專(zhuān)利名稱(chēng)：6條寡核苷酸序列及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及溶藻弧菌的識(shí)別檢測(cè)，尤其是涉及6條可用于溶藻弧菌識(shí)別檢測(cè)的寡核苷酸序列及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
在養(yǎng)殖業(yè)中，每年約有10%的水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物死于感染性病害，其中弧菌感染導(dǎo)致的疾病占了相當(dāng)大的比重。雖然化學(xué)藥品和抗生素可控制其感染，但是藥物防治常會(huì)產(chǎn)生不良后果，如在水產(chǎn)動(dòng)物體內(nèi)積累、殘留，容易產(chǎn)生耐藥菌株和易污染環(huán)境等問(wèn)題，因此建立病原弧菌的快速檢測(cè)技術(shù)，以提早防治病害的發(fā)生和流行仍是目前的主要手段。目前，弧菌的檢測(cè)方法主要是根據(jù)伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)，通過(guò)對(duì)微生物的生理生化特征檢測(cè)進(jìn)行鑒定，由于需要測(cè)試的項(xiàng)目較多，因此該方法工作量較大、操作較繁瑣。16SRNA的分子生物學(xué)方法雖有較高的準(zhǔn)確性，但需要提取病原菌的16SRNA，手續(xù)較繁瑣，且對(duì)檢測(cè)設(shè)備有一定要求，難以實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)的快速檢測(cè)需要；免疫學(xué)方法制備的抗血清雖能實(shí)現(xiàn)快速檢測(cè)，但由于制備的抗血清為多克隆抗體，實(shí)際應(yīng)用中可能會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性或假陰性，即使采用單克隆抗體。由于制備技術(shù)要求較高、周期較長(zhǎng)，因此其應(yīng)用受到限制。指數(shù)富集配體進(jìn)化技術(shù)(SystemicEvolution of Ligands by ExponentialEnrichment),簡(jiǎn)稱(chēng)SELEX技術(shù),是近年來(lái)新發(fā)展起來(lái)的一種系統(tǒng)篩選技術(shù)。它利用寡核苷酸分子可在空間形成多種多樣的三維結(jié)構(gòu)，通過(guò)構(gòu)建的隨機(jī)寡核苷酸庫(kù)，從中篩選出與目標(biāo)靶分子有特異識(shí)別作用的高親和力的寡核苷酸分子一適配子，其分子識(shí)別能力可達(dá)到甚至超過(guò)了單克隆抗體的水平，而制備技術(shù)則比單克隆抗體簡(jiǎn)單、快速。運(yùn)用該技術(shù)目前已篩選出腫瘤細(xì)胞、炭疽桿菌等的適配子，可用于腫瘤細(xì)胞和炭疽桿菌的檢測(cè)、識(shí)別。SELEX技術(shù)的出現(xiàn)為微 生物的快速檢測(cè)提供了新的研究思路，其應(yīng)用也將越來(lái)越廣泛。在SELEX篩選中，以滅活菌為靶目標(biāo)進(jìn)行篩選，不僅具有較好的安全性，而且使目標(biāo)菌的形態(tài)相對(duì)穩(wěn)定和固定，從而有效提高了篩選的效率和效果。同時(shí)，以滅活菌為靶目標(biāo)，還能有效避免環(huán)境因子對(duì)活菌的影響，使篩選的穩(wěn)定性得到較好的改善。因此，開(kāi)展以滅活菌為靶目標(biāo)的SELEX篩選，具有重要意義。