專(zhuān)利名稱(chēng)：烏賊精氨酸激酶基因及其原核表達(dá)載體和工程菌的制作方法
烏賊精氨酸激酶基因及其原核表達(dá)載體和工程菌技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體涉及到一個(gè)與細(xì)胞內(nèi)能量運(yùn)轉(zhuǎn)、肌肉收縮、ATP再生有直接關(guān)系的重要激酶-精氨酸激酶(Arginine Kinase, AK)及其原核表達(dá)載體。
背景技術(shù)：
精氨酸激酶屬于磷酸原激酶家族中的重要一員，廣泛的存在于無(wú)脊椎動(dòng)物如昆蟲(chóng)、奸、蟹及軟體動(dòng)物中,起著類(lèi)似于脊椎動(dòng)物中肌酸激酶(Creatine Kinase, CK)的作用， 是一個(gè)與細(xì)胞內(nèi)能量運(yùn)轉(zhuǎn)、肌肉收縮、ATP再生有直接關(guān)系的重要激酶。磷酸原激酶家族可逆催化肌酸或精氨酸與ATP之間的轉(zhuǎn)磷?；磻?yīng)，形成高磷酸化的肌酸或磷酸精氨酸。高能磷酸原在能量?jī)?chǔ)備方面起關(guān)鍵作用，因?yàn)楫?dāng)需要ATP再生時(shí)，可以在磷酸原激酶的催化下由磷酸原轉(zhuǎn)化而來(lái)。磷酸原不僅是一個(gè)能量?jī)?chǔ)備庫(kù)，而且在不斷耗能的體系中它是一個(gè)能量傳送體。近年來(lái)，磷酸原激酶的抑制作用研究越來(lái)越受到關(guān)注，不同來(lái)源的磷酸原激酶家族成員因其在能量代謝中的重要地位而成為研究酶抑制作用的靶目標(biāo)。例如，針對(duì)有害昆蟲(chóng)體內(nèi)AK進(jìn)行有效抑制劑的篩選，可以為開(kāi)發(fā)環(huán)境友好的殺蟲(chóng)劑提供新的方向。
雖然磷酸原激酶家族(包括CK和AK)在功能上有很多相似之處，但CK和AK在催化機(jī)制上有很大的差異。肌酸激酶是脊椎動(dòng)物中唯一的磷酸原激酶，而精氨酸激酶是節(jié)肢動(dòng)物和軟體動(dòng)物中的唯一磷酸原激酶。CK通常存在于動(dòng)物的骨骼肌、心肌以及腦部等組織的細(xì)胞漿和線粒體中。它不僅在脊椎動(dòng)物能量代謝中起了重要作用，而且還參與了脊椎動(dòng)物生命過(guò)程中的其他的一些生理活動(dòng)肌漿內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和細(xì)胞表面的離子跨膜運(yùn)輸，巨噬細(xì)胞的吞噬作用，糖酵解的調(diào)控，腦神經(jīng)突觸中依賴(lài)ATP的神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，非肌肉細(xì)胞中有絲分裂的供能等。除此之外，CK在臨床診斷上也具有十分重要的意義。Wyss等已發(fā)現(xiàn)CK系統(tǒng)的調(diào)控紊亂與一系列的疾病相關(guān)，在肌肉、腦、心臟和腎臟相關(guān)疾病以及癌癥的發(fā)生過(guò)程中均發(fā)現(xiàn)了 CK系統(tǒng)的紊亂。當(dāng)肌肉萎縮和心肌梗塞等病變發(fā)生時(shí)，人血清中CK水平迅速升高，目前認(rèn)為CK的活性測(cè)定在心肌梗塞的診斷中比做心電圖更為可靠。CK重要的生理功能和臨床應(yīng)用價(jià)值引起了人們的廣泛重視和深入研究。
相對(duì)于CK，目前對(duì)AK的研究還比較少。作為磷酸家族中的重要一員，AK在無(wú)脊椎動(dòng)物的細(xì)胞能量代謝中起重要的作用，其廣泛分布于各種需能組織中。因此對(duì)該基因的克隆與原核表達(dá)，可以直接應(yīng)用于研究該酶的結(jié)構(gòu)及功能，并為其在其它方面的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的任務(wù)是提供一種烏賊精氨酸激酶基因及其原核表達(dá)載體和工程菌。
實(shí)現(xiàn)本發(fā)明任務(wù)的方案是
本發(fā)明提供的 烏賊精氨酸激酶基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO 1所示， 該精氨酸激酶基因編碼的精氨酸激酶蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQ ID N0:2所示。
本發(fā)明還提供了含有上述精氨酸激酶基因的原核表達(dá)載體，所述的原核表達(dá)載體是含有組氨酸標(biāo)簽(His標(biāo)簽)的原核表達(dá)載體pET30a，精氨酸激酶基因位于pET30a之T7 啟動(dòng)子的下游。
