專利名稱：一種化學(xué)生物合成法規(guī)?；苽淠峥缩０废汆堰识塑账岬姆椒?br> 技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及化學(xué)生物合成法規(guī)?；苽淠峥缩０废汆堰识塑账岬姆椒?。
背景技術(shù)：
尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸(簡(jiǎn)稱NAD)是脫氫酶的輔酶，也稱輔酶I，它在糖酵解，糖異生，三羧酸循環(huán)和呼吸鏈中發(fā)揮著不可替代的作用。產(chǎn)物會(huì)將脫下的氫遞給NAD，使之成為NADH。而NADH則會(huì)作為氫的載體，在呼吸鏈中通過(guò)化學(xué)滲透偶聯(lián)的方式，合成ATP。NAD是現(xiàn)代生物催化反應(yīng)必不可少的輔酶之一，亮氨酸脫氫酶，甲酸氨脫氫酶，葡萄糖脫氫酶都需要NAD的幫助來(lái)完成整個(gè)反應(yīng)。因?yàn)镹AD在人體及動(dòng)物體內(nèi)是數(shù)量龐大的氧化還原酶的輔酶，所以它還可以用作藥物設(shè)計(jì)的直接模板，或者根據(jù)NAD的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)酶抑制劑或興奮劑來(lái)間接改變NAD作用酶的活動(dòng)，或者直接來(lái)抑制NAD的生物合成。NAD同時(shí)有可能作為未來(lái)很重要的一種抗衰老的輔助藥物。現(xiàn)代生物研究的熱門Sir2蛋白質(zhì)是一種依靠NAD的脫乙酰酶，它的作用是延長(zhǎng)細(xì)胞的生命周期(抗衰老)。目前NAD大都是由動(dòng)植物中提取，存在得率低，成本高，提取難度大的缺點(diǎn)，大大阻礙了現(xiàn)代生物催化技術(shù)的發(fā)展。目前尚無(wú)化學(xué)生物法規(guī)?；苽銷AD，如能以化學(xué)生物合成方法規(guī)?；a(chǎn)NAD，具有重大的社會(huì)意義及經(jīng)濟(jì)效益。化學(xué)生物合成方法與傳統(tǒng)提取方法相比，能極大地降低成本，提高得率，降低生產(chǎn)難度，從而有力促進(jìn)現(xiàn)代生物催化技術(shù)的發(fā)展。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明主要解決的技術(shù)問(wèn)題是規(guī)?；瘜W(xué)生物合成尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸，使尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸的化學(xué)生物合成能真正產(chǎn)生經(jīng)濟(jì)效益、社會(huì)效益。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下:一種化學(xué)生物法規(guī)?；苽淠峥缩０废汆堰识塑账岬姆椒?，以四乙酰核糖，煙酸乙酯為起始原料，經(jīng)(I)回流反應(yīng)；(2)低溫滴加氨乙醇反應(yīng)；(3)低溫滴加三氯化磷反應(yīng)；(4)萃取分離純化后加入細(xì)胞液中生物轉(zhuǎn)化為尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸，再經(jīng)純化干燥后得到純品。本發(fā)明中，其中所述的第一步回流反應(yīng)中，催化劑直接一次性加入。 本發(fā)明中，其中所述的第二步氨乙醇滴加反應(yīng)中，用低于-10°C溫度的氨乙醇加入。本發(fā)明中，其中所述的第二步反應(yīng)的溫度，控制在-3°c -5°c。本發(fā)明中，其中的第二步反應(yīng)結(jié)束后，先在0°C以下回收氨乙醇。本發(fā)明中，其中的萃取時(shí)先將冰塊加入反應(yīng)液，避免產(chǎn)熱過(guò)快，破壞產(chǎn)物。本發(fā)明中，其中的生物轉(zhuǎn)化后的產(chǎn)品經(jīng)陶瓷膜微濾或超濾后用模擬移動(dòng)色譜床或高速逆流色譜或柱層析純化。本發(fā)明中，其中所述的催化劑為三氟甲磺酸甲酯。本發(fā)明中，其中所述的回收氨乙醇的方法為在真空度大于-0.099MPa的高真空回
