一種高分子量普魯蘭多糖的發(fā)酵生產(chǎn)方法
【專利摘要】一種高分子量普魯蘭多糖的發(fā)酵生產(chǎn)方法，其特征在于：發(fā)酵過程中通過控制培養(yǎng)基成分和發(fā)酵參數(shù)，發(fā)酵生產(chǎn)高分子量和超高分子量等不同分子量級(jí)別的普魯蘭多糖。本發(fā)明可以生產(chǎn)分子量為5萬-50萬的普通分子量普魯蘭多糖，還可以生產(chǎn)的50萬至150萬高分子量和150萬以上的超高分子量普魯蘭多糖，發(fā)明工藝簡(jiǎn)單易控制，成本低。
【專利說明】—種局分子量普魯蘭多糖的發(fā)酵生產(chǎn)方法
[0001]【技術(shù)領(lǐng)域】
本發(fā)明涉及一種通過控制發(fā)酵條件來生產(chǎn)不同分子量普魯蘭多糖的方法，屬于生物工程領(lǐng)域。
[0002]【背景技術(shù)】
普魯蘭多糖(Pullulan)中文亦譯為茁霉多糖、出芽短梗孢糖、普聚多糖或普魯蘭糖。它是出芽孢梗霉產(chǎn)生的胞外多糖，以α -1, 6-糖苷鍵結(jié)合麥芽糖構(gòu)成同型多糖為主，即葡萄糖按α-1，4_糖苷鍵結(jié)合成麥芽三糖，兩端再以α- 1，6-糖苷鍵同另外的麥芽三糖結(jié)合，如此反復(fù)連接而成高分子多糖。α-1，4_糖苷鍵同α-1，6_糖苷鍵的比例為2:1，聚合度(D.P)為100 — 5000，分子量5萬一 200萬。普魯蘭多糖的應(yīng)用跟其分子量有直接關(guān)系，用于食品保鮮成膜的普魯蘭多糖分子量在20萬Dal以上，用于膠囊制備的普魯蘭多糖分子量為30萬Dal以上，用于食品增稠的普魯蘭多糖分子量在50萬Dal以上，故生產(chǎn)高分子量的普魯蘭多糖可以大大拓展普魯蘭多糖應(yīng)用領(lǐng)域，提高產(chǎn)品附加值。
[0003]微生物發(fā)酵是普魯蘭多糖主要的生產(chǎn)方法，關(guān)于普魯蘭多糖的發(fā)酵生產(chǎn)方法也有很多報(bào)道。專利97121608.8公開的一種發(fā)酵生產(chǎn)普魯蘭的新方法，生產(chǎn)的普魯蘭多糖平均分子量為10萬道爾頓；專利200810052070.6公開的一種生產(chǎn)普魯蘭多糖的發(fā)酵方法得到分子量20-60萬道爾頓之間的普魯蘭多糖；專利200910148764.4公開了一種生產(chǎn)不同分子量普魯蘭多糖的方法，通過調(diào)節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基中有機(jī)氮源和無機(jī)氮源的濃度能夠生產(chǎn)平均分子量在8萬-48萬之間的普魯蘭多糖。從這些及其他已公開的普魯蘭多糖生產(chǎn)方法的報(bào)道中，生產(chǎn)的普魯蘭多糖的分子量都較低，均在60萬道爾頓以下，而且分子量分布范圍寬，極大限制了普魯蘭多糖的生產(chǎn) 和應(yīng)用。
[0004]本發(fā)明通過調(diào)節(jié)培養(yǎng)基中磷酸鹽的濃度和初始pH，使發(fā)酵液的pH在發(fā)酵后期穩(wěn)定在2.3-3.5之間，控制不同的磷酸鹽的濃度和初始pH，可以得到分子量從50萬到200萬的普魯蘭多糖，提供了一種高分子量普魯蘭多糖的生產(chǎn)方法，而且工藝簡(jiǎn)單、成本低、效率聞。
[0005]
【發(fā)明內(nèi)容】

一種高分子量普魯蘭多糖的生產(chǎn)方法，其實(shí)施步驟如下:
(1)種子培養(yǎng):挑取一環(huán)出芽短梗霉孢子到液體種子培養(yǎng)基中，種子培養(yǎng)基組成為蔗糖50.0g/L、酵母浸出物2.0g/L、磷酸氫二鉀6.3g/L、氯化鈉1.0g/L、硫酸鎂0.2g/L、硫酸銨
0.6g/L，調(diào)節(jié) pH 至 6.5，28°C 培養(yǎng) 24_48h ；
