專(zhuān)利名稱(chēng)：熒光定量pcr檢測(cè)豇豆i型和ii型耐旱性的方法以及診斷性基因和引物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及熒光定量PCR檢測(cè)豇豆I型和II型耐旱性的方法以及診斷性基因和引物。
背景技術(shù)：
豆(Viffna unguiculata L. Walp)起源于非洲干旱地區(qū),是世界范圍內(nèi)重要的糧食豆類(lèi)和亞洲國(guó)家重要蔬菜作物之一。據(jù)2006年統(tǒng)計(jì)年鑒，我國(guó)豇豆年產(chǎn)量達(dá)800萬(wàn)噸以上，而由于干旱造成的產(chǎn)量損失估計(jì)達(dá)20%左右。豇豆的耐旱性在不同基因型之間存在顯著差異。前人研究表明豇豆自然資源中存在著兩種不同類(lèi)型的耐旱反應(yīng)，即I型和II型耐旱響應(yīng)(Watanabe et al. , 1997; Muchero et al. , 2008; Agbicodo et al. , 2009)。在I型耐旱響應(yīng)中，植物在水分脅迫下各組織迅速關(guān)閉氣孔、停止生長(zhǎng)并保持各組織水分含量大致相當(dāng)，并在復(fù)水后才恢復(fù)生長(zhǎng)；與此相反，II型耐旱品種的老葉快速干枯死亡，并且將其中水分運(yùn)送至新葉并保持新葉氣孔開(kāi)張和繼續(xù)生長(zhǎng)，直到土壤水分繼續(xù)下降至相當(dāng)?shù)偷呐R界值(圖1)。由于這兩類(lèi)耐旱機(jī)制的顯著不同，在豇豆耐旱育種中需要事先明確將要利用的育種親本材料的耐旱類(lèi)型，然后有針對(duì)性的設(shè)計(jì)育種方案和制定育種計(jì)劃?；虮磉_(dá)的調(diào)節(jié)對(duì)生物性狀的形成和變化具有至關(guān)重要的作用。在干旱脅迫下，大批植物基因如轉(zhuǎn)錄因子、脫水素蛋白、水通道蛋白、ABA合成相關(guān)因子基因等都會(huì)發(fā)生表達(dá)水平的上調(diào)或下調(diào)。模式植物中的大量研究表明，有些基因在干旱脅迫的表達(dá)調(diào)控模式在不同耐旱類(lèi)型材料中特異地表現(xiàn)出差異，從而可以作為區(qū)分各種耐旱類(lèi)型的診斷性基因。目前，豇豆中尚未報(bào)道或開(kāi)發(fā)過(guò)可用于特異檢測(cè)I型和II型耐旱性的診斷性基因及其引物。

檢測(cè)基因表達(dá)的常用方法傳統(tǒng)的有Northern雜交法，較新的有實(shí)時(shí)熒光定量PCR法、表達(dá)譜芯片法等。表達(dá)譜芯片是一種高通量檢測(cè)方法，一次可對(duì)上萬(wàn)條基因的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，適于從大量基因中篩選出與植物生長(zhǎng)發(fā)育、環(huán)境脅迫、抗病蟲(chóng)害等相關(guān)的目標(biāo)基因。實(shí)時(shí)熒光定量PCR通常一次檢測(cè)一個(gè)基因，但簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)，一般實(shí)驗(yàn)室均可操作。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述的技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種熒光定量PCR檢測(cè)豇豆I型和II型耐旱性的方法，通過(guò)簡(jiǎn)單的熒光定量PCR即可區(qū)分豇豆品種的不同耐旱類(lèi)型，分析過(guò)程在1-2日內(nèi)即可完成，大大提高了效率，有利于有針對(duì)性的利用不同耐旱類(lèi)型的育種親本，促進(jìn)豇豆耐旱育種。本發(fā)明的第二個(gè)目的是一種特異區(qū)分豇豆I型和II型耐旱性的診斷性基因。本發(fā)明的第三個(gè)目的是一種特異區(qū)分豇豆I型和II型耐旱性的診斷性基因的熒光定量PCR引物。為了實(shí)現(xiàn)上述的第一個(gè)目的，本發(fā)明采用了以下的技術(shù)方案
熒光定量PCR檢測(cè)豇豆I型和II型耐旱性的方法，該方法被檢測(cè)的診斷基因的序列如SEQ ID N0:1所示；所述的熒光定量PCR引物具有以下的序列
上游引物5’-TGGAITGTGGTGGACATAC-3’ ；
下游引物5’-GGITCCTTCTGAGCAITGA-3’。作為優(yōu)選，該方法包括以下的步驟
