專利名稱：一種靈芝多糖的提取方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及靈芝深加工技術(shù)，具體是靈芝多糖的提取方法及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
靈芝(Ganoderma Lucidum),為擔(dān)子菌綱多孔菌科靈芝屬真菌,是擁有數(shù)千年藥用歷史的珍貴藥材。《神農(nóng)本草經(jīng)》記載，靈芝具有扶正固本、滋補(bǔ)強(qiáng)壯、延年益壽等功效?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，靈芝具有抗腫瘤、增強(qiáng)免疫功能、降血糖、保肝、抗衰老、抗炎、抗凝血等多種藥理作用。靈芝多糖作為靈芝的主要有效成分之一，近年來逐漸受到研究人員的重視。如北京世紀(jì)博康醫(yī)藥科技有限公司(中國專利申請(qǐng)?zhí)?00810119495.4)公開一種應(yīng)用于防治肝損傷、調(diào)節(jié)免疫力的靈芝多糖組合物；中國科學(xué)院上海藥物研究所(中國專利申請(qǐng)?zhí)?3116403.X)公開一種靈芝多糖的制備方法及其在免疫促進(jìn)方面的應(yīng)用；北京大學(xué)(中國專利申請(qǐng)?zhí)?00410006198.0)公開一種用于預(yù)防、改善或治療失眠癥的靈芝多糖組合物等。隨著全球癌癥發(fā)病率和死亡率的急劇上升，科研工作者進(jìn)行了大量相關(guān)的研究工作以對(duì)抗癌癥。其中研發(fā)生物活性高且毒性低的新型抗癌藥物是一個(gè)非常活躍的領(lǐng)域。傳統(tǒng)的癌癥治療常常對(duì)正常細(xì)胞也有毒性作用，并且可引發(fā)一系列的副反應(yīng)，而從植物、微生物、海產(chǎn)品中提取的天然多糖不但有較高的生物活性，而且非常安全。靈芝多糖具有良好的抗腫瘤和增強(qiáng)免疫活性活性。如福州綠谷生物藥業(yè)技術(shù)研究所(中國專利申請(qǐng)?zhí)?00510095532.9)公開一種靈芝多糖的制備方法及其抑制S180荷瘤小鼠腫瘤生長、促進(jìn)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的作用，(中國專利申請(qǐng)?zhí)?3116403.X)公開靈芝多糖蛋白的制備方法及其對(duì)裸鼠異種人肺癌PG細(xì)胞增殖的抑制作用。但暫未有關(guān)于靈芝多糖對(duì)人肺癌細(xì)胞A549抑制作用的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是填 補(bǔ)目前關(guān)于應(yīng)用靈芝多糖抑制人肺癌細(xì)胞A549方面的空白，提供一種靈芝多糖的提取方法及應(yīng)用。將本發(fā)明的靈芝多糖加入到A549細(xì)胞培養(yǎng)液中，可顯著抑制A549細(xì)胞增殖，具有正面作用。本發(fā)明同時(shí)提供了所述靈芝多糖在抑制人肺癌細(xì)胞A549增殖中的具體應(yīng)用。本發(fā)明的目的通過如下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn):
一種靈芝多糖的提取方法，其包括如下步驟:
(1)靈芝粉碎后加乙醇，微沸提取3-5小時(shí)，過濾得靈芝渣，30-60°C下烘干得靈芝粉備
用；
(2)靈芝粉加入有機(jī)酸溶液，加入酶，超聲條件下提取20-60分鐘，過濾得提取液；
(3)將步驟(2)所得的提取液用截留分子量10000道爾頓的膜進(jìn)行超濾，收集透過液部
分；
(4)將超濾透過液進(jìn)行真空濃縮，至原來體積的1/5-1/3，得濃縮液；
(5)在濃縮液中加入乙醇，混合均勻后，在0-4°C下靜置8-14小時(shí)，過濾，除去上層清液部分，得多糖沉淀；
(6)收集沉淀物，冷凍干燥，獲得靈芝多糖。進(jìn)一步優(yōu)化的，步驟(I)所述乙醇為95%乙醇。進(jìn)一步優(yōu)化的，步驟(2)所述有機(jī)酸為檸檬酸或蘋果酸的一種，且溶液的pH值為1.5-3，其用量為靈芝粉重量的20-40倍。進(jìn)一步優(yōu)化的，步驟(2)所述酶為真菌酸性蛋白酶，酶的加入量為靈芝粉質(zhì)量的0.5-2%。進(jìn)一步優(yōu)化的，步驟(2)所述超聲功率為320W-640W，超聲溫度為30_70°C。 進(jìn)一步優(yōu)化的，步驟(5)所述乙醇添加量為