本發(fā)明還提供了表達(dá)上述精氨酸激酶的工程菌，它是將以上所述的重組表達(dá)載體導(dǎo)入到宿主菌后得到的重組菌，所述的宿主菌可以是腸桿菌BL21菌株。
本發(fā)明提供的精氨酸激酶(AK)基因來(lái)源于曼氏無(wú)針烏賊(sepiella maindroni)。本發(fā)明提供了表達(dá)烏賊AK基因的原核表達(dá)載體pET30a_AK，該載體含有AK基因，AK基因的上游有T7啟動(dòng)子和細(xì)菌核糖體結(jié)合位點(diǎn)RBS，T7啟動(dòng)子的下游有可被IPTG 誘導(dǎo)的操作子序列，AK基因的N端和C端均帶有6XHis標(biāo)簽。
本發(fā)明實(shí)驗(yàn)資料
AK全長(zhǎng)基因的克隆
(I)AK基因3’端和5’端序列的獲得
對(duì)Genbank中的一段烏賊EST序列(GT618444.1)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，結(jié)果表明該序列與其他無(wú)脊椎動(dòng)物的精氨酸激酶基因同源性較高，屬于磷酸原激酶家族成員，因此命名為AK。根據(jù)該序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增所需的特異引物。其中
AK-Fl 5/ -GCGGTGTTGGTATCTATGCTTG-3'和
AK-F2 5/ -ATGGCTTCCCTCCAGTCCTCAC-3'用來(lái)擴(kuò)增 AK 基因的 3'端；
AK-Rl 5/ -GTCTTGTCCTGGTTGAAGTAAAT-3'和
AK-R2 5/ -ATTGTCCACTCAGTTCACCCTC-3'用來(lái)擴(kuò)增 AK 基因的 5'端。提取烏賊肝臟的總RNA，并以該RNA為模板，用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA后，使用上述引物和半巢氏 PCR技術(shù)分別擴(kuò)增AK基因的3'和5'端序列。擴(kuò)增產(chǎn)物分別經(jīng)I %瓊脂糖凝膠檢測(cè)及回收后連入PMDlS-Tsimple，轉(zhuǎn)入大腸桿菌中，鑒定出陽(yáng)性克隆并測(cè)序，從而分離出該基因的端和:V端序列并拼接出其全長(zhǎng)序列。
(2) AK基因ORF序列的獲得
根據(jù)拼接的AK全長(zhǎng)序列設(shè)計(jì)兩對(duì)引物
AK-F3 5/ -AGACGAACAGCTACGCCATGTC-3'；
AK-R3 5/ -AGCAGAGTGACGCCAGTGAG-3'；
AK-F4 5/ -CGGGATCCATGTCTGACGCCGATGAACTC-3;
(劃線處為BamHI酶切位點(diǎn))；
AK-R4 5/ -CCCAAGCTTGGCAGACTTCTCCAAACGGATG-3;
(劃線處為HindIII酶切位點(diǎn))。
以烏賊的cDNA為模板，然后進(jìn)行巢氏PCR擴(kuò)增AK基因開(kāi)放閱讀框序列，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠檢測(cè)，膠回收，并將其連接到PMD18-T simple，轉(zhuǎn)入 大腸桿菌中。獲得的陽(yáng)性克隆經(jīng)PCR、酶切鑒定和測(cè)序。最終獲得該基因的開(kāi)放閱讀框，并構(gòu)建到pMD18-T simple載體中。全長(zhǎng)1050bp，編碼349個(gè)氨基酸。
1、AK基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建
分別提取連在pMD18-T simple載體上的AK基因質(zhì)粒和pET30a空載體的質(zhì)粒，使用BamHI和HindIII對(duì)這兩種質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，分別獲得5^和:V末端分別帶有BamHI和 HindIII酶切位點(diǎn)的AK基因和pET30a空載體，瓊脂糖凝膠電泳后分別進(jìn)行回收，然后16°C 連接16h后轉(zhuǎn)化，再經(jīng)菌落PCR、酶切和測(cè)序鑒定后，最終獲得原核表達(dá)載體pET30a-AK。
2、AK基因原核表達(dá)、純化及酶活的鑒定
原核表達(dá)載體pET32a_AK用熱刺激法導(dǎo)入大腸桿菌蛋白表達(dá)專(zhuān)用受體菌株BL21 中，獲得陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子菌落。然后用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)AK重組蛋白，并對(duì)其表達(dá)時(shí)間、IPTG 濃度和溫度條件進(jìn)行優(yōu)化，確定重組蛋白的最優(yōu)表達(dá)條件，同時(shí)并對(duì)其進(jìn)行了酶活及其反應(yīng)條件的初步鑒定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示該蛋白的最優(yōu)表達(dá)條件為ImM IPTG于37°C誘導(dǎo)4h，酶活的最適反應(yīng)溫度和PH值分別為30°C與8. 3。
