專利名稱：環(huán)磷酰胺抗腫瘤藥物敏感度檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種分子生物技術(shù)領(lǐng)域的檢測(cè)方法包括引物、探針及其試劑盒， 具體是一種用于環(huán)磷酰胺抗腫瘤藥物敏感度檢測(cè)的方法，針對(duì)環(huán)磷酰胺藥物使用者基因內(nèi) 4個(gè)生物標(biāo)記的引物、探針及其試劑盒。
背景技術(shù)：
化療，即用化學(xué)合成藥物治療疾病的方法，目前，化療仍然是對(duì)抗癌癥的主要武器，腫瘤化學(xué)治療的藥物品種有幾十種，而且不斷有新的更有效的化療藥物面世，相對(duì)于其他疾病，腫瘤臨床治療的有效率目前仍然偏低；在臨床中，發(fā)現(xiàn)常規(guī)的化學(xué)治療會(huì)對(duì)一部分患者無(wú)效，其結(jié)果自然是很多患者不得不承受化療副作用的折磨和承擔(dān)高額的醫(yī)療費(fèi)用， 因此，對(duì)于每個(gè)腫瘤患者的個(gè)性化治療就顯得非常重要，個(gè)體化治療已經(jīng)成為腫瘤臨床治療的發(fā)展方向和最有效的手段。
近年來(lái)國(guó)內(nèi)外腫瘤和化療藥物研究領(lǐng)域相繼創(chuàng)建了一系列體內(nèi)或體外預(yù)測(cè)腫瘤化療藥物敏感性的方法，常用的有裸鼠皮下移植藥敏測(cè)定法、人體腫瘤細(xì)胞集落測(cè)定法、放射性標(biāo)記代謝物前體摻入法、MTT比色、三磷酸腺苷法和快速熒光分析等等，這些方法均存在一些缺點(diǎn)，要么費(fèi)用昂貴且檢測(cè)周期長(zhǎng)，不適合常規(guī)使用；要么需要在體外培養(yǎng)原發(fā)腫瘤，檢測(cè)成功率低，這些缺陷把腫瘤化療藥敏實(shí)驗(yàn)限制在了研究性的實(shí)驗(yàn)室里，很少有大規(guī)模使用的報(bào)道。
隨著人類基因組學(xué)、藥物基因組學(xué)及腫瘤分子生物學(xué)研究的不斷深入和發(fā)展，人們對(duì)腫瘤藥物的作用機(jī)理和作用過(guò)程有了更深刻的認(rèn)識(shí)，有了這些知識(shí)，使得通過(guò)基因分析來(lái)對(duì)癌癥患者進(jìn)行個(gè)性化治療成為可能，更為從分子水平研制和開發(fā)新一代的，針對(duì)藥物敏感性進(jìn)行檢測(cè)的方法提供了理論基礎(chǔ)和大量的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)；實(shí)驗(yàn)證明，個(gè)體基因水平上的差異，包括基因多態(tài)性、基因突變和表達(dá)差異等，與腫瘤患 者對(duì)藥物的敏感性密切相關(guān)， 通過(guò)檢測(cè)患者在這些基因上與藥物敏感性相關(guān)的生物標(biāo)記，可以預(yù)測(cè)患者對(duì)腫瘤化療藥物的敏感性，幫助進(jìn)一步指導(dǎo)選擇合理的化療方案。
環(huán)磷酰胺(Cyclophosphamide, CTX),是一類應(yīng)用最廣泛的雙功能燒化劑類抗癌藥物，CTX是一種前體藥物，需在體內(nèi)經(jīng)肝微粒體CYPs羥化(主要由CYP2B6、CYP3A4/3A5 和CYP2C9催化)，生成4-0H-CTX后進(jìn)入循環(huán)并分布至組織，在細(xì)胞內(nèi)4-0H-CTX與醛磷酸胺共存并達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡；而醛酰胺不穩(wěn)定，在腫瘤細(xì)胞內(nèi)分解成酰胺氮芥及丙烯醛，酰胺氮芥對(duì)腫瘤細(xì)胞有細(xì)胞毒作用，環(huán)磷酰胺是雙功能烷化劑及細(xì)胞周期非特異性藥物，可干擾 DNA及RNA功能，尤以對(duì)前者的影響更大，它與DNA發(fā)生交叉聯(lián)結(jié)，抑制DNA合成，對(duì)S期作用最明顯。
人體內(nèi)代謝藥物的主要酶是細(xì)胞色素P450超家族(Cytochrome P450 proteins, CYP)，它們是一類主要存在于肝臟、腸道中的單加氧酶，多位于細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，催化多種內(nèi)、外源物質(zhì)的(包括大多數(shù)臨床藥物)代謝；研究人員發(fā)現(xiàn)CYP基因上的幾個(gè)SNP多態(tài)性位點(diǎn)與環(huán)磷酰胺藥物敏感性密切相關(guān)，CYP2C9、CYP2C19、CYP2B6基因編碼的蛋白都屬于細(xì)胞色素P450酶，它們與抗癌藥物環(huán)磷酰胺的羥化等代謝過(guò)程相關(guān)，因此CYP2C9、 CYP2C19、CYP2B6的基因變化導(dǎo)致個(gè)體對(duì)環(huán)磷酰胺藥物的敏感性不同，通過(guò)設(shè)計(jì)試劑盒，檢測(cè)CYP2C9、CYP2C19、CYP2B6基因上的多個(gè)SNP生物標(biāo)記，可以方便、快速的預(yù)測(cè)環(huán)磷酰胺藥物對(duì)患者個(gè)體的療效。