專(zhuān)利名稱(chēng)：輪狀病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)引物組和檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種輪狀病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)引物組和檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
輪狀病毒(rotavirus)是世界范圍內(nèi)病毒性胃腸炎的重要病因。目前對(duì)輪狀病毒感染引起的胃腸炎治療尚無(wú)特效藥物。無(wú)論在發(fā)達(dá)國(guó)家或是發(fā)展中國(guó)家，由輪狀病毒引起的腹瀉均有較高的發(fā)病率，是嬰幼兒發(fā)病和致死的最主要病因。輪狀病毒在離體條件下存活力很強(qiáng)，對(duì)各種理化因子有較強(qiáng)抵抗力，耐乙醚和弱酸，用氯仿、反復(fù)凍融、超聲波處理都不能使其失活，且這類(lèi)病毒的序列變異較大，有多種血清型存在。近年來(lái)，輪狀病毒引起的胃腸炎流行在世界范圍內(nèi)有不斷上升的趨勢(shì)，且流行范 圍廣，傳染性強(qiáng)，二次攻擊率高，常造成急性嚴(yán)重的嘔吐和腹瀉。雖然不同病毒感染的癥狀輕重不一，但一般患者都具有低燒、嘔吐、腹瀉、頭痛等嚴(yán)重的脫水樣胃腸炎的癥狀。人群對(duì)這幾種病毒普遍易感，兒童和老人最為嚴(yán)重，為胃腸炎病毒的危險(xiǎn)人群。雖然輪狀病毒胃腸炎的流行有一定的季節(jié)性，但全年均可發(fā)生，可呈暴發(fā)流行，也可呈散發(fā)流行，因此致使對(duì)其不能進(jìn)行及時(shí)有效的防護(hù)。目前輪狀病毒病原的檢測(cè)方法有電鏡技術(shù)、病毒分離培養(yǎng)技術(shù)、免疫學(xué)技術(shù)及分子生物學(xué)技術(shù)，但上述的前三種技術(shù)往往存在靈敏度較低、操作繁瑣耗時(shí)、需要大型昂貴的儀器設(shè)備等缺點(diǎn)，在應(yīng)用時(shí)往往有其局限性，尤其不能適用于大規(guī)模的病原篩查和檢測(cè)等實(shí)際應(yīng)用。分子生物學(xué)技術(shù)，其中尤其以RT-PCR檢測(cè)技術(shù)由于其快速、靈敏、適合處理大通量的樣品等特點(diǎn)，在病毒檢測(cè)中顯示出其優(yōu)越性并越來(lái)越多的得以應(yīng)用，但該方法從檢測(cè)到結(jié)果的判讀仍然需要多種專(zhuān)用儀器，操作較為繁瑣，所需時(shí)間仍然在5小時(shí)以上，常有非特異性出現(xiàn)等缺陷。與上述幾種實(shí)驗(yàn)室診斷方法相比，近年來(lái)新建立的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)技術(shù)由于其對(duì)儀器設(shè)備要求不高，臨床上容易做到，檢測(cè)時(shí)間也較短，不超過(guò)3小時(shí)，為快速、準(zhǔn)確檢測(cè)輪狀病毒探索一種新方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一目的是提供一種應(yīng)用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)輪狀病毒(rotavirus)的檢測(cè)引物組，利用該檢測(cè)引物組可以特異性的檢測(cè)輪狀病毒(rotavirus)。本發(fā)明的應(yīng)用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)輪狀病毒(rotavirus)的檢測(cè)引物組，其特征在于，由下列引物組成上游外引物F3 :5，-ACCACTCCTTAATGCACAA-3，；(如 SEQ ID NO.1 所示)；下游外引物B3 :5’ -GCCATCCTTTGATTAAAAATAGCT-3’ ；(如 SEQ ID NO. 2 所示)；上游內(nèi)引物FIP : 5 ’ -CCTCTCGCGTTGAGTTCGTAT-GGAATAAATCTTCCGATTACTGG-3，；(如SEQ ID NO. 3 所示)下游內(nèi)引物BIP :5’ -ATGTTTGTATTACCCAACTGAAGCA-AGAAAGTGTATCCTTCCATGAA-3，(如 SEQ ID NO. 4 所示)。本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種非疾病的診斷和治療目的的輪狀病毒的檢測(cè)方法，其特征在于，對(duì)樣品進(jìn)行病毒RNA提取，再反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后通過(guò)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增的方法用上述檢測(cè)引物組對(duì)cDNA進(jìn)行選擇性擴(kuò)增，確認(rèn)是否存在有擴(kuò)增產(chǎn)物。