pH4.0-6.0，降解溫度為45℃～60℃，降解處理時(shí)間為10～24小時(shí)。單純的用漆酶對(duì)銀杏酚酸進(jìn)行降解，其降解效率不到30%，加入介體物質(zhì)后，特別是加入ABTS后，其降解效率最高可達(dá)100%。
文檔編號(hào)A23L1/30GK103053876SQ201210552048
公開日2013年4月24日 申請(qǐng)日期2012年12月17日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月17日
發(fā)明者趙林果, 孫偉, 曹福亮, 姜艷, 汪貴斌, 鄭璐 申請(qǐng)人:南京林業(yè)大學(xué)