專利名稱：3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)丁酸甲酯的生物制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物制藥和綠色化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種3-氨基-4-(2，4，5-三氟苯基)丁酸甲酯的生物制備方法。
背景技術(shù)：
生物催化具有明顯的綠色、高效和經(jīng)濟等特點。利用轉(zhuǎn)氨酶選擇性將酮基轉(zhuǎn)化為氨基，是最重要的生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)之一。轉(zhuǎn)氨酶(transaminase, amino transferase)是用于合成手性氨或氨基 酸的一類酶。其中β_氨基酸類物質(zhì)在藥物合成中的應(yīng)用十分廣泛，可以用于合成一系列二肽肽酶-1V抑制劑，是重要的抗腫瘤、抗感染和治療代謝紊亂的藥物(Pharmacol. 2004, 404:239, BMC Endocr. Disord. 2008，8:14)。在利用生物轉(zhuǎn)化的方法制備氨基酸類物質(zhì)的兩種主要選擇中，相較于步驟繁瑣，收率較低的酶拆分法(Org.Biomol. Chem. 2010，8:793-799，產(chǎn)物收率42%，光學(xué)純度96%)，利用轉(zhuǎn)氨酶直接合成的方法具有十分明顯的優(yōu)越性。而在利用化學(xué)合成方法合成該類物質(zhì)的報道中，其收率較低(68%)，而且需要在高壓和氫氣、釕金屬催化劑存在的條件下反應(yīng)，安全性和環(huán)境友好性較差(Bioorg. Med. Chem. Lett. 2007, 17: 2622)。利用轉(zhuǎn)氨酶進行生物轉(zhuǎn)化的報道中，Codexis公司的Savile等人改造并利用來自節(jié)桿菌的轉(zhuǎn)氨酶ATA-117，催化1-(3-(三氟甲基)-5，6-二氫-[1，2，4]三唑[4，3_a]批嗪_7 (8H)-基)-4-(2, 4, 5- 二氟苯基)丁燒-1，3- 二酮轉(zhuǎn)化為3-氨基-1-(3-( 二氟甲基)-5,6-二氫-[1，2，4]三唑[4, 3-a]吡嗪 _7 (8H)-基)-4-(2，4，5-三氟苯基)丁烷-1-酮，即Merck公司的治療糖尿病藥物西他列汀(Sitagliptin，商品名JANUVIA)是利用轉(zhuǎn)氨酶進行生物轉(zhuǎn)化的優(yōu)秀實例(Science2010，329:305)。3-羰基_4-(2，4，5-三氟苯基)丁酸甲酯是上述反應(yīng)的模型底物之一，也是重要的潛在手性藥物前體。但是，到目前為止，還未有利用轉(zhuǎn)氨酶將3-羰基-4- (2，4，5-三氟苯基)丁酸甲酯轉(zhuǎn)化為3-氨基-4-(2，4，5-三氟苯基)丁酸甲酯的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種利用重組轉(zhuǎn)氨酶將3-羰基_4-(2，4，5-三氟苯基)丁酸甲酯轉(zhuǎn)化為3-氨基-4-(2，4，5-三氟苯基)丁酸甲酯的生物制備方法。為解決以上技術(shù)問題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案一種3-氨基-4-(2，4，5_三氟苯基)丁酸甲酯的生物制備方法，其以3_羰基-4-(2，4，5-三氟苯基)丁酸甲酯為底物，該底物在生物催化劑、輔因子、氨基供體和助溶劑的存在下發(fā)生反應(yīng)生成目標(biāo)產(chǎn)物3-氨基-4-(2，4，5-三氟苯基)丁酸甲酯，所述的生物催化劑為重組轉(zhuǎn)氨酶，所述的重組轉(zhuǎn)氨酶的制備方法為將含有轉(zhuǎn)氨酶的單菌落接種到含卡那霉素抗性的液體LB培養(yǎng)基中，于35-40°C下活化8-12小時，將活化后得到的培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接到含卡那霉素抗性的液體LB培養(yǎng)基中，于35-40°C下擴大培養(yǎng)至0D600值達到O. 6-0. 