專利名稱：一種擬穴青蟹SNPs分子標(biāo)記的篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于擬穴青蟹遺傳標(biāo)記檢測領(lǐng)域，特別是涉及一種擬穴青蟹SNPs分子標(biāo)記的篩選方法。
背景技術(shù)：
單核苷酸多態(tài)性(Single Nucleotide Polymorphisms, SNPs)分子標(biāo)記幾乎存在于所有真核生物基因組中，是生物基因組中最豐富的遺傳變異資源。SNPs具有典型的二等位基因性，大多數(shù)生物基因組平均每200bp IOOObp核苷酸中就會(huì)存在一個(gè)SNP。由于SNPs具有眾多優(yōu)點(diǎn)，因此被認(rèn)為是遺傳學(xué)和進(jìn)化學(xué)研究領(lǐng)域最具有潛力的一種遺傳標(biāo)記。目前，已經(jīng)在多種水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物中報(bào)道了 SNPs分子標(biāo)記，如凡納濱對蝦、日本牙鲆、虹鱒、大西洋鮭、牡蠣等。擬穴青蟹(Scylla paramamosain)屬節(jié)肢動(dòng)物門(Arthropoda)、甲殼綱(Crustacea)、十足目(Decapoda)、梭子蟹科(Portunidae)、青蟹屬(Scylla),在我國主要分布于長江口及以南沿海海域，是我國重要的海洋漁業(yè)資源和海水養(yǎng)殖蟹類。擬穴青蟹具有體型大、生長速度快、肉味鮮美等優(yōu)點(diǎn)，深受廣大消費(fèi)者青睞。近年來，我國擬穴青蟹的人工養(yǎng)殖年產(chǎn)量一直穩(wěn)定在10萬噸以上，保持了健康的發(fā)展勢頭。學(xué)者們圍繞擬穴青蟹繁殖生物學(xué)、養(yǎng)殖生物學(xué)等方面已經(jīng)開展了較多的研究工作，但對遺傳學(xué)及育種學(xué)方面的研究還較少。目前，在擬穴青蟹中已經(jīng)開展了線粒體DNA和微衛(wèi)星分子標(biāo)記的研究，而對SNPs標(biāo)記的研究還甚少，限制了群體遺傳多樣性評估、遺傳圖譜構(gòu)建及分子標(biāo)記輔助育種等研究的開展。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種擬穴青蟹SNPs分子標(biāo)記的篩選方法，該方法具有實(shí)驗(yàn)周期短、成本低、操作簡單等優(yōu)點(diǎn)，能夠準(zhǔn)確地檢測出不同個(gè)體的基因型，從而為擬穴青蟹分子遺傳學(xué)及分子輔助育種研究提供新型遺傳標(biāo)記。本發(fā)明提供的20個(gè)SNPs分子標(biāo)記可應(yīng)用于擬穴青蟹遺傳變異分析、種質(zhì)資源評估與保護(hù)及遺傳連鎖圖譜構(gòu)建等領(lǐng)域。本發(fā)明的一種擬穴青蟹SNPs分子標(biāo)記的篩選方法，包括(I)擬穴青蟹基因組DNA序列的獲取基因組序列可以通過兩種渠道獲得第一，利用已經(jīng)構(gòu)建的擬穴青蟹基因組文庫或轉(zhuǎn)錄組文庫中的序列；第二，利用GeneBank數(shù)據(jù)庫中的公開的擬穴青蟹功能基因序列。(2) DNA序列測序與候選SNPs鑒定首先，對所獲得的基因組序列分段設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小在500bp、00bp之間為宜；其次，采用上述引物對5 30個(gè)無親緣關(guān)系的擬穴青蟹個(gè)體進(jìn)行PCR擴(kuò)增；然后，選取擴(kuò)增清晰、產(chǎn)量高、無非特異擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物送測序公司進(jìn)行雙向、直接測序；最后，對測序結(jié)果進(jìn)行分析，比較不同個(gè)體在同一堿基位點(diǎn)的序列差異，鑒定出候選SNPs位點(diǎn)。