溶藻弧菌是一種廣泛分布于世界各地海水及河口處的一種病原微生物，其數(shù)量居海水類(lèi)弧菌之首，存在于多種海洋動(dòng)物中，是魚(yú)、蝦、貝等海水養(yǎng)殖動(dòng)物的條件致病菌，并可引起人食物中毒、耳部發(fā)炎等疾病，對(duì)公共衛(wèi)生安全構(gòu)成十分嚴(yán)重的威脅。因此，運(yùn)用SELEX技術(shù)篩選滅活溶藻弧菌適配子，并將其應(yīng)用于滅活溶藻弧菌的識(shí)別鑒定，能大大提高溶藻弧菌檢測(cè)的靈敏度和特異性，成為本發(fā)明的重點(diǎn)。本申請(qǐng)人在中國(guó)專(zhuān)利201110090419. 7中已公開(kāi)了 4條適配子序列，分別如下8 號(hào)適配子5' -TCAGTCGCTT CGCCGTCTCC TTCAGAGTCG TGGAGAGGGTGAACGGAGGGGGGAAACAGC ACAAGAGGGA GACCCCAGAG GG-3,10 號(hào)適配子5' -TCAGTCGCTT CGCCGTCTCC TTCAGGTGGC GAGTTGCGAAGGACTGTGTCGAGTGTTGGC ACAAGAGGGA GACCCCAGAG GG-3,
37 號(hào)適配子5' -TCAGTCGCTT CGCCGTCTCC TTCAGCGGGA TGAGGGAGTAGGAGGGCCACAGTGGACTGC ACAAGAGGGA GACCCCAGAG GG-3,46 號(hào)適配子5' -TCAGTCGCTT CGCCGTCTCC TTCCAGTCGC TTCGCCGCCTCCTTCCCTCTGGGGTCTC-3'。本申請(qǐng)人在中國(guó)專(zhuān)利201110259244.8中已公開(kāi)了 3條適配子序列，分別如下序列1:5, -GAGACCCCAG AGGGAAGGAG GCGGCGAAGC GACTGGAAGGAGACGGCGAAGCGACTGA-3'；序列2:5' -TCAGTCGCTT CGCCGTCTCC TTCCAGTCGC TTCGCCGCCTCCTTCCCTCTGGGGTCTCCC TCTTGTGC-3'；序列3:5' -GCACAAGAGG GAGACCCCAG AGGGAAGGAG GCGGCGAAGCGACTGGAAGGAGACGGCGAA GCGACTGA-3'。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供可用于滅活溶藻弧菌識(shí)別檢測(cè)的6條寡核苷酸序列及其制備方法。該寡核苷酸序列不僅具有檢測(cè)快速、操作簡(jiǎn)單、穩(wěn)定性高于抗體等特點(diǎn)，而且制備方法容易、制備周期較短。本發(fā)明的另一目的在于提供6條寡核苷酸序列的應(yīng)用。所述6 條寡核苷酸序列，包括 SEQ ID No.1、SEQ ID No. 2、SEQ ID No. 3、SEQ IDNo. 4,SEQ ID No. 5和SEQ ID No. 6共6條寡核苷酸序列，且采用其中一條就能完成滅活溶藻弧菌的識(shí)別檢測(cè)；

所述SEQ ID No.1可記為“#7適配子”，所述SEQ ID No. 2可記為“#14適配子”，所述SEQ ID No. 3可記為“#23適配子”，所述SEQ ID No. 4可記為“#4適配子”，所述SEQ IDNo. 5可記為“#8適配子”，所述SEQ IDNo. 6可記為“#9適配子”。所述SEQ ID 吣.1為5' -TCA GTC GCT TCG CCG TCT CCT TCGGGGGCGCGGTGAGGGGCTGCACAAGAGGGAG GCA CAA GAG GGA GAC CCC AGAGGG-3,；所述SEQ ID 吣.2為5' -TCA GTC GCT TCG CCG TCT CCT TCGGACGAGATGGGCGGGAAACGAGGCACAAGAGGGA GCA CAA GAG GGA GAC CCCAGAGGG-3'；所述SEQ ID 吣.3為5' -TCA GTC GCT TCG CCG TCT