8，加入誘導(dǎo)劑，于25-35°C繼續(xù)培養(yǎng)8-12小時，離心，收集沉淀物，加入磷酸鹽緩沖液得到懸浮液，將懸浮液置于冰浴中超聲波破碎8-12分鐘，再離心，將上清液預(yù)凍至溫度為-1(T-25°C，然后再凍干24-48小時，即得重組轉(zhuǎn)氨酶，所述的反應(yīng)在pH為6. 0-9. O的水相緩沖液中進行。進一步地，在起始時的反應(yīng)體系中，所述的重組轉(zhuǎn)氨酶所述的輔因子所述的氨基供體所述的3-羰基-4-(2，4，5-三氟苯基)丁酸甲酯的質(zhì)量比為O. 4-0. 6 :0. 01-0.1 5-7 :1。優(yōu)選地，所述的誘導(dǎo)劑為異丙基_β-D-硫代半乳糖苷或乳糖。優(yōu)選地，所述的輔因子為磷酸吡哆醛。優(yōu)選地，所述的氨基供體為異丙胺。優(yōu)選地，所述的助溶劑為二甲基亞砜。優(yōu)選地，所述的水相緩沖液為磷酸鹽緩沖液、Tris-HCl緩沖溶液或三乙醇胺鹽酸緩沖溶液。優(yōu)選地，所述的反應(yīng)在pH為7. O的水相緩沖液中進行。進一步地，所述的制備方法的實施過程如下在反應(yīng)容器中依次加入所述的水相緩沖液、底物3-羰基-4-(2，4，5-三氟苯基)丁酸甲酯、所述的氨基供體、所述的助溶劑、所述的輔因子和所述的重組轉(zhuǎn)氨酶，攪拌均勻，在25-45°C和氮氣吹掃的條件下反應(yīng)，利用HPLC檢測反應(yīng)進程，待轉(zhuǎn)化率達90-99%時，調(diào)節(jié)pH至2_3，硅藻土過濾，在濾液中加入乙酸乙酯進行多次萃取，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)蒸發(fā)脫去溶劑，即得3-氨基-4- (2，4，5-三氟苯基)丁酸甲酯產(chǎn)品。根據(jù)本發(fā)明，除重組轉(zhuǎn)氨酶外，其余原料均可由通用渠道商購獲得。本發(fā)明的有益效果在于本發(fā)明首次實現(xiàn)了采用重組轉(zhuǎn)氨酶將3-羰基-4- (2，4，5-三氟苯基)丁酸甲酯轉(zhuǎn)化為3-氨基-4-(2，4，5-三氟苯基)丁酸甲酯，與傳統(tǒng)的化學(xué)法相比，本發(fā)明能耗低，操作簡單方便，副產(chǎn)物少，并且產(chǎn)物的光學(xué)活性較高。
具體實施例方式本發(fā)明的反應(yīng)式如下
權(quán)利要求
1.一種3-氨基-4-(2，4，5-三氟苯基)丁酸甲酯的生物制備方法，其特征在于其以3-羰基-4-(2，4，5-三氟苯基)丁酸甲酯為底物，該底物在生物催化劑、輔因子、氨基供體和助溶劑的存在下發(fā)生反應(yīng)生成目標(biāo)產(chǎn)物3-氨基-4-(2，4，5-三氟苯基)丁酸甲酯，所述的生物催化劑為重組轉(zhuǎn)氨酶，所述的重組轉(zhuǎn)氨酶的制備方法為將含有轉(zhuǎn)氨酶的單菌落接種到含卡那霉素抗性的液體LB培養(yǎng)基中，于35-40°C下活化8-12小時，將活化后得到的培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接到含卡那霉素抗性的液體LB培養(yǎng)基中，于35-40°C下擴大培養(yǎng)至0D600值達到O.6-0. 8，加入誘導(dǎo)劑，于25-35°C繼續(xù)培養(yǎng)8-12小時，離心，收集沉淀物，加入磷酸鹽緩沖液得到懸浮液，將懸浮液置于冰浴中超聲波破碎8-12分鐘，再離心，將上清液預(yù)凍至溫度為-1(T-25°C，然后再凍干24-48小時，即得重組轉(zhuǎn)氨酶，所述的反應(yīng)在pH為6. 0-9. O的水相緩沖液中進行。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的3-氨基-4-(2，4，5-三氟苯基)丁酸甲酯的生物制備方法，其特征在于在起始時的反應(yīng)體系中，所述的重組轉(zhuǎn)氨酶所述的輔因子所述的氨基供體所述的3-羰基-4-(2，4，5-三氟苯基)丁酸甲酯的質(zhì)量比為O. 4-0. 6 :0. 01-0.1 :5_7 Io