收氨乙醇。本發(fā)明中，其中所述的在回收氨乙醇后，回收甲醇，所述回收甲醇的方式為真空回收、薄膜蒸發(fā)或分子蒸餾，其中所述的真空回收的方式為采用羅茨真空泵及反應(yīng)釜機(jī)械密封技術(shù)真空度大于-0.099MPa的高真空回收甲醇。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是:與傳統(tǒng)提取方法相比，能極大地降低成本，提高得率，降低生產(chǎn)難度，從而有力促進(jìn)現(xiàn)代生物催化技術(shù)的發(fā)展。


圖1為本發(fā)明的流程圖。
具體實(shí)施例方式為使對(duì)本發(fā)明的結(jié)構(gòu)特征及所達(dá)成的功效有更進(jìn)一步的了解與認(rèn)識(shí)，用以較佳的實(shí)施例及附圖配合詳細(xì)的說(shuō)明，說(shuō)明如下:參見(jiàn)圖1，實(shí)施例1:`
向一號(hào)反應(yīng)釜內(nèi)加入四乙酰核糖20千克，用200千克四氫呋喃溶解，再加入煙酸乙酯10千克，直接加入三氟甲磺酸甲酯5千克。升溫至產(chǎn)生回流，有回流后開(kāi)始計(jì)時(shí)，反應(yīng)3小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，減壓回收溶劑，回收完畢后，加入150千克乙醇溶解。將150千克乙醇抽入到二號(hào)反應(yīng)釜中，開(kāi)冷凍降溫到_5°C。打開(kāi)液氨鋼瓶減壓閥門，開(kāi)始通氨，計(jì)量，通入10千克氨后，結(jié)束通氨。開(kāi)冷凍降溫到-10°C以下，得低溫氨乙醇。將低溫氨乙醇滴入一號(hào)反應(yīng)釜中，滴加完畢后，開(kāi)始計(jì)時(shí)，精確控制反應(yīng)溫度-3 0C -5 °C，反應(yīng)48小時(shí)。開(kāi)啟羅次真空泵，控制真空度大于-0.099MPa，在0°C以下減壓回收氨乙醇，回收完畢后，控制真空度大于-0.099MPa,在20 V以下減壓回收乙醇。回收完畢后，向釜內(nèi)投加150升亞磷酸二乙酯，開(kāi)始滴加三氯化磷20千克，滴加完畢后開(kāi)始計(jì)時(shí)，保持低溫反應(yīng)20小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，向反應(yīng)釜內(nèi)投加25千克冰塊，再加入150升亞磷酸二乙酯及200千克冰水，萃取出水層，柱層析純化。HPLC檢測(cè)，將相對(duì)含量為90%以上的尼克酰胺腺單核苷酸水溶液加入到全細(xì)胞發(fā)酵液中反應(yīng)24小時(shí)，陶瓷膜錯(cuò)流微濾除去固體，再上高速逆流色譜分離，納濾濃縮到200升，冷凍干燥得到尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸純品15.1千克。HPLC檢測(cè)，含量為97.3%。實(shí)施例2:向三號(hào)反應(yīng)釜內(nèi)加入四乙酰核糖100千克，用1000千克二氧六環(huán)溶解，再加入煙酸乙酯50千克，直接加入三氟甲磺酸甲酯25千克。升溫至產(chǎn)生回流，有回流后開(kāi)始計(jì)時(shí)，反應(yīng)3小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，減壓回收溶劑，回收完畢后，加入750千克乙醇溶解。將750千克乙醇抽入到四號(hào)反應(yīng)釜中，開(kāi)冷凍降溫到_5°C。打開(kāi)液氨鋼瓶減壓閥門，開(kāi)始通氨，計(jì)量，通入50千克氨后，結(jié)束通氨。開(kāi)冷凍降溫到-10°C以下，得低溫氨乙醇。將低溫氨乙醇滴入三號(hào)反應(yīng)釜中，滴加完畢后，開(kāi)始計(jì)時(shí)，精確控制反應(yīng)溫度_3°C -5°C，反應(yīng)48小時(shí)。開(kāi)啟羅次真空泵，控制真空度大于-0.099MPa,在0°C以下減壓回收氨乙醇，回收完畢后，用分子蒸餾設(shè)備在20°C以下回收乙醇?；厥胀戤吅螅蚋獌?nèi)投加750升二甲苯，開(kāi)始滴加三氯化磷100千克，滴加完畢后開(kāi)始計(jì)時(shí)，保持低溫反應(yīng)20小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，向反應(yīng)釜內(nèi)投加75千克冰塊，再加入750升二甲苯及1000千克冰水，萃取出水層，柱層析純化。