CCT TCGTAGGAGGTAGTCGGAGAGGCGAATGAGAGGGGAAGCACAAGAGGGA GCA CAA GAGGGA GAC CCC AGA GGG-3'；所述SEQ ID No. 4 為5 ' -TCA GTC GCT TCG CCG TCT CCTTCAGCCGGGGTGGTCAGTAGGAGCA GCA CAA GAG GGA GAC CCC AGA GGG-3'；所述SEQ ID 吣.5為5' -TCA GTC GCT TCG CCG TCT CCT TCAGCCGGGGTGGTCAGTAGGAGCAGCACAAGAGGGA GCA CAA GAG GGA GAC CCCAGAGGG-3'；所述SEQ ID 吣.6為5' -TCA GTC GCT TCG CCG TCT CCT TCTGCAGGGCCAGAACAGGGGGAAGGCACAAGAGGGA GCA CAA GAG GGA GAC CCCAGAGGG-3'；所述6條寡核苷酸序列的制備方法，包括以下步驟I)合成用于篩選的ssDNA寡核苷酸文庫(kù)(5' -TCA GTC GCT TCG CCG TCT CCTTC——N35——GCACAAGAG GGAGAC CCCAGAGGG-3')，其中 N35 為 35 個(gè)隨機(jī)寡核苷酸；2)將寡核苷酸文庫(kù)與滅活溶藻弧菌混合后進(jìn)行SELEX篩選，直到親和力不再明顯上升為止；3) SELEX篩選完成后對(duì)適配子富集文庫(kù)進(jìn)行克隆測(cè)序，選擇其中的高拷貝ssDNA進(jìn)行親和特異性的驗(yàn)證和親和常數(shù)的測(cè)定，獲得相應(yīng)適配子。在步驟2)中，所述SELEX篩選的具體步驟可為2.1滅活溶藻弧菌菌液的制備用生理鹽水將培養(yǎng)24h的溶藻弧菌菌落從斜面上洗滌下來(lái)，6000rpm離心5min，棄上清液，再加入含6%甲醛的生理鹽水于62. 5°C水浴lh，離心后生理鹽水洗滌3次，再用2 X結(jié)合緩沖液懸浮滅火的菌沉淀，4°C保存。2. 2與弧菌結(jié)合取合成好的濃度為100 ii M的ssDNA寡核苷酸文庫(kù)4 ii L，用2 X結(jié)合緩沖液稀釋至IOOiI L，95°C變性5min，冰浴IOmin后加入到100 y L滅活的溶藻弧菌菌懸液中，30搖床結(jié)合2小時(shí),再6000rpm離心5min,棄上清,然后用I X結(jié)合緩沖液洗沉淀I次,棄上清，則沉淀部分為滅活溶藻弧菌沉淀和與其相結(jié)合的ssDNA ；在步驟2. 2中，所述2 X結(jié)合緩沖液為20 X結(jié)合緩沖液用雙蒸水稀釋10倍后的溶液，所述IX結(jié)合緩沖液為20 X結(jié)合緩沖液用雙蒸水稀釋20倍后的溶液；所述20 X結(jié)合緩沖液配方為 IM NaCl、50mM KCl、500mM Tris-HClUOmM MgCl2、pH 7.4。2. 3分離結(jié)合的ssDNA在步驟2. 2所得的沉淀部分中加入IX結(jié)合緩沖液IOOii L，95°C加熱5min，使與弧菌結(jié)合的ssDNA變性，從而與弧菌分離，然后15000rpm離心lOmin，取上清液，則可分離得到與弧菌結(jié)合的ssDNA。2. 4 不對(duì)稱(chēng) PCR 擴(kuò)增 ssDNA總體積為25 ii L的不對(duì)稱(chēng)PCR的擴(kuò)增體系如表I所示。表I
權(quán)利要求