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是利用SNP標(biāo)記檢測(cè)方便快捷，準(zhǔn)確率高的優(yōu)點(diǎn)，采用Sequenom檢測(cè)技術(shù)，提供一種用于環(huán)磷酰胺抗腫瘤藥物敏感度檢測(cè)的方法，包括PCR引物、延伸引物和試劑盒。
本發(fā)明涉及一種用于環(huán)磷酰胺抗腫瘤藥物敏感度檢測(cè)的方法，其中包括PCR擴(kuò)增引物，含有SEQ ID No.1 4所示的上游引物和SEQ ID No. 5 8所示的下游引物。
本發(fā)明涉及一種用于環(huán)磷酰胺抗腫瘤藥物敏感度檢測(cè)的方法，其中包括單堿基延伸引物，含有SEQ ID No. 9 12所示的單堿基延伸引物。
本發(fā)明設(shè)計(jì)一種試劑盒，由PCR擴(kuò)增試劑組、SAP酶試劑組和iPLEX試劑組構(gòu)成， 其中PCR擴(kuò)增試劑組含有PCR緩沖液、MgCl2、dNTP混合液、Hotstar Taq酶、純水和如SEQ ID No.1所示的上游引物和如SEQ ID No. 5 8所示的下游引物；SAP酶試劑組含有SAP 緩沖液、SAP酶和純水；iPLEX試劑組含有iPLEX緩沖液、ddNTP混合液、iPLEX聚合酶、純水和如SEQ ID No. 9 12所示的單堿基延伸引物。
上述標(biāo)記組合優(yōu)選利用飛行質(zhì)譜(MALD1-T0F)方法進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)方法包括以下步驟(I)提取基因組DNA，包括提取抗凝血DNA和口腔上皮細(xì)胞DNA ;(2)飛行質(zhì)譜檢測(cè)SNP 多態(tài)；(3)根據(jù)SNP分型結(jié)果推斷環(huán)磷酰胺藥物敏感度。
本發(fā)明對(duì)CYP2C9、CYP2C19、CYP2B6基因上的共4個(gè)SNP生物標(biāo)記進(jìn)行分型，建立了一個(gè)快速，簡(jiǎn)便，且成本低廉的檢測(cè)試劑盒，該試劑盒準(zhǔn)確度高，靈敏性好，具有很強(qiáng)的實(shí)用價(jià)值。具體實(shí)施案例以下施例，對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式
進(jìn)行詳細(xì)描述，實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍；實(shí)施例1:采用飛行質(zhì)譜方法對(duì)腫瘤患者進(jìn)行SNP分型及環(huán)磷酰胺藥物敏感度檢測(cè)方法一)提取基因組DNA :本試驗(yàn)的樣本是使用刮棒采集的口腔粘膜細(xì)胞，室溫保存，刮棒采樣DNA提取的具體步驟如下1)將口腔刮棒上的脫落細(xì)胞溶于400μ L IX裂解液中，加入IyL蛋白酶Κ，56度水浴 30分鐘；2)取出樣品置冰水浴1分鐘，加入6mol/LNaCl 150 μ L，劇烈振蕩15-20秒，13000轉(zhuǎn)離心10分鐘；3)吸取上清液至新的離心管中，加入1.1mL無(wú)水乙醇，上下顛倒10次至絮狀DNA沉淀出現(xiàn)。室溫放置10分鐘，13000轉(zhuǎn)離心2分鐘沉淀DNA ；4)棄去上清液，再加入O.25mL70%乙醇洗滌DNA沉淀，室溫放置I分鐘后，13000轉(zhuǎn)離心5分鐘；5)用移液器小心吸取乙醇，然后放入通風(fēng)櫥中通風(fēng)10分鐘，然后用35μ L TE溶解DNA ；6) DNA可在4度保存1-2個(gè)月，或者存放在-20度長(zhǎng)期保存；
7)使用18MLPCR Master Mix反應(yīng)液以及2ML DNA模板，PCR擴(kuò)增P-actin片斷，1. 5%瓊脂糖凝膠，120V電泳15分鐘，觀察結(jié)果合格后轉(zhuǎn)移至PCR管中；
8)紫外分光光度計(jì)SMA3000測(cè)定溶 液中DNA的濃度和A260/A280比值，測(cè)量3次取平均值，濃度應(yīng)在30ng/ii L，A260/A280比值應(yīng)該在1. 7-2. 0之間，合格的DNA 4°C取用或_20°C保存；
二)飛行質(zhì)譜檢測(cè)SNP多態(tài)采用本發(fā)明中所述試劑盒對(duì)樣本中的SNP生物標(biāo)記進(jìn)行檢測(cè)，下面為檢測(cè)過(guò)程