1)材料準(zhǔn)備挑選飽滿(mǎn)的I份I型耐旱豇豆品種和I份II型耐旱豇豆品種種子播于營(yíng)養(yǎng)缽，基質(zhì)為蛭石營(yíng)養(yǎng)土 =3 1 ;待子葉平展時(shí)澆透水后停止灌水，于處理后14天用常規(guī)Trizol法提取正常生長(zhǎng)和受脅迫條件下的葉部RNA ;或者拔出植株根部，迅速用水洗凈后用常規(guī)Trizol法提取正常生長(zhǎng)和受脅迫條件下的根部RNA ；
2)RAN提取和反轉(zhuǎn)錄取葉片或根組織組織0.1g加液氮研磨成粉末，參照試劑盒說(shuō)明書(shū)提取總RNA ;將提取的RNA用DEPC處理過(guò)的水稀釋至0.1 g/L，在8 y L DEPC處理過(guò)的水中依次加入2 ii L錨定引物AP、RNA 2uL ;將`上述混合物置于70°C溫浴5 min后置于冰上；在RNA-AP混合物中依次加入5 X第一鏈緩沖液4 u L、0. 25mmol/L dNTP 2. 5 u L、0.1 mol/L DTT 2. 5 u L,200 u/u L 的 SUPERSCRIPT II 反轉(zhuǎn)錄酶 0. 4 y L ;25°C 5 min, 42°C 15 min,70°C 10 min，4°C保持；反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物于_20°C保存；cDNA稀釋10倍備用；
所述的第一鏈緩沖液包括250 mmol/L Tris-HCl、pH8. 3、375 mmol/L KC1、15 mmol/LMgCl2 ；
3)熒光實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)采用八連PCR管為單位進(jìn)行熒光實(shí)時(shí)定量PCR；PCR體系包括10ii L2XMix，5. L ddH20, 2 u L 50XR0X,0. 6u L 弓丨物和 2yL cDNA，為 20 y L 體系；PCR程序?yàn)棰倜讣せ?5°C 15min，擴(kuò)增循環(huán)②95°C 15s，③55°C 30s，④72°C 32s，②-④共40個(gè)循環(huán)；溶解曲線(xiàn)分析為95°C 15s，60°C Imin ;每組PCR均做3次重復(fù)，取平均值進(jìn)行計(jì)算；內(nèi)參基因的序列如SEQ ID N0:4所示；數(shù)據(jù)分析采用2_""\法；結(jié)果表明利用熒光實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)獲得了與芯片表達(dá)譜相一致的SEQ ID NO:1基因差異表達(dá)模式，從而能夠?qū)型和II型耐旱性材料明確區(qū)分出來(lái)。為了實(shí)現(xiàn)上述的第二個(gè)目的，本發(fā)明采用了以下的技術(shù)方案
特異區(qū)分豇豆I型和II型耐旱性的診斷性基因，該基因的序列如SEQ ID NO:1所示。為了實(shí)現(xiàn)上述的第三個(gè)目的，本發(fā)明采用了以下的技術(shù)方案
用于診斷上述的特異區(qū)分豇豆I型和II型耐旱性的診斷性基因的熒光定量PCR引物，其特征在于該引物具有以下的序列
上游引物5’-TGGAITGTGGTGGACATAC-3’ ；
下游引物5’-GGITCCTTCTGAGCATTGA-3’。本發(fā)明由于采用了上述的技術(shù)方案，通過(guò)簡(jiǎn)單的熒光定量PCR即可區(qū)分豇豆品種的不同耐旱類(lèi)型，分析過(guò)程在1-2日內(nèi)即可完成，大大提高了效率，有利于有針對(duì)性的利用不同耐旱類(lèi)型的育種親本，促進(jìn)豇豆耐旱育種。本發(fā)明的有益效果是1.本發(fā)明所鑒定的在豇豆I型和II型耐旱性材料中呈顯著差異表達(dá)的基因?yàn)樘禺悈^(qū)分豇豆品種不同類(lèi)型的耐旱性提供了的診斷性基因工具。2.本發(fā)明獲得的針對(duì)I型和II型耐旱性診斷性基因的引物序列為利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR快捷、簡(jiǎn)便的檢測(cè)不同育種親本材料的耐旱類(lèi)型提供了直接技術(shù)支持。


圖1為豇豆I型和II型耐旱性的特征。左圖為I型耐旱材料，植株所有三出復(fù)葉均微黃且萎蔫程度相當(dāng)；右圖為II型耐旱材料，植株表現(xiàn)為最下方的三出復(fù)葉完全枯死，上部葉片組織則持綠良好。圖2為利用基因芯片比較和鑒定I型和II型耐旱豇豆葉片在正常生長(zhǎng)和干旱脅迫下基因表達(dá)譜聚類(lèi)圖。lxp，2xp，3xp 1型耐旱豇豆品種“花豆角”在正常生長(zhǎng)條件下的葉片；7xp,8xp,9xp 花·豆角”在干旱脅迫條件下的葉片；13xp, 14xp, 15xp II型耐旱St豆品種“飯豆”在正常生長(zhǎng)條件下的葉片；19Xp，20Xp，21Xp 飯豆”在干旱脅迫條件下的葉片。每個(gè)編號(hào)代表一個(gè)生物學(xué)重復(fù)。圖3為熒光實(shí)時(shí)定量PCR在2個(gè)不同豇豆品種“花豆角”和“飯豆”中擴(kuò)增診斷性基因CETSl的結(jié)果及與基因芯片的比較。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1