(3) SNPs驗(yàn)證與基因分型首先，針對每一個(gè)候選SNPs位點(diǎn)設(shè)計(jì)3條引物，包括2條等位基因特異的上游引物(Fl和F2)和I條通用的下游引物(R)。2條上游引物分別以SNP位點(diǎn)的2個(gè)不同的堿基作為引物的3’末端，并且在5’端分別加上長度不同的人工序列(GCGGGCAGGGCGGC和GCGGGC);然后，以擬穴青蟹I個(gè)野生群體共30只個(gè)體的基因組DNA為模板，采用上述引物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，分析其溶解曲線的差異，若出現(xiàn)2條溶解曲線，表明該SNP位點(diǎn)是雜合型的；若出現(xiàn)I條溶解曲線，表明該SNP位點(diǎn)是純合型的。由此，可獲得不同SNPs位點(diǎn)在所有個(gè)體的基因型。所述步驟(2)中的引物共設(shè)計(jì)11對，其序列和退火溫度如下第一對弓丨物FCAATGGCTGACGCTGCTACRGCGCTTGTTGGAGATATCG退火溫度58 °C第二對弓I物F GTGAGCACTGGGCTGTATGRGGTATGTGTTCTTTATTATTTCGT退火溫度58 °C第三對弓丨物FACACGAAGTAACGAGCCGRGATGACCAAAGCAGCAAAA退火溫度57 °C第四對引物FCCTGTTGACTGGGAGTGTCRAATGATGCAAGCCTAGTATGA退火溫度56°C第五對引物FCAACATGTGTGACGACGAAGTRAGGATGGCGTAGGGAAGG退火溫度60°C第六對引物FGCAGCATCATCTATATTTGTTCRGCTTGTAATGTTTAGTTGGTCA退火溫度59°C第七對弓丨物F GATGAAGGTCACGAGCAGARTGATGGCTGAAGCACAATAC退火溫度58°C第八對引物FTTTAGCACCATTAGGACTGRGAGGATGACCTGGAGAAG退火溫度56°C第九對引物FTAACGCACTAACAATTCTGCTRCAACCACATTCACTCATGGA退火溫度56°C第十對引物FGAACAAGAGTTTGGCCTAGTRTCAATATCATCAGAGTTATTTTATT退火溫度52°C
第^^一對引物FCACCTACCTTCTTCCTTCCAGTRCGGGGGTTGTCAAGAGTGT退火溫度60°C本發(fā)明設(shè)計(jì)的擬穴青蟹20個(gè)SNPs分子標(biāo)記可應(yīng)用于擬穴青蟹遺傳變異分析、種質(zhì)資源鑒定與保護(hù)及遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建等方面。有益.效果(I)本發(fā)明的檢測方法具有實(shí)驗(yàn)周期短、成本低、操作簡單等優(yōu)點(diǎn)，能夠準(zhǔn)確地檢測出擬穴青蟹不同個(gè)體的基因型，從而為擬穴青蟹分子遺傳學(xué)及分子輔助育種研究提供新型遺傳標(biāo)·記；(2)本發(fā)明提供的20個(gè)SNPs分子標(biāo)記可應(yīng)用于擬穴青蟹遺傳變異分析、種質(zhì)資源評估與保護(hù)及遺傳連鎖圖譜構(gòu)建等領(lǐng)域。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。實(shí)施例11、擬穴青蟹基因組DNA序列的獲得本實(shí)驗(yàn)室前期開展了擬穴青蟹轉(zhuǎn)錄組測序研究，本發(fā)明從中隨機(jī)挑選不同的測序序列作為篩選SNPs的目標(biāo)序列。2、序列測序與候選SNPs鑒定對上述挑選的序列設(shè)計(jì)PCR引物，產(chǎn)物的預(yù)期大小在500bp、00bp之間。以5個(gè)不同個(gè)體的DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將結(jié)果清晰、產(chǎn)量高、無非特異擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物送測序公司進(jìn)行雙向、直接測序。對測序結(jié)果進(jìn)行拼接、比對，鑒定候選SNPs位點(diǎn)。3、SNPs驗(yàn)證與基因分型針對每一個(gè)候選SNPs位點(diǎn)設(shè)計(jì)3條引物，包括2條等位基因特異的上游引物(Fl和F2)和I條通用的下游引物(R)。