一種高通量真菌的分離方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領域】，本發(fā)明公提供了一種強寄生病原真菌的分離方法，以便于今后研究。單孢分離是分離強寄生病原真菌的有效方法，特別適合分離用傳統(tǒng)的組織分離法污染嚴重，難以分離成功的病原真菌，如梨黑星病菌、蘋果褐斑病菌、尾孢屬真菌等。傳統(tǒng)的單孢分離技術(shù)由于操作復雜，技術(shù)要求高，限制了其應用。改用直徑1mm的毛細管打孔后，大大簡化了操作過程，使單孢分離的可操作性更強，速度更快，一般的技術(shù)人員經(jīng)簡單的訓練可掌握此項技術(shù)，從而擴大了其應用范圍。主要采用該方法對強寄生真菌和子囊孢子進行分離，獲得良好的效果。
【專利說明】一種高通量真菌的分離方法
【技術(shù)領域】
[0001]本發(fā)明屬生物【技術(shù)領域】，主要涉及一種強寄生病原真菌的分離方法。
【背景技術(shù)】
[0002]強寄生真菌主要寄生在活體植物上，從活體的寄主組織中獲取必要的養(yǎng)份，在人工培養(yǎng)基上生長緩慢。除了病原菌外，發(fā)病的寄主組織內(nèi)還有內(nèi)生菌、腐生菌等雜菌。由于這些雜菌在人工培養(yǎng)基上生長快，用常規(guī)的病組織分離法分離強寄生真菌，常被雜菌污染，分離成功率非常低。單孢分離能夠避免病組織所帶雜菌造成的污染，用于強寄生真菌的分離，成功率錄取較高。
[0003]單孢分離是真菌分離與純化的基本技術(shù)，廣泛用于真菌的遺傳和變異、生理生化特性研究和菌種的純化與保存工作。國外已發(fā)明專門的“單孢子分離器，而國內(nèi)主要靠手工操作。常用的單孢分離方法有:小玻片單孢子分離法，印痕移取單孢子分離法，瓊脂平板稀釋法:即將孢子懸浮液涂在瓊脂平板表面，然后直接挑取單孢，連續(xù)變倍體視顯微鏡單孢分離法及眉毛挑針挑取單孢子法等。這些單孢分離方法操作復雜，對技術(shù)要求較高，從而限制了其應用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種對強寄生病原真菌的分離方法，以便于今后研究。在多年實驗室工作的基礎上，對瓊脂平板稀釋單孢分離法進行了改進，改進的毛細管打孔單孢分離法，具有操作簡便、分離速度快、污染低等優(yōu)點。
【具體實施方式】
[0005]毛細管打孔法單孢分離的基本步驟是:直接從病斑上獲取孢子，涂布到水瓊脂片上，在顯微鏡下找到所需孢子，用毛細管打孔，最后將有單個孢子的瓊脂餅轉(zhuǎn)入培養(yǎng)基中培養(yǎng)，具體方法如下:
(O水瓊脂制備:將瓊脂粉直接加入無菌水中，在微波爐中加熱至熔化；或者，將瓊脂粉加入自來水中，滅菌后備用。單孢分離常用2%水瓊脂。
[0006](2)瓊脂片制備:用1 ml滅菌移液槍吸取2%的無菌水瓊脂涂布在無菌的載玻片上，厚度均勻。
[0007](3)孢子涂布:用滅菌挑針挑取病斑上的孢子，沾附到水瓊脂片上，用滅菌玻棒或毛細管沾取無菌水，稀釋涂布孢子。或者，用直徑I mm的毛細管，在酒精燈下燒軟后拉絲，折斷后制作成細針(簡稱“毛細管針”)，用毛細管針挑取孢子，直接涂布到水瓊脂片上。
[0008](4)孢子選取:顯微鏡檢(常用10倍物鏡)涂有孢子的水瓊脂片，找到典型孢子后，移入視野中央(視野內(nèi)僅此1個孢子)，然后下移載物臺。
[0009](5)瓊脂打孔:取內(nèi)徑為1mm的毛細管，在酒精燈上燒軟后彎成直角，短臂長度約Icm0短臂端部在酒精燈上加熱滅菌后，對準顯微鏡物鏡頭下的光斑中央壓下，在水瓊脂上打一個直徑Imm的圓餅。提升載物臺到原來的位置，觀察目標孢子是否在瓊脂餅上，如果不在，重新選取孢子。
[0010](6)單孢轉(zhuǎn)移:用無菌挑針或毛細管針，挑取帶有目標孢子的瓊脂餅，轉(zhuǎn)入相應的培養(yǎng)基中，有孢子的一面緊貼培養(yǎng)基。每皿可放3飛個單孢。
[0011]第2到第6步，都需在超凈工作臺上或無菌室內(nèi)完成。
[0012]實施例1
干腐病菌孢子的獲取:將10ml，1%無菌的水瓊脂倒入無菌培養(yǎng)皿中，冷卻。自田間采集帶有小黑點的干腐病枝，用70%的酒精擦拭表面消毒后，切取病皮，粘貼在水瓊脂上。倒置培養(yǎng)皿，在病皮的正下方，放置一片用于單孢分離的瓊脂片，有瓊脂的面對準病皮。密封培養(yǎng)皿，在室溫下保濕2~12 h，病皮上成熟子囊中的子囊孢子會噴射到水瓊脂片上，在顯微鏡下挑取單孢，轉(zhuǎn)入PAD中培養(yǎng)。
[0013]實施例2
干腐病菌分生孢子自田間采集帶有小黑點的干腐病枝，用70%的酒精擦拭表面消毒。切取消毒病皮，用無菌水浸濕，置于無菌的培養(yǎng)皿中，室溫下(2(T25 °C)保濕12 h，白色細長的分生孢子角即可自孢子器中擠出，用毛細管針，挑取孢子角，涂布到水瓊脂片上，挑取單孢，轉(zhuǎn)入PDA中培 養(yǎng)。
【權(quán)利要求】
1.一種強寄生病原真菌的采樣、分離方法，其特征是:通過以下步驟實現(xiàn):(1)樣品采集:直接從病斑上獲取孢子，涂布到水瓊脂片上，在顯微鏡下找到所需孢子；(2)樣品分離:用毛細管打孔，將有單個孢子的瓊脂餅轉(zhuǎn)入培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
2.如權(quán)利要求1所述的干腐病菌孢子的獲取:將IOml,1%無菌的水瓊脂倒入無菌培養(yǎng)皿中，冷卻；自田間采集帶有小黑點的干腐病枝，用70%的酒精擦拭表面消毒后，切取病皮，粘貼在水瓊脂上。
3.如權(quán)利要求2所述的用滅菌挑針挑取病斑上的孢子，沾附到水瓊脂片上，用滅菌玻棒或毛細管沾取無菌水，稀釋涂布孢子；或者，用直徑I mm的毛細管，在酒精燈下燒軟后拉絲，折斷后制作成細針(簡稱“毛細管針”)，用毛細管針挑取孢子，直接涂布到水瓊脂片上。
4.如權(quán)利要求1、2、3所述的通過對瓊脂平板稀釋單孢分離法進行了改進，改進的毛細管打孔單孢分離法，具有操 作簡便、分離速度快、污染低等優(yōu)點。
【文檔編號】C12N1/14GK103881924SQ201210554055
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2012年12月19日 優(yōu)先權(quán)日:2012年12月19日
【發(fā)明者】王英俊, 邱梅 申請人:青島康地恩藥業(yè)股份有限公司