1.6條寡核苷酸序列，其特征在于包括SEQ ID No. USEQ ID No. 2、SEQ ID No. 3、SEQIDNo. 4,SEQ ID No. 5和SEQ ID No. 6共6條寡核苷酸序列，且采用其中一條就能完成滅活溶藻弧菌的識(shí)別檢測(cè)； 所述SEQ ID No.1可記為“#7適配子”，所述SEQ ID No. 2可記為“#14適配子”，所述SEQ ID No. 3可記為“#23適配子”，所述SEQ ID No. 4可記為“#4適配子”，所述SEQ ID No. 5可記為“#8適配子”，所述SEQ ID No. 6可記為“#9適配子”； 所述 SEQ ID 吣.1為5' -TCA GTC GCT TCG CCG TCT CCT TC GGGGGCGCGGTGAGGGGCTGCACAAGAGGGAG GCA CAA GAG GGA GAC CCC AGAGGG-3,； 所述 SEQ ID 吣.2為5' -TCA GTC GCT TCG CCG TCT CCT TCGGACGAGATGGGCGGGAAACGAGGCACAAGAGGGA GCA CAA GAG GGA GAC CCCAGAGGG-3'； 所述 SEQ ID 吣.3為5' -TCA GTC GCT TCG CCG TCT CCT TCGTAGGAGGTAGTCGGAGAGGCGAATGAGAGGGGAAGCACAAGAGGGA GCA CAA GAGGGA GAC CCC AGA GGG-3'； 所述 SEQ ID No.4 為5 ' -TCA GTC GCT TCG CCG TCT CCTTCAGCCGGGGTGGTCAGTAGGAGCA GCA CAA GAG GGA GAC CCC AGA GGG-3'； 所述 SEQ ID 吣.5為5' -TCA GTC GCT TCG CCG TCT CCT TCAGCCGGGGTGGTCAGTAGGAGCAGCACAAGAGGGA GCA CAA GAG GGA GAC CCCAGAGGG-3'； 所述 SEQ ID 吣.6為5' -TCA GTC GCT TCG CCG TCT CCT TCTGCAGGGCCAGAACAGGGGGAAGGCACAAGAGGGA GCA CAA GAG GGA GAC CCCAGAGGG-3'。
2.如權(quán)利要求1所述6條寡核苷酸序列的制備方法，其特征在于包括以下步驟 1)合成用于篩選的ssDNA寡核苷酸文庫(kù)(5' -TCA GTC GCT TCG CCG TCT CCTTC——N35——GCACAAGAG GGAGAC CCCAGAGGG-3')，其中 N35 為 35 個(gè)隨機(jī)寡核苷酸； 2)將寡核苷酸文庫(kù)與滅活溶藻弧菌混合后進(jìn)行SELEX篩選，直到親和力不再明顯上升為止； 3)SELEX篩選完成后對(duì)適配子富集文庫(kù)進(jìn)行克隆測(cè)序，選擇其中的高拷貝ssDNA進(jìn)行親和特異性的驗(yàn)證和親和常數(shù)的測(cè)定，獲得相應(yīng)適配子。
3.如權(quán)利要求2所述6條寡核苷酸序列的制備方法，其特征在于在步驟2)中，所述SELEX篩選的具體步驟為 . 2.1滅活溶藻弧菌菌液的制備 用生理鹽水將培養(yǎng)24h的溶藻弧菌菌落從斜面上洗漆下來(lái),6000rpm離心5min,棄上清液，再加入含6%甲醛的生理鹽水于62. 5°C水浴lh，離心后生理鹽水洗滌3次，再用2X結(jié)合緩沖液懸浮滅火的菌沉淀，4°C保存； .2. 2與弧菌結(jié)合 取合成好的濃度為IOOii M的ssDNA寡核苷酸文庫(kù)4 iiL，用2X結(jié)合緩沖液稀釋至100ii L，95°C變性5min，冰浴IOmin后加入到100 y L滅活的溶藻弧菌菌懸液中，30搖床結(jié)合2小時(shí),再6000rpm離心5min,棄上清,然后用I X結(jié)合緩沖液洗沉淀I次,棄上清，則沉淀部分為滅活溶藻弧菌沉淀和與其相結(jié)合的ssDNA ； . 2. 3分離結(jié)合的ssDNA 在步驟2. 2所得的沉淀部分中加入IX結(jié)合緩沖液IOOii L，95°C加熱5min，使與弧菌結(jié)合的ssDNA變性，從而與弧菌分離，然后15000rpm離心lOmin，取上清液，則可分離得到與弧菌結(jié)合的ssDNA ； ` 2. 4不對(duì)稱(chēng)PCR擴(kuò)增ssDNA 總體積為25 ii L的不對(duì)稱(chēng)PCR的擴(kuò)增體系如表I所示；