2條上游引物分別以SNP位點(diǎn)的2個(gè)不同的堿基作為引物的3’末端，并且在5’端分別加上長度不同的人工序列(GCGGGCAGGGCGGC和GCGGGC)。以擬穴青蟹I個(gè)野生群體共30只個(gè)體的基因組DNA為模板，采用上述引物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，分析其溶解曲線的差異。若出現(xiàn)2條溶解曲線，表明該SNP位點(diǎn)是雜合型的；若出現(xiàn)I條溶解曲線，表明該SNP位點(diǎn)是純合型的。由此，成功篩選到擬穴青蟹20個(gè)SNPs分子標(biāo)記(表1)，并獲得了這些SNPs位點(diǎn)在每個(gè)個(gè)體的基因型數(shù)據(jù)。表I
權(quán)利要求
1.一種擬穴青蟹SNPs分子標(biāo)記的篩選方法，包括(1)擬穴青蟹基因組DNA序列的獲取；(2)對所獲得的DNA序列設(shè)計(jì)引物，并在擬穴青蟹多個(gè)個(gè)體中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行序列測定，再比較分析不同個(gè)體間序列差異，鑒定出候選SNPs位點(diǎn)；(3)針對候選SNPs位點(diǎn)設(shè)計(jì)等位基因特異引物，采用熒光實(shí)時(shí)定量PCR儀進(jìn)行基因分型，并分析SNPs的基因型。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種擬穴青蟹SNPs分子標(biāo)記的篩選方法，其特征在于所述步驟(I)中的擬穴青蟹基因組DNA序列來源于測序獲得的基因組文庫或轉(zhuǎn)錄組文庫序列或GenBank數(shù)據(jù)庫中公開的擬穴青蟹基因組序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種擬穴青蟹SNPs分子標(biāo)記的篩選方法，其特征在于所述步驟(2)中的引物共設(shè)計(jì)11對，其序列和退火溫度如下第一對引物F CAATGGCTGACGCTGCTACRGCGCTTGTTGGAGATATCG退火溫度58°C ;第二對引物F GTGAGCACTGGGCTGTATGR GGTATGTGTTCTTTATTATTTCGT退火溫度58°C ;第三對引物F ACACGAAGTAACGAGCCGRGATGACCAAAGCAGCAAAA退火溫度57°C ；第四對引物F CCTGTTGACTGGGAGTGTCR AATGATGCAAGCCTAGTATGA退火溫度56°C ;第五對引物F CAACATGTGTGACGACGAAGTR AGGATGGCGTAGGGAAGG退火溫度60°C ;第六對引物F GCAGCATCATCTATATTTGTTCR GCTTGTAATGTTTAGTTGGTCA退火溫度59°C ;第七對引物F GATGAAGGTCACGAGCAGARTGATGGCTGAAGCACAATAC退火溫度58°C ;第八對引物F TTTAGCACCATTAGGACTGR GAGGATGACCTGGAGAAG退火溫度56°C ;第九對引物F TAACGCACTAACAATTCTGCTRCAACCACATTCACTCATGGA退火溫度56°C ;第十對引物F GAACAAGAGTTTGGCCTAGTRTCAATATCATCAGAGTTATTTTATT退火溫度52°C ； 第i^一對引物F CACCTACCTTCTTCCTTCCAGT RCGGGGGTTGTCAAGAGTGT 退火溫度60°C。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的ー種擬穴青蟹SNPs分子標(biāo)記的篩選方法，其特征在于所述步驟(2)中的PCR擴(kuò)增需在5 30個(gè)不存在親緣關(guān)系的個(gè)體中進(jìn)行。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的ー種擬穴青蟹SNPs分子標(biāo)記的篩選方法，其特征在于所述步驟(2)中的測序方法為PCR產(chǎn)物雙向直接測序。