1)引物與DNA稀釋以及質(zhì)檢PCR引物稀釋至終濃度為0.5 ii M ;根據(jù)Sequenom的稀釋公式，按照單堿基延伸引物的分子量將引物稀釋至終濃度為7-14 之間；
2)PCR擴(kuò)增在每個(gè)384孔PCR板中加入Iy L DNA和4 y L PCR擴(kuò)增試劑，共5 y L，按照PCR儀程序I進(jìn)行擴(kuò)增
PCR 程序 1:94°C 15min
權(quán)利要求
1.一種用于環(huán)磷酰胺抗腫瘤藥物敏感度檢測(cè)的PCR擴(kuò)增引物，其特征在于，包含SEQID No.1 4所示的上游引物和SEQ ID No. 5 8所示的下游引物。
2.一種用于環(huán)磷酰胺抗腫瘤藥物敏感度檢測(cè)的引物單堿基延伸引物，其特征在于，包含SEQ ID No. 9 12所示的單堿基延伸引物。
3.一種用于環(huán)磷酰胺抗腫瘤藥物敏感度檢測(cè)的方法，其特征在于，由PCR擴(kuò)增試劑組、SAP試劑組、iPLEX試劑組構(gòu)成，包括 1)PCR擴(kuò)增試劑組含有PCR緩沖液、MgCl2, dNTP混合液、Hotstar Taq酶、純水和如SEQ ID No.1 4所示的上游引物和如SEQ ID No. 5 8所示的下游引物； 2)SAP酶試劑組含有SAP緩沖液、SAP酶和純水； 3)iPLEX試劑組含有iPLEX緩沖液、ddNTP混合液、iPLEX聚合酶、純水和如SEQ IDNo. 9 12所示的單堿基延伸引物。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法制造系列試劑盒包括 1)根據(jù)權(quán)利要求3所述方法制造的試劑盒，所述的PCR擴(kuò)增緩沖液為IOX緩沖液，含2mM MgCl2 ；2)根據(jù)權(quán)利要求3所述方法制造的試劑盒，其特征是，所述的MgCl2濃度為2mM； 3)根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法制造試劑盒，其特征是，所述的dNTP混合液的濃度為·500 u M ；4)根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法制造試劑盒，其特征是，所述的HotstarTaq酶為0. 5U ； 5)根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法制造試劑盒，其特征是，所述的SAP緩沖液為IOX緩沖液； 6)根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法制造試劑盒，其特征是，所述的SAP酶為1.7 U/y L的蝦堿性磷酸酶； 7)根據(jù)權(quán)利要求3所述方法制造的試劑盒，其特征是，所述的iPLEX緩沖液IOX緩沖液； 8)根據(jù)權(quán)利要求3所述方法制造的試劑盒，其特征是，所述的ddNTP混合液為經(jīng)過(guò)質(zhì)量修飾的核苷酸； 9)根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法制造試劑盒，其特征是，所述的單堿基延伸酶為iPLEX聚合酶。
全文摘要
一種分子生物技術(shù)領(lǐng)域的用于環(huán)磷酰胺抗腫瘤藥物敏感度檢測(cè)的方法，包括引物、探針及其試劑盒，該試劑盒由PCR擴(kuò)增試劑組、SAP酶試劑組、iPLEX試劑組構(gòu)成。PCR擴(kuò)增試劑組含有PCR緩沖液、MgCl2、dNTP混合液、HotstarTaq酶、純水和如SEQIDNo.1~4所示的上游引物和如SEQIDNo.5~8所示的下游引物；SAP酶試劑組含有SAP緩沖液、SAP酶和純水；iPLEX試劑組含有iPLEX緩沖液、ddNTP混合液、iPLEX聚合酶、純水和如SEQIDNo.9~12所示的單堿基延伸引物。利用該試劑盒將腫瘤患者的DNA提取并處理后，可利用飛行質(zhì)譜方法，檢測(cè)引物擴(kuò)增片段內(nèi)的生物標(biāo)記，并基于檢測(cè)結(jié)果評(píng)價(jià)腫瘤患者對(duì)環(huán)磷酰胺藥物的敏感度，本發(fā)明通過(guò)優(yōu)化PCR引物、試劑濃度和PCR的條件，避免了非特異性擴(kuò)增，針對(duì)被檢測(cè)生物標(biāo)記的特異性大大提高。結(jié)果準(zhǔn)確，靈敏度高，方法快速簡(jiǎn)便并且有很高通量。
文檔編號(hào)C12N15/11GK102994642SQ20121055701
公開日2013年3月27日 申請(qǐng)日期2012年12月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月20日
發(fā)明者不公告發(fā)明人 申請(qǐng)人:上海迪道科技有限公司, 郭景康