4.如權(quán)利要求3所述6條寡核苷酸序列的制備方法，其特征在于在步驟2.2中，所述2X結(jié)合緩沖液為20 X結(jié)合緩沖液用雙蒸水稀釋10倍后的溶液，所述IX結(jié)合緩沖液為20X結(jié)合緩沖液用雙蒸水稀釋20倍后的溶液；所述20X結(jié)合緩沖液配方為IM NaCl、50mMKCl、500mM Tris-HClUOmM MgCl2、pH 7.4。
5.如權(quán)利要求3所述6條寡核苷酸序列的制備方法，其特征在于在步驟2.5. 2中，所述測(cè)定親和力的具體步驟為 ` 2.5. 2.1將TMB用無(wú)水乙醇配成lmg/mL 4°C遮光保存，用前按照下列比例配制TMB 底物緩沖液30%過(guò)氧化氫=100 900 1，即配即用； `2.5. 2. 2與菌結(jié)合取步驟2. 5.1擴(kuò)增所得的PCR產(chǎn)物，用超微量分光光度計(jì)測(cè)定其中的ssDNA濃度；然后取I ii L PCR產(chǎn)物，用2 X結(jié)合緩沖液稀釋到100 u L，95°C變性5min，冰浴IOmin后,加入滅活菌液IOOii L充分混合,30°C, IOOrpm搖床結(jié)合30min,然后離心分離細(xì)菌沉淀，棄上清液；同時(shí)做一加結(jié)合緩沖液的空白； . 2. 5. 2. 3洗滌在上述細(xì)菌沉淀中加入I X結(jié)合緩沖液500 u L，充分混勻后，將菌懸液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，6000rpm離心5min,棄上清,取菌沉淀； .2.5. 2. 4與酶標(biāo)兔抗地高辛抗體結(jié)合在菌沉淀中加入IOOiiL I 900TBS稀釋過(guò)的過(guò)量的酶標(biāo)兔抗地高辛抗體，充分混合后，反應(yīng)IOmin,使之與菌沉淀中的地高辛標(biāo)記的ssDNA結(jié)合； .2.5. 2. 5洗滌6000rpm離心5min，棄上清，再用I X結(jié)合緩沖液500 u L洗滌3次，每次洗滌都將菌懸液轉(zhuǎn)移到新的離心管中，最后棄上清，得菌沉淀； . 2.5. 2. 6TMB顯色加入400 u L雙蒸水重懸菌沉淀，再加入200 u L TMB顯色液，避光顯色I(xiàn)Omin后，以2mol/L H2SO4IOO u L終止反應(yīng)，測(cè)定450nm處的吸光值OD45tl,該值即反映與菌結(jié)合的ssDNA的親和力，即OD結(jié)合，空白同樣進(jìn)行上述步驟2. 5. 2. 3，2. 5. 2. 4，2. 5. 2. 5和.2.5. 2. 6，得到空白相應(yīng)的吸光度OD空白；. 25 2 7
6.如權(quán)利要求2所述6條寡核苷酸序列的制備方法，其特征在于在步驟3)中，所述對(duì)適配子富集文庫(kù)進(jìn)行克隆測(cè)序，選擇其中的高拷貝ssDNA進(jìn)行親和特異性的驗(yàn)證和親和常數(shù)的測(cè)定，獲得相應(yīng)適配子，其具體方法為 將步驟2)篩選出的適配子富集文庫(kù)進(jìn)行不對(duì)稱(chēng)PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件同步驟2. 4，擴(kuò)增產(chǎn)物送測(cè)序公司進(jìn)行克隆，并隨機(jī)挑取5個(gè)以上克隆進(jìn)行測(cè)序，得到一系列寡核苷酸序列或ssDNA ;然后對(duì)獲得的一系列ssDNA進(jìn)行比較分析，發(fā)現(xiàn)有些ssDNA是完全相同的，或者說(shuō)有些ssDNA在測(cè)序結(jié)果中有2個(gè)以上的拷貝；若沒(méi)有發(fā)現(xiàn)這種多拷貝ssDNA，則重復(fù)步驟3)，繼續(xù)克隆測(cè)序，直到獲得至少一個(gè)多拷貝的ssDNA ;然后選擇這些多拷貝ssDNA進(jìn)行親和特異性驗(yàn)證，獲得相應(yīng)的適配子，具體過(guò)程如下 . 