混合均勻后乙醇最終濃度為50-70% (v/v)。進(jìn)一步優(yōu)化的，步驟(6)所述冷凍干燥得淺棕色靈芝多糖，溶于水。上述制備方法制得的靈芝多糖的應(yīng)用是，在DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)人肺癌細(xì)胞A549，加入0.2-2mg/ml靈芝多糖，可顯著抑制A549細(xì)胞增殖(通過MTT實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)靈芝多糖對(duì)A549細(xì)胞增值作用)。本發(fā)明上述制備方法制得的靈芝多糖可以進(jìn)一步用于制備抗癌藥物。所述靈芝多糖能抑制人肺癌細(xì)胞A549增殖。靈芝多糖濃度為2mg/ml時(shí)，對(duì)人肺癌細(xì)胞A549的抑制率可達(dá) 53.04-68.37%。本發(fā)明采用了以上技術(shù)方 案，具有如下的優(yōu)點(diǎn)和有益效果:1、本發(fā)明提供了一種靈芝多糖的提取方法及應(yīng)用，將本發(fā)明的靈芝多糖加入到A549細(xì)胞培養(yǎng)液中，可顯著抑制A549細(xì)胞增殖，具有正面作用。2、本發(fā)明發(fā)現(xiàn)提取過程中添加真菌酸性蛋白酶，所得靈芝多糖提取率與傳統(tǒng)水提法接近，但可大幅縮短提取時(shí)間、降低能耗，同時(shí)抗氧化效果也較傳統(tǒng)水提法好。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例和附表對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施作進(jìn)一步說明。實(shí)施例1
(O靈芝粉碎后加95%乙醇,微沸提取3小時(shí),過濾得靈芝洛，40°C下烘干得靈芝粉備
用；
(2)取50g靈芝粉置于容器中，與去離子水1:30混合均勻，采用傳統(tǒng)水提法，微沸提取3小時(shí)，過濾得提取液；
(3)將步驟(2)所得的提取液用截留分子量10000道爾頓的膜進(jìn)行超濾，收集透過液部
分；
(4)將超濾透過液進(jìn)行真空濃縮，至原來體積的1/3，得濃縮液；
(5)在濃縮液中加入95%乙醇，混合均勻后乙醇最終濃度為70%(v/v)，在4°C下靜置12小時(shí)，過濾，除去上層清液部分，得多糖沉淀；
(6)收集沉淀物，冷凍干燥，獲得靈芝多糖1#。靈芝多糖的提取率為3.96%，在DPPH.自由基體系中，其IC50為0.68mg/mL, ORAC值為1083.24 μ molTrolox/g,靈芝多糖1#呈淺棕色。實(shí)施例2(1)靈芝粉碎后加95%乙醇,微沸提取3小時(shí),過濾得靈芝洛，40°C下烘干得靈芝粉備
用；
(2)取50g靈芝粉置于容器中，與pH值為3的檸檬酸溶液1:30混合均勻，加入1.5%(物料)真菌酸性蛋白酶，超聲功率為640W，超聲溫度為70°C，提取60分鐘，過濾得提取液；
(3)將步驟(2)所得的提取液用截留分子量10000道爾頓的膜進(jìn)行超濾，收集透過液部
分；
(4)將超濾透過液進(jìn)行真空濃縮，至原來體積的1/3，得濃縮液；
(5)在濃縮液中加入95%乙醇，混合均勻后乙醇最終濃度為70%(v/v)，在4°C下靜置12小時(shí)，過濾，除去上層清液部分，得多糖沉淀；
(6)收集沉淀物，冷凍干燥，獲得靈芝多糖2#。靈芝多糖的提取率為4.21%，在DPPH.自由基體系中，其IC50為0.28mg/mL, ORAC值為1207.66 μ molTrolox/g,靈芝多糖2#呈黃褐色。
實(shí)施例3
(O靈芝粉碎后加95%乙醇,微沸提取4小時(shí),過濾得靈芝洛，60°C下烘干得靈芝粉備
用；
(2)取50g靈芝粉置于容器中，與pH值`為2的檸檬酸溶液1:25混合均勻，加入0.5%(物料)真菌酸性蛋白酶，超聲功率為320W，超聲溫度為50°C，提取40分鐘，過濾得提取液；
(3)將步驟(2)所得的提取液用截留分子量10000道爾頓的膜進(jìn)行超濾，收集透過液部
分；
(4)將超濾透過液進(jìn)行真空濃縮，至原來體積的1/4，得濃縮液；
(5)在濃縮液中加入95%乙醇，混合均勻后乙醇最終濃度為60%(v/v)，在0°C下靜置8小時(shí)，過濾，除去上層清液部分，得多糖沉淀；
(6)收集沉淀物，冷凍干燥，獲得靈芝多糖3#。靈芝多糖的提取率為3.36%，在DPPH.自由基體系中，其IC50為0.41mg/mL, ORAC值為1734.30 μ molTrolox/g,靈芝多糖3#呈淺褐色。
實(shí)施例4
(O靈芝粉碎后加95%乙醇，微沸提取5小時(shí)，過濾得靈芝渣，50°C下烘干得靈芝粉備
用；
(2)取50g靈芝粉置于容器中，與pH值為1.5的蘋果酸溶液1:20混合均勻，加入2%(物料)真菌酸性蛋白酶，超聲功率為480W，超聲溫度為30°C，提取50分鐘，過濾得提取液；
(3)將步驟(2)所得的提取液用截留分子量10000道爾頓的膜進(jìn)行超濾，收集透過液部
分；
(4)將超濾透過液進(jìn)行真空濃縮，至原來體積的1/5，得濃縮液；
