一種用于鑒定云南元江普通野生稻細(xì)胞質(zhì)雄性不育系的恢復(fù)系的分子標(biāo)記及專用引物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于鑒定云南元江普通野生稻細(xì)胞質(zhì)雄性不育系的恢復(fù)系的分子標(biāo)記及專用引物。本發(fā)明的用于輔助鑒別云南元江普通野生稻細(xì)胞質(zhì)雄性不育系的恢復(fù)系的引物對(duì)，一個(gè)引物的核苷酸序列如序列表中序列1所示，另一個(gè)引物的核苷酸序列如序列表中序列2所示。本發(fā)明的方法及專用引物和分子標(biāo)記可用于云南元江普通野生稻胞質(zhì)不育系的恢復(fù)系的選育，縮短含云南元江普通野生稻優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源的三系雜交水稻的育種周期，加快育種速度，降低育種成本，具有操作簡(jiǎn)單，成本低廉，周期短的優(yōu)點(diǎn)，適于推廣應(yīng)用，為選育具有云南元江普通野生稻遺傳背景的恢復(fù)系提供了一種快捷的選擇方法。
【專利說明】—種用于鑒定云南元江普通野生稻細(xì)胞質(zhì)雄性不育系的恢復(fù)系的分子標(biāo)記及專用引物
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種用于鑒定云南元江普通野生稻細(xì)胞質(zhì)雄性不育系的恢復(fù)系的分子標(biāo)記及專用引物。
【背景技術(shù)】
[0002]水稻是世界上最主要的糧食作物之一，提高水稻單產(chǎn)是保障世界糧食安全的有力措施之一。在作物長(zhǎng)期的進(jìn)化過程中，由于育種家根據(jù)需要選擇目標(biāo)性狀并對(duì)其進(jìn)行定向培育及親本的重復(fù)使用，使得品種遺傳基礎(chǔ)狹窄。目前，約占水稻種植面積的一半以上的雜交水稻，所使用的雜交組合95%以上是由野敗型或與野敗型相類似的細(xì)胞質(zhì)雄性不育系組配而成的，長(zhǎng)期使用單一來源細(xì)胞質(zhì)，可能出現(xiàn)遺傳脆弱性的危險(xiǎn)。
[0003]野生稻既是研究稻作起源、分類、演化的重要實(shí)物依據(jù)，又是栽培稻育種的寶貴種質(zhì)資源。野生稻也是天然的基因庫(kù)，保存有栽培稻沒有或已消失了的遺傳基因，并具有特殊優(yōu)良農(nóng)藝性狀，如雄性不育性、高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗逆性等。由于所處生態(tài)環(huán)境的復(fù)雜性在其漫長(zhǎng)的進(jìn)化過程中，形成了極其豐富的遺傳多樣性。Sun et al (2001)研究發(fā)現(xiàn)在檢測(cè)的44個(gè)RFLP位點(diǎn)中，栽培稻的等位基因數(shù)約為野生稻的60%，并提出:野生稻在演化成栽培稻的過程中，等位基因減少，基因多樣性下降，一些基因已在栽培稻中丟失(Sun C Q, Wang X K，LiZ C,Yoshimura A.Comparison of the genetic diversity of common wild rice(Oryzarufipogon Griff.) and cultivated rice (0.sativaL.) using RFLP markers.Theor ApplGenet，2001，102:157-162)。因此，研究如何從野生稻中挖掘優(yōu)異基因，并把它們應(yīng)用于栽培稻育種生產(chǎn)，具有十分重要的理論意義和實(shí)踐價(jià)值。
[0004]植物的胞質(zhì)雄性不育現(xiàn)象，在生產(chǎn)上作為一種遺傳育種工具，在農(nóng)作物雜種優(yōu)勢(shì)利用過程中省去人工去雄的麻煩，確保了雜交種子的純度，具有巨大的生產(chǎn)價(jià)值。在天然的植物中，普遍存在細(xì)胞質(zhì)雄性不育，這是植物系統(tǒng)進(jìn)化趨勢(shì)的必然產(chǎn)物，而且在自然條件下，恢復(fù)基因總是與細(xì)胞質(zhì)雄性不育相伴隨，這是不育細(xì)胞質(zhì)在群體中保存和傳遞的前提，這種核質(zhì)互作的恢保關(guān)系具有專一性，這也是細(xì)胞質(zhì)雄性不育分類及發(fā)現(xiàn)新的細(xì)胞質(zhì)雄性不育類型的主要依據(jù)。