雙齒圍沙蠶β-1,4-內(nèi)切葡聚糖酶基因序列及其克隆方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于分子生物學中基因克隆領(lǐng)域，具體的說是一種雙齒圍沙蠶β-1，4-內(nèi)切葡聚糖酶（EG）基因序列及其克隆方法。雙齒圍沙蠶β-1，4-內(nèi)切葡聚糖酶基因序列為SEQ?ID?NO.1中核苷酸序列所示。本發(fā)明從雙齒圍沙蠶中克隆到一種β-1，4-內(nèi)切葡聚糖酶基因，該序列cDNA全長1481bp，其中開放閱讀框位于31-1365位核苷酸，編碼444個氨基酸殘基。雙齒圍沙蠶β-1，4-內(nèi)切葡聚糖酶基因的成功克隆和測序，為進一步分析纖維素酶影響下生物抗逆能力，為纖維素酶其它功能的篩選及應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)；也為利用β-1，4-內(nèi)切葡聚糖酶基因?qū)Σ煌瑵舛任廴疚锏谋磉_情況來作為污染早期預(yù)警工具提供了方法學的指導。
【專利說明】雙齒圍沙蠶β -1, 4-內(nèi)切葡聚糖酶基因序列及其克隆方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分子生物學中基因克隆領(lǐng)域，具體的說是一種雙齒圍沙蠶β-1，4-內(nèi)切葡聚糖酶(EG)基因序列及其克隆方法。
【背景技術(shù)】
[0002]纖維素酶(cellulase)是能將纖維素水解成葡萄糖的一組酶的總稱。高等動物體內(nèi)是不產(chǎn)生纖維素酶的，而在蝸牛、螞蟻、蚯蚓等少數(shù)低等無脊椎動物體內(nèi)可以產(chǎn)生纖維素酶；草食動物瘤胃及盲腸中微生物產(chǎn)生的纖維素酶通過降解纖維素為草食動物提供能量。纖維素復(fù)合酶的水解作用是纖維素被徹底分解的有效途徑。纖維素酶系是一種多組分的復(fù)合酶，一般包括內(nèi)切型葡聚糖酶(EC3.2.1.4，也稱Cx酶、CMC酶)、外切型葡聚糖酶(EC3.2.1.91，也稱C1酶、微晶纖維素酶)和β-葡萄糖苷酶(EC3.2.21，簡稱β G或纖維二糖酶)等3種主要成分。有關(guān)纖維素酶的水解機理至今仍未完全清楚，但普遍認為:首先外切纖維素酶使結(jié)晶結(jié)構(gòu)的纖維素長分子鏈開裂，聚集結(jié)構(gòu)解聚，長鏈分子末端部分發(fā)生游離，為纖維素水解酶的作用提高可及性和反應(yīng)性，從而使纖維素易于水化；然后內(nèi)切酶作用于經(jīng)外切酶活化的纖維素，分解分子中β -1, 4-糖苷鍵，產(chǎn)生纖維二糖、三糖等短鏈低聚糖；最后葡萄糖苷酶將纖維二糖等低聚糖水解成葡萄糖分子。天然纖維素水解成葡萄糖的過程須依靠這三種酶的協(xié)調(diào)作用才能完成，而內(nèi)切葡聚糖酶(endoglucanase,簡稱EG)是纖維素復(fù)合酶中的重要組成部分，作用于纖維素分子內(nèi)部的非結(jié)晶區(qū)，隨機水解β -1, 4-糖苷鍵，將長鏈纖維素分子截短，產(chǎn)生大量帶非還原性末端的小分子短鏈低聚糖，這些產(chǎn)物容易被葡萄糖苷酶降解為葡萄糖分子，而葡萄糖分子是很重要的生物能源。因此，對β_1，4-內(nèi)切葡聚糖酶進行研究是十分必要的。