所述的樣品可以為醫(yī)院的腹瀉樣品，以及水、食品等。所述的通過(guò)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增的方法用上述檢測(cè)引物組對(duì)cDNA進(jìn)行選擇性擴(kuò)增具體為環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增體系為體系總體積25 μ L，包括2. 5 μ L IOXThermopol反應(yīng)緩沖液、O. 4μ L10mmol/LdNTPs、0. 5μ L 10 μ mol/L 上游外引物 F3、0. 5 μ L 10 μ mol/L 下游外弓丨物 Β3、1 μ L40 μ mol/L 上游內(nèi)引物 FIPU μ L 40 μ mol/L 下游內(nèi)引物 BIP,O. 6 μ L100mmol/LMgSO4> 12. 5 μ L2mol/L 舌甘菜喊、4 μ L 滅菌雙蒸水 ddH 20,1 μ L8U/ μ L Bst DNA 聚合酶和 IuLcDNA，反應(yīng)條件為在溫度為65°C孵育60min。所述的確認(rèn)是否存在有擴(kuò)增產(chǎn)物可以利用電泳檢測(cè)、熒光顯色檢測(cè)或濁度檢測(cè)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物是否具有擴(kuò)增產(chǎn)物，優(yōu)選用熒光顯色檢測(cè)，具體是在終止反應(yīng)的反應(yīng)管中加入I μ L 10% SYBR Green I顯色劑，IOmin后觀(guān)察結(jié)果，如果顏色為黃色，則樣品輪狀病毒陰性，無(wú)輪狀病毒，如果顏色為綠色，則樣品輪狀病毒陽(yáng)性，含有輪狀病毒。所述的lOXThermopol反應(yīng)緩沖液是現(xiàn)有技術(shù)中的物質(zhì)，可以從試劑公司購(gòu)買(mǎi)至丨J，其含有200mmol/L pH8. 8的三羥基甲基氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl)、100mmol/L氯化鉀(KCl)、100mmol/L 硫酸銨(NH4) 2S04、20mmol/L 硫酸鎂(MgSO4)和 1% 曲拉通 X-100(TtitonX-100)，余量為水。本發(fā)明建立了輪狀病毒的LAMP檢測(cè)方法，本檢測(cè)方法根據(jù)輪狀病毒的基因保守序列設(shè)計(jì)了兩個(gè)特異性?xún)?nèi)引物和兩個(gè)特異性外引物，該保守基因序列為輪狀病毒所共有。本發(fā)明采用LAMP技術(shù)，特異性強(qiáng)，且比PCR檢測(cè)方法有更高的靈敏度，但不需昂貴的PCR儀，只需普通的水浴箱即可，且結(jié)果不必用凝膠電泳方法來(lái)觀(guān)察，使用熒光染料來(lái)觀(guān)察即可，簡(jiǎn)單而快速，可用于輪狀病毒的檢測(cè)，特別適合于基層現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(Loop-mediatedIsothermal Amplif ication, LAMP)技術(shù)具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、快速且成本低等優(yōu)點(diǎn)，其特點(diǎn)是對(duì)靶基因的6個(gè)部位設(shè)計(jì)4種引物，利用鏈置換反應(yīng)在恒溫下使靶基因高效擴(kuò)增。由于其反應(yīng)是多種引物共同啟動(dòng)，使得反應(yīng)結(jié)果比PCR更特異，另外，由于實(shí)行的等溫?cái)U(kuò)增，反應(yīng)在恒溫水浴箱內(nèi)便可完成，不僅節(jié)約儀器成本，而且操作方法更簡(jiǎn)單，適用于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。本發(fā)明解決了現(xiàn)有技術(shù)中檢測(cè)輪狀病毒的方法所需周期長(zhǎng)、靈敏度較低、成本高等缺陷，可廣泛應(yīng)用于醫(yī)院、食品行業(yè)、出入境檢驗(yàn)檢疫及質(zhì)量監(jiān)督等部門(mén)及領(lǐng)域。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說(shuō)明，而不是對(duì)本發(fā)明的限制。實(shí)施例1 :利用輪狀病毒LAMP檢測(cè)試劑盒檢測(cè)輪狀病毒待測(cè)樣本制備以臨床腹 與樣本為例本實(shí)施例收集了 2份醫(yī)院收集的臨床腹瀉樣本，分別按照以下方法進(jìn)行檢測(cè)。( I)樣本處理取醫(yī)院收集的臨床腹瀉樣本，用ρΗ7. 4的PBS稀釋成10%的懸液，4°C、IOOOOg離心取上清，用于提取病毒RNA。(2)病毒RNA提取(a)取200 μ L步驟(I)的上清，加800 μ L Trizol試劑，用移液器反復(fù)混勻幾次后靜置5min ；(b)加入200 μ L氯仿，用力振搖15S，再靜置2 3min ;(c) 4°C, 12000g,離心 15min,棄去上層液體；(d)加入500 μ L異丙醇，充分混勻，室溫放置IOmin ；(e) 4°C, 12000g,離心 IOmin,再次棄去上清；