本發(fā)明的技術(shù)優(yōu)點(diǎn)及效果本發(fā)明中克隆的AK基因是在頭足類(lèi)動(dòng)物烏賊中首次擴(kuò)增得到的，并對(duì)其進(jìn)行了原核表達(dá)和蛋白純化，獲得了 AK的重組蛋白。這不僅將解決目前因缺乏該蛋白而無(wú)法在體外研究其分子結(jié)構(gòu)和功能的問(wèn)題，并為在體外研究無(wú)脊椎動(dòng)物體內(nèi)的能量代謝、儲(chǔ)存和利用奠定了基礎(chǔ)；而且該純化的蛋白還可以直接用作抗原來(lái)生產(chǎn)抗體。AK蛋白特異性抗體是檢測(cè)無(wú)脊椎動(dòng)物中AK蛋白表達(dá)水平的有效工具。目前尚未有頭足類(lèi)動(dòng)物烏賊AK基因原核表達(dá)及制備AK抗體的報(bào)道。


圖1為本發(fā)明中烏賊總RNA的電泳檢測(cè)示意圖。
圖2為本發(fā)明用5' RACE獲得的AK基因的5'端PCR產(chǎn)物的1%瓊脂糖電泳圖 (A)和用3' RACE獲得的AK基因的3'端PCR產(chǎn)物的I %瓊脂糖電泳圖(B)，其中M是DNA Marker II ; I是AK基因相應(yīng)片段的PCR產(chǎn)物。
圖3為本發(fā)明中AK基因全長(zhǎng)開(kāi)放閱讀框PCR產(chǎn)物的1%瓊脂糖電泳圖(電泳條帶1-5)。
圖4為本發(fā)明中AK蛋白與其它同源AK蛋白的系統(tǒng)發(fā)育分析圖。
圖5為本發(fā)明中pET30a_AK雙酶切鑒定結(jié)果(電泳條帶1_4)。
圖6重組質(zhì)粒pET30a_AK結(jié)構(gòu)示意圖。
圖7是本發(fā)明BL21的菌液PCR檢測(cè)電泳圖。其中M是DNA Marker III，1-13為挑取的單菌落菌液PCR的結(jié)果，14為空白對(duì)照，15-16為陽(yáng)性質(zhì)粒對(duì)照。
圖8粗提和純化后AK蛋白SDS-PAGE分離結(jié)果。其中1:蛋白質(zhì)marker_MP204，2-3轉(zhuǎn) pET-30a 的 BL21 (37 °C，ImM IPTG 誘導(dǎo) 4h)，4-5 :轉(zhuǎn) pET30a_AK 的 BL21 (37 °C，ImM IPTG 誘導(dǎo) 4h)，6 -M pET30a-AK 的 BL21 (37°C，ImM IPTG 誘導(dǎo) 4h)全蛋白經(jīng) N1-NTA 純化樹(shù)脂層析和透析后的目標(biāo)條帶。
圖9不同溫度(a)和不同pH(b)對(duì)精氨酸激酶酶活的影響。
具體實(shí)施方式
以下結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明的操作方法。但是這些實(shí)施例僅用于詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明，而不用于限制本發(fā)明的范圍。
本實(shí)施例中采用的試劑主要為分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)試劑、各種限制性?xún)?nèi)切酶、Taq DNA 聚合酶、dNTP等，各種限制性?xún)?nèi)切酶、Taq DNA聚合酶、dNTP為日本寶生物工程有限公司(大連)產(chǎn)品，質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自博大泰克生物技術(shù)有限公司，其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純，儀器均為分子生物學(xué)以及基因工程實(shí)驗(yàn)室常用儀器。
所用引物序列均在上海生工合成，本發(fā)明實(shí)施例中所用方法如無(wú)特別說(shuō)明均為常規(guī)方法。
實(shí)施例1 :曼氏無(wú)針烏賊RNA的提取與檢測(cè)
