雙齒圍沙蠶熱休克蛋白70基因序列及其克隆方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于分子生物學(xué)中基因克隆領(lǐng)域，具體的說是一種雙齒圍沙蠶熱休克蛋白70（HSP70）基因序列及其克隆方法。雙齒圍沙蠶熱休克蛋白70基因序列為SEQ?ID?NO.1中核苷酸序列所示。本發(fā)明首次從雙齒圍沙蠶中克隆到一種熱休克蛋白70基因，該序列cDNA全長2161bp，其中開放閱讀框位于49-2019位核苷酸，編碼656個(gè)氨基酸殘基。雙齒圍沙蠶熱休克蛋白70基因的成功克隆和測序，為進(jìn)一步分析HSP70影響下生物抗逆能力，為HSP70其它功能的篩選及應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)；也為利用HSP70基因?qū)Σ煌瑵舛任廴疚锏谋磉_(dá)情況來作為污染早期預(yù)警工具提供了方法學(xué)的指導(dǎo)。
【專利說明】雙齒圍沙蠶熱休克蛋白70基因序列及其克隆方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分子生物學(xué)中基因克隆領(lǐng)域，具體的說是一種雙齒圍沙蠶熱休克蛋白70 (HSP70)基因序列及其克隆方法。
【背景技術(shù)】
[0002]熱休克蛋白(heat shock protein, HSP)是指細(xì)胞在應(yīng)激原特別是環(huán)境高溫誘導(dǎo)下所產(chǎn)生的一組蛋白質(zhì)。HSP首先是在果蠅體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的。1962年，發(fā)現(xiàn)將果蠅的培養(yǎng)濕度從25°C提高到30°C (熱休克環(huán)境溫度升高)，30分鐘后就可在多絲染色體上看到蓬松現(xiàn)象(或稱膨突puff)，提示這些區(qū)帶基因的轉(zhuǎn)錄加強(qiáng)并可能有某些蛋白質(zhì)的合成增加。1974年，人們從熱休克果蠅幼蟲的唾液腺等部位分離到了 6種新的蛋白質(zhì)，即熱休克蛋白。除環(huán)境高溫以外，其他應(yīng)激原如缺氧、寒冷、感染、饑餓、創(chuàng)傷、中毒等也能誘導(dǎo)細(xì)胞生成熱休克蛋白。因此，熱休克蛋白(HSP)又稱應(yīng)激蛋白(stress protein，SP)，但習(xí)慣上仍稱為HSP。近年研究表明:熱休克蛋白的生成，不僅見于果蠅，而且普遍存在于從細(xì)菌至人類的整個(gè)生物界(包括植物和動物)。絕大部分生物細(xì)胞生成的HSP分子量都在80~110kD、68~74kD和18~30kD之間。作為一個(gè)具有多成員的龐大糖蛋白超基因家族，根據(jù)其同源程度及相對分子質(zhì)量大小可分為 HSP110、HSP90、HSP70、HSP60 和小 HSP (HSP25、HSP27、HSP28)五大家族。此外，還有一部分HSP是以相關(guān)糖蛋白來分類的，如糖相關(guān)蛋白94和糖相關(guān)蛋白7。不同分子量的熱休克蛋白，在細(xì)胞內(nèi)的分布也有所不同，例如，在酵母菌中發(fā)現(xiàn)的分子量為89kD的HSP分布于細(xì)胞漿中，而分子量為68kD、70kD、110kD的HSP卻主要分布于細(xì)胞核或核仁區(qū)域。
[0003]熱休克蛋白70是最為保守和重要的一個(gè)熱休克蛋白家族，具有多種生物學(xué)功能，包括分子伴侶功能、參與免疫反應(yīng)、抗細(xì)胞凋亡功能、抗氧化功能、提高細(xì)胞的應(yīng)激耐受性、促進(jìn)細(xì)胞增殖、參與細(xì)胞骨架的形成和修復(fù)等，其廣泛的生物學(xué)功能使之成為當(dāng)今生命科學(xué)研究的熱點(diǎn)，因此，研究這類進(jìn)化上非常保守的蛋白基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制和相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)是非常重要的。
[0004]雙齒圍沙蠶(Perinereis aibuhitensis)屬環(huán)節(jié)動物門多毛綱沙蠶科，作為潮間帶地區(qū)的常見物種，是各種魚類、甲殼類和海鳥的重要食餌。由于沙蠶位于水陸生態(tài)食物鏈的底部，能攝食底泥中的沉積物、有機(jī)碎屑和微生物等，此外，對重金屬和某些工業(yè)有機(jī)污染物具有一定積累和消化作用，因此被認(rèn)為是多毛類中耐污染能力較強(qiáng)的底棲生物。多毛類沙蠶可以很好地利用底質(zhì)中的有機(jī)污染物和一些重金屬轉(zhuǎn)化為自身的生產(chǎn)力，它們作為海洋食物鏈中的一個(gè)分室既是生產(chǎn)單元，又能夠凈化底質(zhì)，使系統(tǒng)內(nèi)部的廢棄物再利用和循環(huán)，增加環(huán)境生態(tài)效益，其體內(nèi)必然存在某種解毒和防御機(jī)制，而在其中HSP家族基因是必不可少的研究對象。因此，研究沙蠶熱休克蛋白基因?yàn)榻沂竞屠闷浣舛痉烙到y(tǒng)功能具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】
[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種雙齒圍沙蠶熱休克蛋白70 (HSP70)基因序列及其克隆方法。
[0006]為實(shí)現(xiàn)上述目的本發(fā)明采用的技術(shù)方案為:
[0007]—種雙齒圍沙香熱休克蛋白70基因序列,雙齒圍沙香熱休克蛋白70基因序列為SEQ ID N0.1中核苷酸序列所示。