特異區(qū)分豇豆I型和II型耐旱性的診斷性基因的篩選和引物的設(shè)計(jì)方法，該方法包括以下的步驟
(I)豇豆無(wú)冗余基因序列的下載和預(yù)處理從HarvEST豇豆DNA數(shù)據(jù)庫(kù)UP12 (http://www. harvest-web. org/hweb/bin/wc. dll hwebProcess hmain &versid=68)批量下載 Bi豆 unigene 序列，共 29, 728 條。運(yùn)行 VecScreen 程序(http://www. ncb1. nlm. nih. gov/VecScreen/VecScreen. html ),掃描并去除下載序列上包含的載體和接頭序列。(2)豇豆基因芯片設(shè)計(jì)對(duì)UP12數(shù)據(jù)庫(kù)中全部29，728條unigene序列進(jìn)行掃描后，針對(duì)每條序列在其不同堿基位置分別設(shè)計(jì)4條寡核苷酸DNA序列作為探針，這4條序列在芯片雜交中信號(hào)值的加權(quán)平均值將定義一個(gè)基因的信號(hào)值。設(shè)計(jì)時(shí)技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)為轉(zhuǎn)錄組GC含量在35-60%之間，探針設(shè)計(jì)傾向于ORF開(kāi)放閱讀框3’末端，探針長(zhǎng)度為60_mer。除去189條序列沒(méi)有設(shè)計(jì)出合適的探針，有62組成對(duì)序列和3組3對(duì)序列由于同源性太高，設(shè)計(jì)的探針相同，最終設(shè)計(jì)出探針總數(shù)為117，746條，代表了 29728-189-62x1-3x2=29，471條 unigene。(3)芯片雜交和差異表達(dá)譜分析將步驟(2)設(shè)計(jì)的所有探針序列交由Nimblegen公司點(diǎn)制成12 X 135k規(guī)格的表達(dá)譜芯片。將點(diǎn)制好的芯片交由北京博奧生物有限公司分別對(duì)正常灌溉和干旱處理?xiàng)l件下生長(zhǎng)的I個(gè)I型耐旱豇豆品種“花豆角”和I個(gè)II型耐旱豇豆品種〃飯豆〃的葉片cDNA進(jìn)行雜交分析。雜交方法按常規(guī)表達(dá)譜芯片的標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行。雜交完畢后用Roche-NimbleGen MS200掃描儀掃描芯片。通過(guò)LuxScan 4.0圖像分析軟件分析把圖像信號(hào)轉(zhuǎn)化為數(shù)字信號(hào)。根據(jù)cy5和cy3總體信號(hào)的全局平均值對(duì)各芯片進(jìn)行片間線(xiàn)性校正，使得各張芯片的全局平均值相同。采用RMA方法(Irizarry et al.，2003)進(jìn)行歸一化。用SAM軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)顯著性測(cè)驗(yàn)并結(jié)合文獻(xiàn)分析，挑選出11個(gè)在兩類(lèi)耐旱性材料中的表達(dá)調(diào)控模式呈顯著差異的候選基因(表I)。表I芯片表達(dá)譜分析獲得的11個(gè)候選差異表達(dá)基因UP12數(shù)據(jù)庫(kù)基因代號(hào)I基因功能注釋
UP127902Non-specificlipid-transferprotein
權(quán)利要求