烏賊總RNA的提取使用TRIzoL Reagent (RNA提取試劑，Invitrogen)試劑,對(duì)說(shuō)明書(shū)方法稍做修改后進(jìn)行。取烏賊肝臟O. lg，加入Iml的TRIzoLRNA提取液，混勻室溫靜置 5min,加入O. 2ml氯仿,振蕩混勻，4°C, 12000rpm/min離心15min。轉(zhuǎn)移上清液,加入O. 5ml 異丙醇，混勻室溫放置IOmin后12000rpm/min離心lOmin。棄上清,75%的乙醇Iml清洗沉淀兩次，4°C，7500rpm/min離心5min，干燥后用20 μ I焦碳酸二乙酯(DEPC)處理水溶解 RNA。取Iul RNA用1. 2%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，結(jié)果(見(jiàn)圖1)說(shuō)明提取到的RNA質(zhì)量符合要求。
實(shí)施例2烏賊cDNA第一條鏈的合成
以烏賊總RNA 為模板，使用 RevertAid M-MuLV Reverse Transcriptase Kit (反轉(zhuǎn)錄試劑盒，F(xiàn)ermentas)進(jìn)行 cDNA 的合成。取植物總 RNA O. 1-0. 5 μ g, Oligo (dT) 50ng, oligo (dT) I μ 1，用DEPC處理水補(bǔ)足至12 μ 1，混勻后，短暫離心將其收集于管底，置于65°C 水浴鍋中水浴5min，然后迅速在冰上冷卻，再加入反應(yīng)混合物8μ I (5 X Reaction Buffer 4 μ I, IOmM dNTP 2 μ I, RNA 酶抑制劑 I μ I, RevertAid M-MuLV Reverse TranscriptaseIμ I)，混勻，短暫離心將其收集于管底，42°C保溫60min，然后70°C保溫5min以終止反應(yīng)，-70°C保存?zhèn)溆谩?br> 實(shí)施例3AK cDNA全長(zhǎng)序列的克隆
首先對(duì)Genbank中的一段烏賊EST序列(GT618444.1)進(jìn)行生物信息學(xué)分析， 結(jié)果表明該序列與其他無(wú)脊椎動(dòng)物的AK基因同源性較高，但是位于AK序列的中間， 因此我們根據(jù)該中間序列設(shè)計(jì)了擴(kuò)增其3'與5,端序列所需的兩對(duì)特異引物。其中 AK-Fl 5 '
權(quán)利要求
1.一種來(lái)源于曼氏無(wú)針烏賊(sepiella maindroni)的精氨酸激酶基因,其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO 1所示。
2.由權(quán)利要求1所述的精氨酸激酶基因編碼的精氨酸激酶蛋白，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO 2所示。
3.—種重組表達(dá)載體，其特征在于，它是含有權(quán)利要求1所述的精氨酸激酶基因的原核表達(dá)載體。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組表達(dá)載體，其特征在于，所述的原核表達(dá)載體是含有組氨酸標(biāo)簽(His標(biāo)簽)的原核表達(dá)載體pET30a，精氨酸激酶基因位于pET30a之T7啟動(dòng)子的下游。
5.一種表達(dá)精氨酸激酶的工程菌，其特征在于，它是將權(quán)利要求3或4所述的重組表達(dá)載體導(dǎo)入到宿主菌后得到的重組菌。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的表達(dá)精氨酸激酶的工程菌，其特征在于，所述的宿主菌是腸桿菌BL21菌株。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種烏賊精氨酸激酶基因及其原核表達(dá)載體pET30a-AK，具體涉及到一個(gè)與細(xì)胞內(nèi)能量運(yùn)轉(zhuǎn)、肌肉收縮、ATP再生有直接關(guān)系的重要激酶——精氨酸激酶(Arginine Kinase，AK)及其原核表達(dá)載體。本發(fā)明是利用RACE PCR技術(shù)從烏賊肝臟中克隆了AK基因的全長(zhǎng)cDNA，然后將其蛋白編碼序列克隆到原核表達(dá)載體pET30a-AK上，并在大腸桿菌表達(dá)菌株BL21中進(jìn)行了表達(dá)與純化。分離得到的重組蛋白，不僅可作為抗原用于AK抗體的制備，并對(duì)研究無(wú)脊椎動(dòng)物體內(nèi)的能量代謝調(diào)節(jié)規(guī)律具有重大價(jià)值。
文檔編號(hào)C12N15/70GK103060345SQ201210559059
公開(kāi)日2013年4月24日 申請(qǐng)日期2012年12月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月20日
發(fā)明者何光源, 陳利紅, 張揚(yáng), 李肖, 楊廣笑, 汪越勝, 王敏, 吳常文 申請(qǐng)人:華中科技大學(xué)