[0008]雙齒圍沙香熱休克蛋白70基因序列編碼蛋白，雙齒圍沙香熱休克蛋白70基因序列編碼蛋白為SEQ ID N0.2中氨基酸序列所示。
[0009]雙齒圍沙蠶熱休克蛋白70基因序列的克隆方法，首先從雙齒圍沙蠶組織中提取總RNA ;而后采用下游外側(cè)特異性引物HSP70-0uter-R (5’-AGTCTTGCCGATGTAAGCCT-3’)和下游內(nèi)側(cè)特異性引物 HSP70-1nner-R (5’-TTGGCGTCGAAGACTGTGTT-3’)進(jìn)行 5’-RACE 反應(yīng)，克隆得到熱休克蛋白70基因5’端序列；再利用反向引物HSP70-F進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，克隆得到熱休克蛋白70基因3’端序列，反向引物HSP70-F:5’ -GGTCAACCACTTCATTCAGG-3’ ；通過序列片段拼接矯正，最終獲得熱休克蛋白70基因核苷酸序列SEQ ID N0.1。
[0010]本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn):
[0011]1.采用本發(fā)明對雙齒圍沙蠶熱休克蛋白70基因的成功克隆和測序，首次確定其全部編碼序列和部分非編碼序列，從而也弄清了它所編碼的氨基酸序列，該序列可以用以設(shè)計(jì)引物再克隆該基因，也可以根據(jù)該序列或該序列所推導(dǎo)的氨基酸序列對該基因進(jìn)行重組表達(dá)或基因轉(zhuǎn)移。
[0012]2.雙齒圍沙蠶熱休克蛋白70基因的成功克隆和測序，為進(jìn)一步分析HSP70影響下生物抗逆能力，為HSP70其它功能的篩選及應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)；
[0013]3.利用本發(fā)明所得HSP70基因?qū)Σ煌?濃度污染物的表達(dá)情況來作為污染早期預(yù)警工具提供了方法學(xué)的指導(dǎo)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]圖1為本發(fā)明實(shí)施例提供的雙齒圍沙蠶熱休克蛋白70在不同濃度Cu脅迫下的表達(dá)效果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0015]本發(fā)明通過對雙齒圍沙蠶差減文庫中所獲得的表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)與NCBI上的HSP70的EST序列進(jìn)行比對分析，利用DNAstar中的SeqMan軟件分析所有HSP70的同源性區(qū)域設(shè)計(jì)簡并引物；其克隆方法包括:(I)通過分析近源物種熱休克蛋白70的EST序列及CDS序列的保守區(qū)設(shè)計(jì)簡并引物HSP70-0uter-R、HSP70-1nner-R和反向引物HSP70-F ；(2)從鮮活健康的雙齒圍沙蠶成體組織中提取總RNA ; (3)利用TaKaRa 5’_Full Race試劑盒及下游外側(cè)特異性引物HSP70-0uter-R和下游內(nèi)側(cè)特異性引物HSP70_Inner-R進(jìn)行5’-RACE反應(yīng)，克隆得到熱休克蛋白70基因5’端序列；(4)利用反向引物HSP70-F進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，克隆得到熱休克蛋白70基因3’端序列；另外，該反向引物還可以為序列表中SEQ IDN0.1核苷酸序列片段；(5)通過序列片段拼接矯正，最終獲得熱休克蛋白70基因核苷酸序列 SEQ ID N0.1。
[0016]本發(fā)明首次從雙齒圍沙香中克隆到一種熱休克蛋白70基因，該序列cDNA全長2161bp，其中開放閱讀框位于49-2019位核苷酸，編碼656個(gè)氨基酸殘基。
[0017]實(shí)施例1
[0018]雙齒圍沙蠶HSP70基因如SEQ ID N0.1所示:
【權(quán)利要求】
1.一種雙齒圍沙香熱休克蛋白70基因序列,其特征在于:雙齒圍沙香熱休克蛋白70基因序列為SEQ ID N0.1中核苷酸序列所示。
2.—種權(quán)利要求1所述的雙齒圍沙香熱休克蛋白70基因序列編碼蛋白，其特征在于:雙齒圍沙香熱休克蛋白70基因序列編碼蛋白為SEQ ID N0.2中氣基酸序列所不。
3.—種權(quán)利要求1所述的雙齒圍沙蠶熱休克蛋白70基因序列的克隆方法，其特征在于:首先從雙齒圍沙蠶組織中提取總RNA;而后采用下游外側(cè)特異性引物HSP70-0uter-R (5，-AGTCTTGCCGATGTAAGCCT-3’)和下游內(nèi)側(cè)特異性引物 HSP70_Inner-R(5，-TTGGCGTCGAAGACTGTGTT-3’ )進(jìn)行5’ RACE反應(yīng)，克隆得到熱休克蛋白70基因5’端序列；再利用反向引物HSP70-F進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，克隆得到熱休克蛋白70基因3’端序列，反向引物HSP70-F:5’ -GGTCAACCACTTCATTCAGG-3’ ；通過序列片段拼接矯正，最終獲得熱休克蛋白70基因核苷酸序列SEQ ID N0. 1。
【文檔編號】C12N15/10GK103882025SQ201210563321
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2012年12月21日 優(yōu)先權(quán)日:2012年12月21日
【發(fā)明者】張倩茹, 魏樹和, 張靖宜, 牟文燕, 周啟星 申請人:中國科學(xué)院沈陽應(yīng)用生態(tài)研究所