1.熒光定量PCR檢測(cè)豇豆I型和II型耐旱性的方法，其特征在于該方法被檢測(cè)的診斷基因的序列如SEQ ID NO:1所示；熒光定量PCR引物具有以下的序列 上游引物5’-TGGATTGTGGTGGACATAC-3’ ； 下游引物5’-GGTTCCTTCTGAGCATTGA-3’。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的熒光定量PCR檢測(cè)豇豆I型和II型耐旱性的方法，其特征在于該方法包括以下的步驟 1)材料準(zhǔn)備挑選飽滿(mǎn)的I份I型耐旱豇豆品種和I份II型耐旱豇豆品種種子播于營(yíng)養(yǎng)缽，基質(zhì)為蛭石營(yíng)養(yǎng)土 =3 1 ;待子葉平展時(shí)澆透水后停止灌水，于處理后14天用常規(guī)Trizol法提取正常生長(zhǎng)和受脅迫條件下的葉部RNA ;或者拔出植株根部，迅速用水洗凈后用常規(guī)Trizol法提取正常生長(zhǎng)和受脅迫條件下的根部RNA ； 2)RAN提取和反轉(zhuǎn)錄取葉片或根組織組織O.1g加液氮研磨成粉末，參照試劑盒說(shuō)明書(shū)提取總RNA ;將提取的RNA用DEPC處理過(guò)的水稀釋至O.1 g/L,在8 μ L DEPC處理過(guò)的水中依次加入2 μ L錨定引物AP、RNA 2 μ L ;將上述混合物置于70°C溫浴5 min后置于冰上；在RNA-AP混合物中依次加入5 X第一鏈緩沖液4 μ L、0. 25mmol/L dNTP 2. 5 μ L、0.1 mol/L DTT 2. 5 μ L,200 u/μ L 的 SUPERSCRIPT II 反轉(zhuǎn)錄酶 O. 4 μ L ;25°C 5 min, 42°C 15 min,70°C 10 min，4°C保持；反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物于_20°C保存；cDNA稀釋10倍備用； 所述的第一鏈緩沖液包括250 mmol/L Tris-HCl、ρΗ8· 3、375 mmol/L KC1、15 mmol/LMgCl2 ； 3)熒光實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)采用八連PCR管為單位進(jìn)行熒光實(shí)時(shí)定量PCR；PCR體系包括10μ L2XMix，5. 4μ L ddH20, 2 μ L 50XR0X,0. 6μ L 弓丨物和 2yL cDNA，為 20yL 體系；PCR程序?yàn)棰倜讣せ?5°C 15min，擴(kuò)增循環(huán)②95°C 15s，③55°C 30s，④72°C 32s，②-④共40個(gè)循環(huán)； 溶解曲線(xiàn)分析為95°C 15s，60°C Imin ； 每組PCR均做3次重復(fù)，取平均值進(jìn)行計(jì)算；內(nèi)參基因的序列如SEQ ID N0:4所示；數(shù)據(jù)分析采用2_“\法；結(jié)果表明利用熒光實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)獲得了與芯片表達(dá)譜相一致的SEQ ID NO:1基因差異表達(dá)模式，從而能夠?qū)型和II型耐旱性材料明確區(qū)分出來(lái)。
3.特異區(qū)分豇豆I型和II型耐旱性的診斷性基因，其特征在于該基因的序列如SEQIDNO:1所示。
4.用于診斷權(quán)利要求3所述的特異區(qū)分豇豆I型和II型耐旱性的診斷性基因的熒光定量PCR引物，其特征在于該引物具有以下的序列 上游引物5’-TGGATTGTGGTGGACATAC-3’ ； 下游引物5’-GGTTCCTTCTGAGCATTGA-3’。
全文摘要
本發(fā)明涉及熒光定量PCR檢測(cè)豇豆I型和II型耐旱性的方法以及診斷性基因和引物。熒光定量PCR檢測(cè)豇豆I型和II型耐旱性的方法，該方法被檢測(cè)的診斷基因的序列如SEQIDNO:1所示；所述的熒光定量PCR引物具有以下的序列上游引物5'-TGGATTGTGGTGGACATAC-3'；下游引物5'-GGTTCCTTCTGAGCATTGA-3'。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)所鑒定的在豇豆I型和II型耐旱性材料中呈顯著差異表達(dá)的基因?yàn)樘禺悈^(qū)分豇豆品種不同類(lèi)型的耐旱性提供了的診斷性基因工具，另外針對(duì)I型和II型耐旱性診斷性基因的引物序列為利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR快捷、簡(jiǎn)便的檢測(cè)不同育種親本材料的耐旱類(lèi)型提供了直接技術(shù)支持。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK103045738SQ201210559678
公開(kāi)日2013年4月17日 申請(qǐng)日期2012年12月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月20日
發(fā)明者徐沛, 李國(guó)景, 吳曉花, 汪寶根, 魯忠富, 羅潔, 王莎, 劉永華 申請(qǐng)人:浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院