(f)加入75 %的乙醇，振搖，充分洗滌沉淀；(g) 4°C, 7500g,離心 5min,小心棄去乙醇；(h)充分干燥后，將RNA沉淀懸浮于適量的無(wú)RNA酶的水中，由此得到RNA樣品。(3)病毒RNA反轉(zhuǎn)錄取2 μ L RNA 樣品，I μ L dNTP, O. 5 μ L RNasin, I μ L MLV,各 I μ L 的外引物 F3(5 ’ -ACCACTCCTTAATGCACAA-3，)和外引物 B3 (5，-GCCATCCTTTGATTAAAAATAGCT-3，)，2. 5 μ LIOXRT buffer，1. 5 μ LMgCl2，加入RNase free水至終體積為25 μ L，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為42°C，30min，然后 95°C，2min，由此得到 cDNA。(4)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增體系為體系總體積25 μ L，包括2. 5μ L IOXThermopol反應(yīng)緩沖液、O. 4μ L10mmol/L dNTPs.O. 5μ L 10 μ mol/L 上游外引物 F3 (如 SEQ ID NO.1 所示)、
0.5μ L 10 μ mol/L下游外引物Β3 (如SEQ ID NO. 2所示)、lyL 40 μ mol/L上游內(nèi)引物FIP (如 SEQ ID NO. 3 所示)、lyL 40 μ mol/L 下游內(nèi)引物 BIP (如 SEQ ID NO. 4 所示)、0. 6 μ L100mmol/L MgSO4> 12. 5 μ L2mol/L 舌甘菜喊、4 μ L 滅菌雙蒸水 ddH20,1 μ L Bst DNA 聚合酶(8U/μ L)和IyL步驟(3)的cDNA，反應(yīng)條件為在溫度為65°C孵育60min。檢測(cè)引物組為上游外引物F3 :5’ -ACCACTCCTTAATGCACAA-3’ ；下游外引物B3 :5，-GCCATCCTTTGATTAAAAATAGCT-3 ’ ；上游內(nèi)引物 FIP : 5 ’ -CCTCTCGCGTTGAGTTCGTAT-GGAATAAATCTTCCGATTACTGG-3 ’ ；下游內(nèi)引物BIP :5’ -ATGTTTGTATTACCCAACTGAAGCA-AGAAAGTGTATCCTTCCATGAA-3，。(5)擴(kuò)增產(chǎn)物的顯色檢測(cè)在上述反應(yīng)管中加入I μ L 10% SYBR Green I顯色劑，室溫放置lOmin，用肉眼觀(guān)察顏色變化，如顏色變?yōu)榫G色，則說(shuō)明樣品中含有輪狀病毒；如果顏色為黃色，說(shuō)明待檢樣品不含有輪狀病毒。其結(jié)果為陰性對(duì)照(模板為水)黃色，不含有輪狀病毒，2號(hào)樣品為本實(shí)施例的臨床腹瀉樣本，其顏色都為黃色，不含有輪狀病毒，3號(hào)樣品是本實(shí)施例的另外一份臨床腹瀉樣本，其顏色都為綠色，含有輪狀病毒。這與通過(guò)常規(guī)RT-PCR檢測(cè)方法檢測(cè)得到的結(jié)果相同。實(shí)施例2 :特異性試驗(yàn)將I個(gè)已知輪狀病毒陰性和2個(gè)已知輪狀病毒陽(yáng)性的樣品，按照實(shí)施例1的RT-LAMP法再次檢測(cè)，結(jié)果表明，已知陰性的樣品，在LAMP檢測(cè)結(jié)果中仍然呈現(xiàn)陰性，已知陽(yáng)性的樣品，在LAMP檢測(cè)結(jié)果中仍然呈現(xiàn)陽(yáng)性，表明LAMP檢測(cè)結(jié)果和PCR檢測(cè)結(jié)果相吻合，驗(yàn)證了本發(fā)明所建立方法和試劑盒的特異性。實(shí)施例3 :靈敏度試驗(yàn)將輪狀病毒RNA梯度稀釋?zhuān)凑諏?shí)施例1中步驟3-5的方法進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增和擴(kuò)增產(chǎn)物的顯色檢測(cè)，驗(yàn)證本發(fā)明的靈敏度，檢測(cè)結(jié)果為陰性對(duì)照(模板為水)為黃色，不含有輪狀病毒，陽(yáng)性對(duì)照(RT-PCR陽(yáng)性并測(cè)序確證為陽(yáng)性的輪狀病毒)為綠色，含有 輪狀病毒，而100pg、10pg、lpg、0.1pg模板量的輪狀病毒RNA樣品其顏色都為綠色,都為陽(yáng)性，確定其檢測(cè)靈敏度為O.1pgo