3.1合成需要進(jìn)行驗(yàn)證的ssDNA序列，并在5’端標(biāo)記地高辛； . 3.2滅活微生物的準(zhǔn)備 選取水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境常見(jiàn)的病原微生物-哈維式弧菌(Vibrio harveyi)、嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)、遲純愛(ài)德華氏菌(Edwardsiella tarda)作為對(duì)照菌，與溶藻弧菌(V. alginolyticus)—起,在無(wú)菌條件下分別接種到胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基中，30°C下IOOrpm搖床培養(yǎng)約8 IOh ;然后取菌液離心，棄上清培養(yǎng)液，再加入含6%甲醛的生理鹽水于62. 5°C水浴lh，離心后生理鹽水洗滌3次，再用2 X結(jié)合緩沖液懸浮滅火的菌沉淀，4°C保存； . 3.3親和力的測(cè)定和親和特異性驗(yàn)證 .3.3.1與菌結(jié)合取合成出的ssDNA序列IOpmol用2 X結(jié)合緩沖液稀釋到100 U 1,95°C變性5min，冰浴IOmin后，分別與上述4種滅活菌的菌液各100 U I混合(菌數(shù)量約為3 X IO8個(gè)),在28°C、IOOrpm搖床結(jié)合40min,然后6000rpm離心5min,分離細(xì)菌沉淀與上清液，同時(shí)做一加2X結(jié)合緩沖液的空白； .3.3. 2洗滌將上述滅活菌的菌沉淀用I X結(jié)合緩沖液500 洗滌I次，6000rpm離心5min,棄上清,取菌沉淀；[ 3.3. 3與辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記兔抗地高辛抗體結(jié)合在菌沉淀中加入IOOu 11 900TBS稀釋的過(guò)量的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記兔抗地高辛抗體，充分混合后，反應(yīng)IOmin ； [3.3. 4洗滌10000rpm離心5min，再用IX結(jié)合緩沖液500 洗滌3次，棄上清，取菌沉淀； [ 3.3. 5顯色加入400 ill雙蒸水重懸菌沉淀，再加入200 u I TMB顯色液，避光顯色I(xiàn)Omin后，以2mol/L H2S04200 u I終止反應(yīng)，測(cè)定450nm處的吸光值OD45tl，該值即反映結(jié)合的酶標(biāo)抗地高辛的OD值，即為空白同樣進(jìn)行上述步驟5. 3. 2,5. 3. 3,5. 3. 4和5. 3. 5，得到空白相應(yīng)的吸光度OD空白，相應(yīng)適配子的親和力=OD結(jié)合-OD空白； [ 3.3. 6數(shù)據(jù)處理分析 用EXCEL軟件中的統(tǒng)計(jì)函數(shù)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，統(tǒng)計(jì)指標(biāo)采用T檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，統(tǒng)計(jì)概率p〈0. 05為顯著差異，p〈0. 01為極顯著的差異，統(tǒng)計(jì)分析后獲得相應(yīng)序列對(duì)上述四種菌的識(shí)別效果，從而確定該序列對(duì)滅活溶藻弧菌是否具有親和特異性，能否用于滅活溶藻弧菌的識(shí)別檢測(cè)。