[0003]雙齒圍沙蠶(Perinereisaibuhitensis)屬環(huán)節(jié)動物門多毛綱沙蠶科,作為潮間帶地區(qū)的常見物種，是各種魚類、甲殼類和海鳥的重要食餌。由于沙蠶位于水陸生態(tài)食物鏈的底部，能攝食底泥中的沉積物、有機碎屑和微生物等，此外，對重金屬和某些工業(yè)有機污染物具有一定積累和消化作用，因此被認為 是多毛類中耐污染能力較強的底棲生物。多毛類沙蠶可以很好地利用底質(zhì)中的有機污染物和一些重金屬轉(zhuǎn)化為自身的生產(chǎn)力，它們作為海洋食物鏈中的一個分室既是生產(chǎn)單元，又能夠凈化底質(zhì)，使系統(tǒng)內(nèi)部的廢棄物再利用和循環(huán)，增加環(huán)境生態(tài)效益，其體內(nèi)必然存在某種解毒和防御機制，而從我們過往研究中發(fā)現(xiàn)雙齒圍沙蠶的β_1，4-內(nèi)切葡聚糖酶能夠?qū)δ承┪廴久{迫產(chǎn)生反應(yīng)。因此，研究沙蠶纖維素蛋白基因?qū)沂竞屠闷浣舛痉烙到y(tǒng)功能具有重要意義，同時也為纖維素酶其它功能的篩選及應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種雙齒圍沙蠶β-1，4_內(nèi)切葡聚糖酶基因序列及其克隆方法。
[0005]為實現(xiàn)上述目的本發(fā)明采用的技術(shù)方案為:[0006]一種雙齒圍沙蠶β -1, 4-內(nèi)切葡聚糖酶基因序列，雙齒圍沙蠶β -1, 4-內(nèi)切葡聚糖酶基因序列為SEQ ID N0.1中核苷酸序列所示。
[0007]雙齒圍沙蠶β -1, 4-內(nèi)切葡聚糖酶基因序列編碼蛋白為SEQ ID N0.2中氨基酸序列所示。
[0008]雙齒圍沙蠶β_1，4-內(nèi)切葡聚糖酶基因序列的克隆方法，首先從雙齒圍沙蠶組織中提取總RNA ;而后采用下游外側(cè)特異性引物EG-Outer-R (5’ -TTCCTGTCTGCTCCATATCC-3’ )和下游內(nèi)側(cè)特異性引物 EG-1nner-R (5，-GTTAGGTCCTGG CCATTGTT-3’ )進行5’ -RACE反應(yīng)，克隆得到β_1，4-內(nèi)切葡聚糖酶基因5’端序列；再利用反向引物EG-F進行RT-PCR反應(yīng)，克隆得到β-1，4-內(nèi)切葡聚糖酶基因3’端序列，反向引物EG-F:5’-AACAGACCTGCTTGGAGCAT-3’ ；通過序列片段拼接矯正，最終獲得β _1，4-內(nèi)切葡聚糖酶基因核苷酸序列SEQ ID N0.1。
[0009]本發(fā)明具有如下優(yōu)點:
[0010]1.采用本發(fā)明對雙齒圍沙蠶β -1, 4-內(nèi)切葡聚糖酶基因的成功克隆和測序，首次確定其全部編碼序列和部分非編碼序列，從而也弄清了它所編碼的氨基酸序列，該序列可以用以設(shè)計引物再克隆該基因，也可以根據(jù)該序列或該序列所推導的氨基酸序列對該基因進行重組表達或基因轉(zhuǎn)移。
[0011]2.雙齒圍沙蠶β-1，4-內(nèi)切葡聚糖酶基因的成功克隆和測序，為進一步分析纖維素酶影響下生物抗逆能力，為纖維素酶其它功能的篩選及應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)；
[0012]3.利用本發(fā)明所得β -1, 4-內(nèi)切葡聚糖酶基因?qū)Σ煌瑵舛任廴疚锏谋磉_情況來作為污染早期預(yù)警工具提供了方法學的指導。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0013]圖1為本發(fā)明實施例提供 的雙齒圍沙蠶β -1, 4-內(nèi)切葡聚糖酶在不同濃度Cu脅迫下的表達效果圖。