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的3-氨基-4-(2，4，5-三氟苯基)丁酸甲酯的生物制備方法，其特征在于所述的誘導(dǎo)劑為異丙基-β -D-硫代半乳糖苷或乳糖。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的3-氨基-4-(2，4，5-三氟苯基)丁酸甲酯的生物制備方法，其特征在于所述的輔因子為磷酸吡哆醛。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的3-氨基-4-(2，4，5-三氟苯基)丁酸甲酯的生物制備方法，其特征在于所述的氨基供體為異丙胺。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的3-氨基-4-(2，4，5-三氟苯基)丁酸甲酯的生物制備方法，其特征在于所述的助溶劑為二甲基亞砜。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的3-氨基-4-(2，4，5-三氟苯基)丁酸甲酯的生物制備方法，其特征在于所述的水相緩沖液為磷酸鹽緩沖液、Tris-HCl緩沖溶液或三乙醇胺鹽酸緩沖溶液。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的3-氨基-4-(2，4，5-三氟苯基)丁酸甲酯的生物制備方法，其特征在于所述的反應(yīng)在pH為6. 0-9. O的水相緩沖液中進行。
9.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的3-氨基-4-(2，4，5_三氟苯基)丁酸甲酯的生物制備方法，其特征在于所述的制備方法的實施過程如下在反應(yīng)容器中依次加入所述的水相緩沖液、底物3-羰基-4-(2，4，5-三氟苯基)丁酸甲酯、所述的氨基供體、所述的助溶劑、所述的輔因子和所述的重組轉(zhuǎn)氨酶，攪拌均勻，在25 45°C和氮氣吹掃的條件下反應(yīng)，利用HPLC檢測反應(yīng)進程，待轉(zhuǎn)化率達9(Γ99%時，調(diào)節(jié)pH至2_3，硅藻土過濾，在濾液中加入乙酸乙酯進行多次萃取，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)蒸發(fā)脫去溶劑，即得3-氨基-4- (2，4，5-三氟苯基)丁酸甲酯女口廣叩ο
全文摘要
一種3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)丁酸甲酯的生物制備方法，其以3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)丁酸甲酯為底物，該底物在生物催化劑、輔因子、氨基供體和助溶劑的存在下發(fā)生反應(yīng)生成目標(biāo)產(chǎn)物3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)丁酸甲酯，所述的生物催化劑為重組轉(zhuǎn)氨酶，所述的反應(yīng)在pH為6.0-9.0的水相緩沖液中進行。本發(fā)明首次實現(xiàn)了采用重組轉(zhuǎn)氨酶將3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)丁酸甲酯轉(zhuǎn)化為3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)丁酸甲酯，與傳統(tǒng)的化學(xué)法相比，本發(fā)明能耗低，操作簡單方便，副產(chǎn)物少，并且產(chǎn)物的光學(xué)活性較高。
文檔編號C12N9/10GK103014081SQ201210555608
公開日2013年4月3日 申請日期2012年12月19日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月19日
發(fā)明者樂庸堂, 鞠鑫 申請人:蘇州漢酶生物技術(shù)有限公司