7.如權(quán)利要求1所述6條寡核苷酸序列在滅活溶藻弧菌檢測(cè)中的應(yīng)用。
8.如權(quán)利要求7所述應(yīng)用，其特征在于其檢測(cè)方法如下 [1)待測(cè)滅活菌液的制備取樣品，蒸餾水溶解后接種到胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基(TSB)培養(yǎng)基中，30°C下IOOrpm搖床培養(yǎng)約8 IOh ;然后取菌液離心，棄上清培養(yǎng)液，再加入含6%甲醛的生理鹽水于62. 5°C水浴lh，離心后生理鹽水洗滌3次，再用2 X結(jié)合緩沖液懸浮滅火的菌沉淀，4°C保存； [ 2)取待測(cè)滅活菌液，用5/端標(biāo)記有地高辛的上述6條寡核苷酸序列中的任何一條按步驟3. 3的親和力測(cè)定方法對(duì)待測(cè)滅活菌液進(jìn)行檢測(cè)；同時(shí)用滅活溶藻弧菌代替待測(cè)菌液，同樣按步驟3. 3的親和力測(cè)定方法進(jìn)行檢測(cè)，得到陽(yáng)性對(duì)照；用無(wú)菌蒸餾水代替待測(cè)滅活菌液，同樣按步驟3. 3的親和力測(cè)定方法進(jìn)行檢測(cè)，得到陰性對(duì)照；結(jié)果顯示陽(yáng)性對(duì)照組顏色為黃色，陰性對(duì)照組不顯色；如果待測(cè)樣品檢測(cè)結(jié)果呈現(xiàn)黃色，說(shuō)明樣品中有溶藻弧菌，為陽(yáng)性，如果待測(cè)樣品檢測(cè)結(jié)果不顯色，則說(shuō)明樣品中沒(méi)有溶藻弧菌；或 取5 ii L濃度為IOuM的上述6條ssDNA中的任何一條，用2X結(jié)合緩沖液稀釋至IOOii L，95°C變性5min，冰浴10后，分別加入滅活的待測(cè)菌懸液中，菌濃度在IO2個(gè)/mL以上，轉(zhuǎn)速I(mǎi)OOrpm搖床結(jié)合30min ;然后6000rpm離心5min,棄上清,沉淀部分為菌沉淀和其相結(jié)合的ssDNA，用500 ii L IX結(jié)合緩沖液洗滌5次；然后向沉淀中加入I X結(jié)合緩沖液100ul，95°C加熱5min，使其與菌結(jié)合的ssDNA變性，從而與弧菌分離，然后15000rpm離心IOmin,取上清液，則可分離到可與菌結(jié)合的ssDNA，然后取樣進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為25 ii L的普通PCR參數(shù)如表3所示 表全文摘要
6條寡核苷酸序列及其應(yīng)用，涉及溶藻弧菌的識(shí)別檢測(cè)。提供可用于滅活溶藻弧菌識(shí)別檢測(cè)的6條寡核苷酸序列及其制備方法和應(yīng)用。該寡核苷酸序列不僅具有檢測(cè)快速、操作簡(jiǎn)單、穩(wěn)定性高于抗體等特點(diǎn)，而且制備方法容易、制備周期較短。所述6條寡核苷酸序列包括SEQ ID No.1~6共6條寡核苷酸序列且采用其中一條就能完成滅活溶藻弧菌的識(shí)別檢測(cè)。合成用于篩選的ssDNA寡核苷酸文庫(kù)；將寡核苷酸文庫(kù)與滅活溶藻弧菌混合后進(jìn)行SELEX篩選，直到親和力不再明顯上升為止，再克隆測(cè)序，選擇其中的高拷貝ssDNA進(jìn)行親和特異性的驗(yàn)證和親和常數(shù)的測(cè)定，得相應(yīng)適配子?？捎糜诟黝?lèi)樣品中滅活溶藻弧菌的識(shí)別檢測(cè)。
文檔編號(hào)C12Q1/04GK103060326SQ201210552569
公開(kāi)日2013年4月24日 申請(qǐng)日期2012年12月17日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月17日
發(fā)明者鄭江, 湯學(xué)敏, 李玉寶 申請(qǐng)人:集美大學(xué)