我國(guó)雜交稻生產(chǎn)中應(yīng)用的雄性不育細(xì)胞質(zhì)主要來源于普通野生稻，可以推測(cè)野生稻中也必然存在相應(yīng)的恢復(fù)基因(李紹清等，2005)，但用于生產(chǎn)上的恢復(fù)基因來源于野生稻的卻很少。本研究利用可育的元江普通野生稻與93-11構(gòu)建的高代回交群體，發(fā)現(xiàn)元江野生稻的細(xì)胞質(zhì)中存在不育基因，細(xì)胞核存在恢復(fù)基因，該不育細(xì)胞質(zhì)及其恢復(fù)基因的發(fā)現(xiàn)與定位，對(duì)豐富三系雜交稻不育細(xì)胞質(zhì)和恢復(fù)基因的遺傳多樣性具有重要的理論意義和實(shí)用價(jià)值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種用于輔助鑒別云南元江普通野生稻細(xì)胞質(zhì)雄性不育系的恢復(fù)系的方法及其專用分子標(biāo)記和專用引物。[0006]本發(fā)明所提供的用于輔助鑒別云南元江普通野生稻細(xì)胞質(zhì)雄性不育系的恢復(fù)系的引物對(duì)，一個(gè)引物的核苷酸序列如序列表中序列I所示，另一個(gè)引物的核苷酸序列如序列表中序列2所示。
[0007]本發(fā)明所提供的用于輔助鑒別云南元江普通野生稻細(xì)胞質(zhì)雄性不育系的恢復(fù)系的分子標(biāo)記，是用上述引物對(duì)PCR擴(kuò)增云南元江普通野生稻得到的PCR產(chǎn)物。
[0008]本發(fā)明所提供的輔助鑒別云南元江普通野生稻細(xì)胞質(zhì)雄性不育系的恢復(fù)系的方法，包括如下步驟:分別以云南元江普通野生稻和待測(cè)水稻品種的基因組DNA為模板，用上述引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，若所述待測(cè)水稻品種的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小與所述云南元江普通野生稻的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小一致，則所述待測(cè)水稻品種候選為云南元江普通野生稻細(xì)胞質(zhì)雄性不育系的恢復(fù)系。
[0009]上述方法中，所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小可以通過瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)確定。
[0010]上述方法中，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)確定的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小為lOObp。
[0011]上述引物對(duì)、上述分子標(biāo)記、上述方法中，所述云南元江普通野生稻細(xì)胞質(zhì)雄性不育系是以栽培稻93-11為遺傳背景、以云南元江普通野生稻為供體、高代回交得到的。
[0012]具體的，上述云南元江普通野生稻細(xì)胞質(zhì)雄性不育系是指“水稻的一個(gè)野栽滲入系的名稱命名為元9A”。
[0013]本發(fā)明的方法及專用引物和分子標(biāo)記可用于云南元江普通野生稻胞質(zhì)不育系的恢復(fù)系的選育，縮短含云南元江普通野生稻優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源的三系雜交水稻的育種周期，加快育種速度，降低育種成本，具有操作簡(jiǎn)單，成本低廉，周期短的優(yōu)點(diǎn)，適于推廣應(yīng)用，為選育具有云南元江普通野生稻遺傳背景的恢復(fù)系提供了一種快捷的選擇方法。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]圖1為元江野生稻，滲入系9YJ06，9311和元中9A的基因組DNA為模板，分別在引物489-5ac引導(dǎo)下的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(分子標(biāo)記)的帶型(所用Marker為北京拓英坊科技有限公司的 50bp DNA Ladder)ο
[0015]圖2為以20個(gè)水稻品種的基因組DNA為模板，在引物489_5ac弓丨導(dǎo)下的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(所用Marker為北京拓英坊科技有限公司的50bp DNA Ladder)。
【具體實(shí)施方式】