權(quán)利要求
1.一種應(yīng)用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)輪狀病毒(rotavirus)的檢測(cè)引物組，其特征在于， 由下列引物組成上游外引物 F3 :5’ -ACCACTCCTTAATGCACAA-3’ ；下游外引物 B3 :5’ -GCCATCCTTTGATTAAAAATAGCT-3’ ；上游內(nèi)引物 FIP :5’ -CCTCTCGCGTTGAGTTCGTAT-GGAATAAATCTTCCGATTACTGG-3’ ；下游內(nèi)引物 BIP :5’ -ATGTTTGTATTACCCAACTGAAGCA-AGAAAGTGTATCCTTCCATGAA-3’。
2.一種非疾病的診斷和治療目的的輪狀病毒的檢測(cè)方法，其特征在于，對(duì)樣品進(jìn)行病毒RNA提取，再反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后通過(guò)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增的方法用權(quán)利要求1所述的檢測(cè)引物組對(duì)cDNA進(jìn)行選擇性擴(kuò)增，確認(rèn)是否存在有擴(kuò)增產(chǎn)物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述的樣品為醫(yī)院的腹瀉樣品、水或食品。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述的通過(guò)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增的方法用權(quán)利要求1所述的檢測(cè)引物組對(duì)cDNA進(jìn)行選擇性擴(kuò)增具體為環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增體系為體系總體積 25 μ L，包括 2. 5μ L IOXThermopol 反應(yīng)緩沖液、O. 4μ L IOmmo I/LdNTP S、 O. 5 μ LlO μ mol/L 上游外引物 F3、0. 5 μ L 10 μ mol/L 下游外引物 B3、I μ L 40 μ mol/L 上游內(nèi)引物 FIP、lyL 4(^11101/1下游內(nèi)引物81 、0.6 4 1^100_01/1 MgS04U2. 5μ L 2mol/L 甜菜堿、4 μ L滅菌雙蒸水ddH20,1 μ L 8U/ μ L Bst DNA聚合酶和I μ L cDNA,反應(yīng)條件為在溫度為65°C孵育60min。
5.根據(jù)權(quán)利要求2或3或4所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述的確認(rèn)是否存在有擴(kuò)增產(chǎn)物是用熒光顯色檢測(cè)，具體是在終止反應(yīng)的反應(yīng)管中加入IyL 10% SYBR Green I顯色劑，IOmin后觀(guān)察結(jié)果，如果顏色為黃色，則樣品輪狀病毒陰性，無(wú)輪狀病毒，如果顏色為綠色，則樣品輪狀病毒陽(yáng)性，含有輪狀病毒。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種輪狀病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)引物組和檢測(cè)方法。檢測(cè)引物組包括上游外引物F3、下游外引物B3、上游內(nèi)引物FIP、下游內(nèi)引物BI P，分別如SEQ ID NO.1、2、3和4所示。本發(fā)明建立了輪狀病毒的LAMP檢測(cè)方法，本檢測(cè)方法根據(jù)輪狀病毒的基因保守序列設(shè)計(jì)了兩個(gè)特異性?xún)?nèi)引物和兩個(gè)特異性外引物，該保守基因序列為輪狀病毒所共有。本發(fā)明采用LAMP技術(shù)，特異性強(qiáng)，且比PCR檢測(cè)方法有更高的靈敏度，但不需昂貴的PCR儀，只需普通的水浴箱即可，且結(jié)果不必用凝膠電泳方法來(lái)觀(guān)察，使用熒光染料來(lái)觀(guān)察即可，簡(jiǎn)單而快速，可用于輪狀病毒的檢測(cè)，特別適合于基層現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12Q1/70GK103014178SQ20121055367
公開(kāi)日2013年4月3日 申請(qǐng)日期2012年12月18日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月18日
發(fā)明者寇曉霞, 吳清平, 薛亮, 張菊梅 申請(qǐng)人:廣東省微生物研究所, 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司