HPLC檢測(cè)，將相對(duì)含量為90%以上的尼克酰胺腺單核苷酸水溶液加入到全細(xì)胞發(fā)酵液中發(fā)酵24小時(shí)，陶瓷膜錯(cuò)流微濾除去固體，再用模擬移動(dòng)色譜床分離，納濾濃縮到1000升，冷凍干燥得到尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸純品77.6千克。HPLC檢測(cè)，含量為98.2%。實(shí)施例3:向五號(hào)反應(yīng)爸內(nèi)加入四乙酰核糖200千克,用2000千克四氫呋喃溶解,再加入煙酸乙酯100千克，直接加入三氟甲磺酸甲酯50千克。升溫至產(chǎn)生回流，有回流后開(kāi)始計(jì)時(shí)，反應(yīng)3小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，減壓回收溶劑，回收完畢后，加入1500千克乙醇溶解。將1500千克乙醇抽入到六號(hào)反應(yīng)釜中，開(kāi)冷凍降溫到_5°C。打開(kāi)液氨鋼瓶減壓閥門，開(kāi)始通氨，計(jì)量，通入100千克氨后，結(jié)束通氨。開(kāi)冷凍降溫到-10°c以下，得低溫氨乙醇。將低溫氨乙醇滴入五號(hào)反應(yīng)釜中，滴加完畢后，開(kāi)始計(jì)時(shí)，精確控制反應(yīng)溫度-3°c -5°c，反應(yīng)48小時(shí)。開(kāi)啟羅次真空泵，控制真空度大于-0.099MPa，在0°C以下減壓回收氨乙醇，回收完畢后，用薄膜蒸發(fā)器在20°C以下減壓回收乙醇?；厥胀戤吅?，向釜內(nèi)投加1500升乙酸乙酯，開(kāi)始滴加三氯化磷200千克，滴加完畢后開(kāi)始計(jì)時(shí)，保持低溫反應(yīng)20小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，向反應(yīng)釜內(nèi)投加250千克冰塊，再加入1500升乙酸乙酯及2000千克冰水，萃取出水層，柱層析純化。HPLC檢測(cè)，將相對(duì)含量為90%以上的尼克酰胺腺單核苷酸水溶液加入到全細(xì)胞發(fā)酵液中反應(yīng)24小時(shí)，超濾除去固體，再上樹(shù)脂柱層析分離得到尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸，納濾濃縮到2000升，冷凍干燥得到尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸純品155.3千克。HPLC檢測(cè)，含量為98.1% ο本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是:與傳統(tǒng)提取方法相比，能極大地降低成本，提高得率，降低生產(chǎn)難度，從而有力促進(jìn)現(xiàn)代生物催化技術(shù)的發(fā)展，年創(chuàng)造收入五億元人民幣(以年產(chǎn)NAD5000千克，每千克10萬(wàn)元計(jì))，創(chuàng)利稅一億元人民幣。本發(fā)明以化學(xué)生物合成法代替?zhèn)鹘y(tǒng)的提取法，極大地提高了重要的生物催化酶NAD的生產(chǎn)能力，對(duì)世界生化研究制造的推進(jìn)有極為重要的意義。以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理、主要特征和本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)。本行業(yè)的技術(shù)人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實(shí)施例的限制，上述實(shí)施例和說(shuō)明書中描述的只是本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā) 明精神和范圍的前提下本發(fā)明還會(huì)有各種變化和改進(jìn)，這些變化和改進(jìn)都落入要求保護(hù)的本發(fā)明的范圍內(nèi)。本發(fā)明要求的保護(hù)范圍由所附的權(quán)利要求書及其等同物界定。