[0016]下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0017]下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0018]云南兀江普通野生稻(Yuanjiangcommon wild rice)在文獻(xiàn)(Tan LB, Li XR, LiuFX, Sun XY, Li CG, Zhu ZF, FuYC, Cai Hff, Wang XK, Xie DX and Sun CQ.Control of akey transition from prostrate to erect growth in rice domestication.NatureGenetics, 2008，40 (11): 1360-1364)中公開，公眾可以從中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得。
[0019]栽培稻93-11 (93-11)在文獻(xiàn)(Li XJj Sun LJj Tan LBj Liu FXj Zhu ZFj FuYCj SunXYj Sun XW, Xie DX and Sun CQ.THlj a DUF640domain_like gene controls lemma andpalea development in ric e Plant Mol Biol，2012，78:351 - 359)中公開，公眾可以從中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得。[0020]實(shí)施例1、專用引物及分子標(biāo)記的發(fā)現(xiàn)
[0021]本研究構(gòu)建一個(gè)以栽培稻93-11為遺傳背景，以云南元江普通野生稻為供體的高代回交群體BC6F1，并從群體中獲得了一個(gè)云南元江普通野生稻細(xì)胞質(zhì)的雄性不育系，命名為“元9A”,輪回親本93-11是其保持系。這表明帶有可育細(xì)胞質(zhì)的93-11能保持元9A的育性，而帶有不育細(xì)胞質(zhì)的元江野生稻能恢復(fù)元9A的育性。將元9A在北京、海南和合肥三地種植，配套的恢復(fù)系、保持系和不育系確定元9A是細(xì)胞質(zhì)雄性不育。
[0022]對(duì)元9A的花粉進(jìn)行I2-KI染色，發(fā)現(xiàn)元9A的花粉以典敗為主，并能被多個(gè)恢復(fù)系所恢復(fù)。將該不育系與生產(chǎn)上常用的恢復(fù)系或保持系測(cè)交，發(fā)現(xiàn)野敗型的恢復(fù)系(如IR24、明恢63等)和紅蓮型的保持系(粵泰B)可以恢復(fù)元9A的育性，元9A與恢復(fù)系的F2的小穗育性存在分離，而紅蓮型的恢復(fù)系(93-11和特青)卻對(duì)元9A的育性起保持作用，表明元9A是屬于孢子體不育類型，而不是配子體不育類型。同時(shí)，還發(fā)現(xiàn)元9A與野敗恢復(fù)系測(cè)交的F2群體的小穗育性，可育株和不育株分離比例符合3:1，表明元9A的育性恢復(fù)受I對(duì)基因控制。
[0023]根據(jù)元江野生稻和93-11的BC3F1群體472株的基因型，結(jié)合以花粉育性和套袋自交結(jié)實(shí)率為指標(biāo)的表型分析結(jié)果，采用QTL定位的方法對(duì)恢復(fù)基因進(jìn)行定位，在第10染色體RM171附近檢測(cè)到I個(gè)QTL。利用元9A與中9B轉(zhuǎn)育出野秈型不育系元中9A，并在元江野生稻C-21與9311的滲入系中找到具有恢復(fù)能力的滲入系材料9YJ06，通過元中9A和9YJ06構(gòu)建F2和F3群體用作定位群體。將恢復(fù)基因定位在引物6R23與YN37之間。在此區(qū)間內(nèi)依據(jù)日本晴序列，在日本晴和93-11間篩選存在基因組差異的區(qū)域并設(shè)計(jì)引物489-5ac，以其為引物，以元江野生稻、元中9A、93-11和9YJ06的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為:水稻基因組DNA模板20ng，Taq Plus DNA聚合酶0.5U，2.0 μ 110XPCR緩沖液(IOOmM Tris.Cl ρΗ9.0,500mM KCl, 15mM Mg2+, l%Triton X-100)，100 μ M dNTPs,正向引物0.2 μ M，反向引物0.2 μ M，用DEPC水補(bǔ)充反應(yīng)體系至20 μ I。