(5)在濃縮液中加入95%乙醇，混合均勻后乙醇最終濃度為50%(v/v)，在4°C下靜置10小時(shí)，過濾，除去上層清液部分，得多糖沉淀；
(6)收集沉淀物，冷凍干燥，獲得靈芝多糖4#。靈芝多糖的提取率為3.85%，在DPPH.自由基體系中，其IC50為0.34mg/mL, ORAC值為1540.48 μ molTrolox/g,靈芝多糖4#呈黃棕色。
實(shí)施例5
(O靈芝粉碎后加95%乙醇,微沸提取4小時(shí),過濾得靈芝洛，30°C下烘干得靈芝粉備
用；
(2)取50g靈芝粉置于容器中，與pH值為2的蘋果酸溶液1:40混合均勻，加入1%(物料)真菌酸性蛋白酶，超聲功率為560W，超聲溫度為40°C，提取30分鐘，過濾得提取液；
(3)將步驟(2)所得的提取液用截留分子量10000道爾頓的膜進(jìn)行超濾，收集透過液部
分；
(4)將超濾透過液進(jìn)行真空濃縮，至原來體積的1/4，得濃縮液；
(5)在濃縮液中加入95%乙醇，混合均勻后乙醇最終濃度為55%(v/v)，在0°C下靜置14小時(shí)，過濾，除去上層清液部分，得多糖沉淀；
(6)收集沉淀物，冷凍干燥，獲得靈芝多糖5#。靈芝多糖的提取率為3.79%，在DPPH.自由基體系中，其IC50為0.36mg/mL, ORAC值為1592.94 μ molTrolox/g靈芝多糖5#呈黃褐色。表I產(chǎn)品與抗氧化劑ORAC值比較
權(quán)利要求
1.一種靈芝多糖的提取方法，其特征在于包括如下步驟: (1)靈芝粉碎后加乙醇，微沸提取3-5小時(shí)，過濾得靈芝渣，30-60°C下烘干得靈芝粉備用； (2)靈芝粉加入有機(jī)酸溶液，加入酶，超聲條件下提取20-60分鐘，過濾得提取液； (3)將步驟(2)所得的提取液用截留分子量10000道爾頓的膜進(jìn)行超濾，收集透過液部分； (4)將超濾透過液進(jìn)行真空濃縮，至原來體積的1/5-1/3，得濃縮液； (5)在濃縮液中加入乙醇，混合均勻后，在0-4°C下靜置8-14小時(shí)，過濾，除去上層清液部分，得多糖沉淀； (6)收集沉淀物，冷凍干燥，獲得靈芝多糖。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于步驟(I)所述乙醇為95%乙醇。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于步驟(2)所述有機(jī)酸為檸檬酸或蘋果酸的一種，且溶液的PH值為1.5-3，其用量為靈芝粉重量的20-40倍。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于步驟(2)所述酶為真菌酸性蛋白酶，酶的加入量為靈芝粉質(zhì)量的0.5-2%。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于步驟(2)所述超聲功率為320W-640W，超聲溫度為30-70°C。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于步驟(5)所述乙醇添加量為 混合均勻后乙醇最終濃度為50-70% (v/v)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于步驟(6)所述冷凍干燥得淺棕色靈芝多糖，溶于水。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的靈芝多糖的應(yīng)用，其特征在于在DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)人肺癌細(xì)胞A549，加入0.2-2mg/ml靈芝多糖，顯著抑制A549細(xì)胞增殖。
全文摘要
本發(fā)明公開一種靈芝多糖方法及其應(yīng)用。本發(fā)明采用超聲波結(jié)合酶法提取靈芝多糖，靈芝粉碎后，通過提取、超濾、濃縮和乙醇沉淀分離獲得靈芝多糖。靈芝多糖提取率為3.14-4.21%，分子量在10000道爾頓以下，呈淺棕色，其提取分離方法簡(jiǎn)單，適宜于工業(yè)化生產(chǎn)。所得靈芝多糖具有較強(qiáng)的抗氧化活性和抗癌活性。在DPPH·自由基體系中，靈芝多糖的IC50為0.28-0.43mg/mL，ORAC值可達(dá)1207.66-1777.90μmolTrolox/g。靈芝多糖濃度為2mg/ml時(shí)，對(duì)人肺癌細(xì)胞A549的抑制率可達(dá)53.04-68.37%，可以用于制備抗癌藥物。
文檔編號(hào)C12N5/09GK103073651SQ20121055781
公開日2013年5月1日 申請(qǐng)日期2012年12月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月20日
發(fā)明者游麗君, 馮夢(mèng)瑩, 趙謀明, 崔春, 劉鈞發(fā), 任嬌艷 申請(qǐng)人:華南理工大學(xué)