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的ー種擬穴青蟹SNPs分子標(biāo)記的篩選方法，其特征在于所述步驟(2)中的候選SNPs的鑒定方法是通過比較分析不同個(gè)體測序峰圖，尋找不同個(gè)體在相同DNA堿基位置上的單堿基突變位點(diǎn)，即為候選SNPs。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的ー種擬穴青蟹SNPs分子標(biāo)記的篩選方法，其特征在于所述步驟(3)中的等位基因特異引物的設(shè)計(jì)方法為每個(gè)位點(diǎn)設(shè)計(jì)3條引物，包括2條長度不一的上游引物Fl和F2，且在其5’端分別連接長度不一的人工序列GCGGGCAGGGCGGC和GCGGGC ；1條下游通用引物R。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的ー種擬穴青蟹SNPs分子標(biāo)記的篩選方法，其特征在于所述步驟(3)中的SNPs位點(diǎn)及其等位基因特異引物序列特征如下ScPaSNP28 F1 GCGGGCAGGGCGGCACTGGCCCACTGGTCGCF2 GCGGGCACTGGCCCACTGGCGGTRACACCAGGAAGGTCTTGTTGTCGTT ；ScPaSNP34 F1 GCGGGCAGGGCGGCCAGGTAGTGGCTGGTGAAGACATCF2 GCGGGCCAGGTAGTGGCTGGTGAAGACATTRTTGGATAGGATCACCGTCTGCTCGT ；ScPaSNP35 F1 GCGGGCAGGGCGGCAGGTCACGAGCAGACGGAGACF2 GCGGGCAGGTCACGAGCAGACGGAGATR TGGTAAATGAATTGTAATCCTCGTGCT ；ScPaSNP36 F1 GCGGGCAGGGCGGCGTGAGTGCGTCGTGTCTGGCF2 GCGGGCGTGAGTGCGTCGTGTGAGGARATGCAGATTGTATGGACTTTGACCTCC ；ScPaSNP39 F1 GCGGGCAGGGCGGCCGGTTCTATTTAATGCGTGCGF2 GCGGGCCGGTTCTATTTAATGCGTGCARCACAGTACAAAGACGTGGCCTCGAA ；ScPaSNP40 F1 GCGGGCAGGGCGGCGCCATAAGCAGCAGATAACCF2 GCGGGCAGCCATAAGCAGCAGATAATARCTTTGGTAGTCAGGTACTGCCTAAGTCA ；ScPaSNP41 F1 GCGGGCAGGGCGGCTCACCAGTGTGTGATGGCGF2 GCGGGCGTCACCAGGGTGTGATGGACRCCGACGTAGGCATCCTTCTGAC ；
全文摘要
本發(fā)明涉及一種擬穴青蟹SNPs分子標(biāo)記的篩選方法，包括(1)通過測序獲得的基因組文庫或GenBank數(shù)據(jù)庫獲取擬穴青蟹基因組序列；(2)對獲取的基因組序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，經(jīng)PCR擴(kuò)增后進(jìn)行測序，對不同個(gè)體的序列進(jìn)行比對并鑒定候選SNPs；(3)對候選SNPs位點(diǎn)設(shè)計(jì)等位基因特異的引物，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的溶解曲線方法對SNPs進(jìn)行驗(yàn)證與基因分型。本發(fā)明具有實(shí)驗(yàn)周期短、成本低、操作簡單等優(yōu)點(diǎn)，能夠準(zhǔn)確地檢測出不同個(gè)體的基因型，從而為擬穴青蟹遺傳變異分析、種群遺傳多樣性評估及分子標(biāo)記輔助育種提供新型遺傳標(biāo)記。
文檔編號C12Q1/68GK103045739SQ20121055968
公開日2013年4月17日 申請日期2012年12月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月20日
發(fā)明者馬洪雨, 馮娜娜, 馬凌波, 馬春艷, 徐真 申請人:中國水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所