PCR反應(yīng)條件為:先 94°C 5min ;隨后 94°C 30sec，58°C 30sec，72°C lmin，共 35 個(gè)循環(huán)；再 72°C IOmin0 通過濃度為2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物中是否有目的條帶。圖1中，泳道1、2分別是以元中9A和9311的基因組DNA為模 板，489_5ac為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增所得產(chǎn)物，產(chǎn)物大小約150bp ;泳道3、4分別是以滲入系9YJ06和元江野生稻的基因組DNA為模板，489_5ac為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增所得產(chǎn)物，產(chǎn)物大小約lOObp。由489-5ac得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(分子標(biāo)記)位于第10染色體上基因L0C_0sl0g35300至L0C_0sl0g35310的序列范圍內(nèi)，根據(jù)www.tigr.0rg提供的日本晴序列,此擴(kuò)增產(chǎn)物大小約為IOObp,與元江野生稻和滲入系中9YJ06的PCR產(chǎn)物大小相同，而元中9A中的PCR產(chǎn)物約150bp。檢測(cè)結(jié)果表明上述引物在元江野生稻和元中9A中均有擴(kuò)增產(chǎn)物，且在兩個(gè)材料中擴(kuò)增出的目的片段大小存在差異。
[0024]表1.489-5ac引物的序列
[0025]
【權(quán)利要求】
1.一種用于輔助鑒別云南元江普通野生稻細(xì)胞質(zhì)雄性不育系的恢復(fù)系的引物對(duì)，一個(gè)引物的核苷酸序列如序列表中序列I所示，另一個(gè)引物的核苷酸序列如序列表中序列2所示。
2.一種用于輔助鑒別云南元江普通野生稻細(xì)胞質(zhì)雄性不育系的恢復(fù)系的分子標(biāo)記，是用權(quán)利要求1所述引物對(duì)PCR擴(kuò)增云南元江普通野生稻得到的PCR產(chǎn)物。
3.一種輔助鑒別云南元江普通野生稻細(xì)胞質(zhì)雄性不育系的恢復(fù)系的方法，包括如下步驟:分別以云南元江普通野生稻和待測(cè)水稻品種的基因組DNA為模板，用權(quán)利要求1所述引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，若所述待測(cè)水稻品種的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小與所述云南元江普通野生稻的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小一致，則所述待測(cè)水稻品種候選為云南元江普通野生稻細(xì)胞質(zhì)雄性不育系的恢復(fù)系。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于:所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小是通過瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)確定的。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的方法，其特征在于:所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小為IOObp。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的引物對(duì)、權(quán)利要求2所述的分子標(biāo)記、或權(quán)利要求3-5所述的方法，其特征在于:所述云南元江普通野生稻細(xì)胞質(zhì)雄性不育系是以栽培稻93-11為遺傳背景、以云南元 江普通野生稻為供體、高代回交得到的。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103882096SQ201210560937
【公開日】2014年6月25日 申請(qǐng)日期:2012年12月20日 優(yōu)先權(quán)日:2012年12月20日
【發(fā)明者】孫傳清, 付強(qiáng), 霍興, 付永彩, 朱作峰, 譚祿賓, 劉鳳霞, 顧憑, 才宏偉 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)