(2)發(fā)酵培養(yǎng):按3%-10%接種量將培養(yǎng)好的種子接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為:蔗糖100.0g/L、酵母浸出物2.0g/L、硫酸銨0.6g/L、硫酸鎂0.2g/L、磷酸鹽0-0.lmol/L,其中磷酸鹽包括磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、磷酸氫二銨、磷酸二氫銨、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉等，初始PH 3.5-6.5，培養(yǎng)溫度28°C，培養(yǎng)12h后發(fā)酵液pH降至2.3-3.5之間，繼續(xù)培養(yǎng)36-48h后結(jié)束發(fā)酵；
(3)發(fā)酵液后處理:發(fā)酵液經(jīng)過濾除菌、酒精沉淀、干燥，即可得到白色的普魯蘭多糖產(chǎn)
品O[0006]在發(fā)酵培養(yǎng)過程中，通過減少磷酸鹽的含量和降低發(fā)酵液初始pH，從而使發(fā)酵后期發(fā)酵液PH維持在比較低的條件下，改變細(xì)胞合成和分泌普魯蘭多糖的能力，生產(chǎn)高分子
量的普魯蘭多糖。
[0007]本發(fā)明工藝簡(jiǎn)單，控制容易，周期短，成本低，能夠獲得各種預(yù)期的分子量普魯蘭多糖，滿足不同的需求，生產(chǎn)一系列的普魯蘭多糖產(chǎn)品，為高分子量普魯蘭多糖的生產(chǎn)提供了一種新方法，具有極大的工業(yè)化潛質(zhì)。
[0008]【具體實(shí)施方式】
以下結(jié)合具體實(shí)例對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案及其使用效果作進(jìn)一步描述，但不局限于這些實(shí)例。 [0009]實(shí)施例一、
(1)挑取一環(huán)出芽短梗霉孢子到液體種子培養(yǎng)基中，種子培養(yǎng)基組成為蔗糖50.0g/L、酵母浸出物2.0g/L、磷酸氫二鉀6.3g/L、氯化鈉1.0g/L、硫酸鎂0.2g/L、硫酸銨0.6g/L，調(diào)節(jié) pH 至 6.5，28°C培養(yǎng) 24h ；
(2)配置發(fā)酵培養(yǎng)基，組成為蔗糖100.0g/L、酵母浸出物2.0g/L、硫酸銨0.6g/L、硫酸鎂0.2g/L、磷酸氫二鉀0.lmol/L,調(diào)節(jié)pH至3.5，121°C滅菌20min后，按3%接種量接種種子培養(yǎng)液，28°C培養(yǎng)，12h后培養(yǎng)基pH降至2.4左右并穩(wěn)定在2.4左右，48h后結(jié)束發(fā)酵，發(fā)酵液粘度為2IOOmpas ；
(3)將發(fā)酵液稀釋一倍，板框過濾除去菌體，濾液精酒精沉淀、烘干，得到顏色潔白的普魯蘭多糖產(chǎn)品，平均分子量為220萬道爾頓。
[0010]實(shí)施例二、
(1)種子培養(yǎng)同一；
(2)配置發(fā)酵培養(yǎng)基，組成為蔗糖100.0g/L、酵母浸出物2.0g/L、硫酸銨0.6g/L、硫酸鎂0.2g/L、磷酸氫二鈉0.05mol/L,調(diào)節(jié)pH至4.0，121°C滅菌20min后，按3%接種量接種種子培養(yǎng)液，28°C培養(yǎng)，12h后培養(yǎng)基pH降至2.6左右并穩(wěn)定在2.6左右，48h后結(jié)束發(fā)酵，發(fā)酵液粘度為1800mpas ；
(3)將發(fā)酵液稀釋一倍，板框過濾除去菌體，濾液精酒精沉淀、烘干，得到顏色潔白的普魯蘭多糖產(chǎn)品，平均分子量為160萬道爾頓。
[0011]實(shí)施例三、
(1)種子培養(yǎng)同一；
(2)配置發(fā)酵培養(yǎng)基，組成為蔗糖100.0g/L、酵母浸出物2.0g/L、硫酸銨0.6g/L、硫酸鎂0.2g/L、磷酸二氫鉀0.05mol/L,調(diào)節(jié)pH至5.0，121°C滅菌20min后，按3%接種量接種種子培養(yǎng)液，28°C培養(yǎng)，12h后培養(yǎng)基pH降至2.8左右并穩(wěn)定在2.8左右，42h后結(jié)束發(fā)酵，發(fā)酵液粘度為HOOmpas ；