權(quán)利要求
1.一種化學(xué)生物法規(guī)?；苽淠峥缩０废汆堰识塑账岬姆椒ǎ运囊阴：颂?，煙酸乙酯為起始原料，經(jīng)(I)回流反應(yīng)；(2)低溫滴加氨乙醇反應(yīng)；(3)低溫滴加三氯化磷反應(yīng)；(4)萃取分離純化后加入細(xì)胞液中生物轉(zhuǎn)化為尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸，再經(jīng)純化干燥后得到純品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的規(guī)?；铣赡峥缩０废汆堰识塑账岬姆椒?，其中所述的第一步回流反應(yīng)中，催化劑直接一次性加入。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的規(guī)?；铣赡峥缩０废汆堰识塑账岬姆椒?，其中所述的第二步氨乙醇滴加反應(yīng)中，用低于-10°c溫度的氨乙醇加入。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的規(guī)?；铣赡峥缩０穯魏塑账岬姆椒ǎ渲兴龅牡诙椒磻?yīng)的溫度，控制在-3 0C -5V。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的規(guī)?；铣赡峥缩０废汆堰识塑账岬姆椒?，其中的第二步反應(yīng)結(jié)束后，先在o°c以下回收氨乙醇。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的規(guī)模化合成尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸的方法，其中的萃取時(shí)先將冰塊加入反應(yīng)液，避免產(chǎn)熱過(guò)快，破壞產(chǎn)物。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的規(guī)?；铣赡峥缩０废汆堰识塑账岬姆椒ǎ渲械纳镛D(zhuǎn)化后的產(chǎn)品經(jīng)陶瓷膜微濾或超濾后用模擬移動(dòng)色譜床或高速逆流色譜或柱層析純化。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的規(guī)模化合成尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸的方法，其特征在于:其中所述的催化劑為三氟甲磺酸甲酯。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的規(guī)?；铣赡峥缩０废汆堰识塑账岬姆椒?，其特征在于:其中所述的回收氨乙醇的方法為在真空度大于-0.099MPa的高真空回收氨乙醇?！?br> 10.根據(jù)權(quán)利要求1或5所述的規(guī)?；铣赡峥缩０废汆堰识塑账岬姆椒?，其特征在于:其中所述的在回收氨乙醇后，回收甲醇，所述回收甲醇的方式為真空回收、薄膜蒸發(fā)或分子蒸餾，其中所述的真空回收的方式為采用羅茨真空泵及反應(yīng)釜機(jī)械密封技術(shù)真空度大于-0.099MPa的高真空回收甲醇。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種化學(xué)生物合成法規(guī)?；苽淠峥缩０废汆堰识塑账岬姆椒?，以四乙酰核糖，煙酸乙酯為起始原料，經(jīng)(1)回流反應(yīng)；(2)低溫滴加氨乙醇反應(yīng)；(3)低溫滴加三氯化磷反應(yīng)；(4)萃取分離純化后加入細(xì)胞液中生物轉(zhuǎn)化為尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸，再經(jīng)純化干燥后得到純品。
文檔編號(hào)C12P19/36GK103233051SQ20121055512
公開(kāi)日2013年8月7日 申請(qǐng)日期2012年12月19日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月19日
發(fā)明者施自恩, 周少華, 林軍, 許康林 申請(qǐng)人:浙江嘉華化工有限公司