【具體實施方式】
[0014]雙齒圍沙蠶β_1，4-內(nèi)切葡聚糖酶基因的克隆方法包括以下步驟:(1)通過分析近源物種β_1，4-內(nèi)切葡聚糖酶的EST序列及CDS序列的保守區(qū)設(shè)計簡并引物EG-Outer-R, EG-1nner-R和反向引物EG-F ；(2)從鮮活健康的雙齒圍沙蠶成體組織中提取總RNA ；(3)利用TaKaRa5’ -Full Race試劑盒及下游外側(cè)特異性引物EG-Outer-R和下游內(nèi)側(cè)特異性引物EG-1nner-R進行5’ -RACE反應(yīng)，克隆得到β -1, 4-內(nèi)切葡聚糖酶基因5’端序列；(4)利用反向引物EG-F進行RT-PCR反應(yīng)，克隆得到β _1，4-內(nèi)切葡聚糖酶基因3’端序列；另外，該反向引物還可以為序列表中SEQ ID N0.1核苷酸序列片段；(5)通過序列片段拼接矯正，最終獲得β_1，4-內(nèi)切葡聚糖酶基因核苷酸序列SEQ ID N0.1。
[0015]實施例1
[0016]雙齒圍沙蠶β -1, 4-內(nèi)切葡聚糖酶基因如SEQ ID N0.1所示:
[0017]gaaaacagtt tcaccagaag gaattcagtc atggcttcct ttgcttacat ccttgctgcg
[0018]gtggcacttc tggcttcctg ccatgcacag tacaactacc gcaacgcgct tcagaaatcc
[0019]atcctattct acgctgccca aagatctggc cgactcccta gtaacaaccc aatagactgg
【權(quán)利要求】
1.一種雙齒圍沙蠶β-1，4-內(nèi)切葡聚糖酶基因序列，其特征在于:雙齒圍沙蠶β -1, 4-內(nèi)切葡聚糖酶基因序列為SEQ ID N0.1中核苷酸序列所示。
2.—種權(quán)利要求1所述的雙齒圍沙蠶β -1, 4-內(nèi)切葡聚糖酶基因序列編碼蛋白，其特征在于:雙齒圍沙蠶β -1, 4-內(nèi)切葡聚糖酶基因序列編碼蛋白為SEQ ID N0.2中氨基酸序列所示。
3.一種權(quán)利要求1所述的雙齒圍沙蠶β-1，4-內(nèi)切葡聚糖酶基因序列的克隆方法，其特征在于:首先從雙齒圍沙蠶組織中提取總RNA;而后采用下游外側(cè)特異性引物EG-Outer-R (5 ' -TTCCTGTCTGCTCCATATCC-3 ')和下游內(nèi)側(cè)特異性引物 EG-1nner-R(5; -GTTAGGTCCTGGCCATTGTT-3')進行5’-RACE反應(yīng)，克隆得到β -1, 4-內(nèi)切葡聚糖酶基因5’端序列；再利用反向引物EG-F進行RT-PCR反應(yīng)，克隆得到β -1, 4-內(nèi)切葡聚糖酶基因3’端序列，反向引物EG-F:5' -AACAGACCTGCTTGGAGCAT-3';通過序列片段拼接矯正，最終獲得β_1 ，4-內(nèi)切葡聚糖酶基因核苷酸序列SEQ ID N0.1。
【文檔編號】C12N9/42GK103882040SQ201210562478
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2012年12月21日 優(yōu)先權(quán)日:2012年12月21日
【發(fā)明者】張倩茹, 牟文燕, 魏樹和, 周啟星 申請人:中國科學院沈陽應(yīng)用生態(tài)研究所