(3)將發(fā)酵液稀釋一倍，板框過濾除去菌體，濾液精酒精沉淀、烘干，得到顏色潔白的普魯蘭多糖產(chǎn)品，平均分子量為120萬道爾頓。
[0012]實(shí)施例四、
(1)種子培養(yǎng)同一；
(2)配置發(fā)酵培養(yǎng)基，組成為蔗糖100.0g/L、酵母浸出物2.0g/L、硫酸銨0.6g/L、硫酸鎂0.2g/L、磷酸二氫鈉0.lmol/L,調(diào)節(jié)pH至6.0,121°C滅菌20min后，按3%接種量接種種子培養(yǎng)液，28°C培養(yǎng)， 12h后培養(yǎng)基pH降至3.2左右并穩(wěn)定在3.2左右，42h后結(jié)束發(fā)酵，發(fā)酵液粘度為400mpas ；
(3)將發(fā)酵液稀釋一倍，板框過濾除去菌體，濾液精酒精沉淀、烘干，得到顏色潔白的普魯蘭多糖產(chǎn)品，平均分子量為80萬道爾頓。
【權(quán)利要求】
1.一種高分子量普魯蘭多糖的發(fā)酵生產(chǎn)方法，其特征在于，實(shí)施步驟如下: (1)種子液的制備:配制種子培養(yǎng)基，其組成為蔗糖50.0g/L、酵母浸出物2.0g/L、磷酸氫二鉀6.3g/L、氯化鈉1.0g/L、硫酸鎂0.2g/L、硫酸銨0.6g/L，調(diào)節(jié)pH至6.5，121。。滅菌，20min，接入一環(huán)出芽短梗霉菌種，220rpm、28°C震蕩培養(yǎng)24_48h，作為種子液； (2)發(fā)酵培養(yǎng):配置發(fā)酵培養(yǎng)基，其組成為蔗糖100.0g/L、酵母浸出物2.0g/L、磷酸鹽，0-0.lmol/L、氯化鈉1.0g/L、硫酸鎂0.2g/L、硫酸銨0.6g/L,調(diào)節(jié)pH至適當(dāng)值，121。。滅菌，20min，按3%-10%接種量接入種子液，攪拌轉(zhuǎn)速為200-500rpm，通氣量為0.5_5vvm，培養(yǎng)溫度 28 ± I °C，罐壓 0.05-0.1Mpa,發(fā)酵培養(yǎng) 48_72h ； (3)分離精制:發(fā)酵結(jié)束，發(fā)酵液經(jīng)過濾除菌后，加入2倍體積乙醇沉淀，沉淀經(jīng)干燥、粉碎，得到不同分子量的普魯蘭多糖產(chǎn)品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高分子量普魯蘭多糖的發(fā)酵生產(chǎn)方法，其特征在于:發(fā)酵培養(yǎng)基中的磷酸鹽為磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉中的一種或幾種。
3.根據(jù)權(quán)利要求1、2所述的一種高分子量普魯蘭多糖的發(fā)酵生產(chǎn)方法，其特征在于:培養(yǎng)基中磷酸鹽的含量在0-0.1 mo I/L之間。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高分子量普魯蘭多糖的發(fā)酵生產(chǎn)方法，其特征在于:調(diào)節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基的初始PH在3.0-6.5之間。
5.根據(jù)權(quán)利要求1、3、4所述的一種高分子量普魯蘭多糖的發(fā)酵生產(chǎn)方法，其特征在于:通過控制發(fā)酵培養(yǎng)基磷酸鹽的含量和初始PH，使發(fā)酵培養(yǎng)12h后，發(fā)酵液PH穩(wěn)定在，2.5-4.5之間，pH越低，產(chǎn)品 分子量 越高。
【文檔編號(hào)】C12R1/645GK103882076SQ201210555219
【公開日】2014年6月25日 申請(qǐng)日期:2012年12月20日 優(yōu)先權(quán)日:2012年12月20日
【發(fā)明者】王林, 蘇移山, 朱希強(qiáng), 朱云峰, 李偉, 凌沛學(xué) 申請(qǐng)人:山東福瑞達(dá)生物科技有限公司