雙齒圍沙蠶基質(zhì)金屬蛋白酶19基因序列及其克隆方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于分子生物學(xué)中基因克隆領(lǐng)域,具體的說是一種雙齒圍沙蠶基質(zhì)金屬蛋白酶19(MMP19)基因序列及其克隆方法。雙齒圍沙蠶基質(zhì)金屬蛋白酶19基因序列為SEQ?ID?NO.1中核苷酸序列所示。本發(fā)明首次從雙齒圍沙蠶中克隆到一種基質(zhì)金屬蛋白酶19基因,該序列cDNA全長1310bp,其中開放閱讀框位于21-1118位核苷酸,編碼365個氨基酸殘基。雙齒圍沙蠶基質(zhì)金屬蛋白酶19基因的成功克隆和測序,為進(jìn)一步分析MMP19影響下生物抗逆能力,為MMP19其它功能的篩選及應(yīng)用奠定了基礎(chǔ);也為利用MMP19基因?qū)Σ煌瑵舛任廴疚锏谋磉_(dá)情況來作為污染早期預(yù)警工具提供了方法學(xué)的指導(dǎo)。
【專利說明】雙齒圍沙蠶基質(zhì)金屬蛋白酶19基因序列及其克隆方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分子生物學(xué)中基因克隆領(lǐng)域,具體的說是一種雙齒圍沙蠶基質(zhì)金屬蛋白酶19 (MMP19)基因序列及其克隆方法。
【背景技術(shù)】
[0002]基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMP)是一類在結(jié)構(gòu)上具有極大同源性,能降解多種細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)和基底膜蛋白質(zhì)的內(nèi)肽酶,因需要Ca2+、Zn2+等金屬離子作為輔助因子而得名,其家族成員具有相似的結(jié)構(gòu),一般由5個功能不同的結(jié)構(gòu)域組成:(I)疏水信號肽序列;(2)前肽區(qū),主要作用是保持酶原的穩(wěn)定。當(dāng)該區(qū)域被外源性酶切斷后,MMP酶原被激活;(3)催化活性區(qū),有鋅離子結(jié)合位點,對酶催化作用的發(fā)揮至關(guān)重要;
(4)富含脯氨酸的鉸鏈區(qū);(5)羧基末端區(qū),與酶的底物特異性有關(guān)。其中酶催化活性區(qū)和前肽區(qū)具有高度保守性。基質(zhì)金屬蛋白酶家族在人類的多種病理過程中表達(dá),主要參與正常組織和異常組織的構(gòu)建、修復(fù),正常和病態(tài)細(xì)胞在體內(nèi)的遷移、血管形成、炎癥反應(yīng)、傷口愈合、腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移等過程。MMP幾乎能降解細(xì)胞外基質(zhì)中的各種蛋白成分,破壞腫瘤細(xì)胞侵襲的組織學(xué)屏障,在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵作用,被認(rèn)為是腫瘤侵潤轉(zhuǎn)移過程中主要的蛋白水解酶,因此MMP家族的 作用機(jī)理和功能研究備受關(guān)注。
[0003]由于MMP家族在進(jìn)化上非常保守,在很多物種中都發(fā)現(xiàn)了它的同系物。目前MMP家族已分離鑒別出26種成員,編號分別為MMPl~26。在脊椎動物中發(fā)現(xiàn)了至少24種家族成員,由于它們之間互相聯(lián)系功能非常復(fù)雜,所以它們在生理發(fā)育上的功能及作用機(jī)理至今沒有搞清楚?,F(xiàn)已了解到MMP在多細(xì)胞生物體中進(jìn)化保守,而且在無脊椎動物中的MMP種類少,作用機(jī)理較為簡單,便于研究。所以對無脊椎動物中MMP的研究能夠為脊椎動物,乃至人類醫(yī)學(xué)方面的研究提供更多的參考。目前已報道的無脊椎動物中MMP的功能類似于哺乳動物,其基本功能是參與細(xì)胞外基質(zhì)成分的降解,大部分的MMP都是參與組織重構(gòu)、腫瘤侵襲、先天性免疫等過程。
[0004]雙齒圍沙蠶(Perinereis aibuhitensis)屬環(huán)節(jié)動物門多毛綱沙蠶科,作為潮間帶地區(qū)的常見物種,是各種魚類、甲殼類和海鳥的重要食餌。由于沙蠶位于水陸生態(tài)食物鏈的底部,能攝食底泥中的沉積物、有機(jī)碎屑和微生物等,此外,對重金屬和某些工業(yè)有機(jī)污染物具有一定積累和消化作用,因此被認(rèn)為是多毛類中耐污染能力較強(qiáng)的底棲生物。多毛類沙蠶可以很好地利用底質(zhì)中的有機(jī)污染物和一些重金屬轉(zhuǎn)化為自身的生產(chǎn)力,它們作為海洋食物鏈中的一個分室既是生產(chǎn)單元,又能夠凈化底質(zhì),使系統(tǒng)內(nèi)部的廢棄物再利用和循環(huán),增加環(huán)境生態(tài)效益,其體內(nèi)必然存在某種解毒和防御機(jī)制,而從我們過往研究中發(fā)現(xiàn)雙齒圍沙蠶的MMP19基因能夠?qū)Σ煌瑵舛韧庠次镔|(zhì)的誘導(dǎo)呈現(xiàn)不同的表達(dá)特征。因此,研究沙香MMP19基因可以為基質(zhì)金屬蛋白酶家族功能研究開辟新的研究途徑,為揭不和利用其調(diào)控機(jī)制具有重要參考價值。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種雙齒圍沙蠶基質(zhì)金屬蛋白酶19 (MMP19)基因序列及其克隆方法。
[0006]為實現(xiàn)上述目的本發(fā)明采用的技術(shù)方案為:
[0007]—種雙齒圍沙香基質(zhì)金屬蛋白酶19基因序列,雙齒圍沙香基質(zhì)金屬蛋白酶19基因序列為SEQ ID N0.1中核苷酸序列所示。
[0008]雙齒圍沙香基質(zhì)金屬蛋白酶19基因序列編碼蛋白,雙齒圍沙香基質(zhì)金屬蛋白酶19基因序列編碼蛋白為SEQ ID N0.2中氨基酸序列所示。
[0009]雙齒圍沙香基質(zhì)金屬蛋白酶19基因序列的克隆方法,首先從雙齒圍沙香組織中提取總RNA ;而后采用下游外側(cè)特異性引物MMP19-0uter-R (5’ -GCAGCTTCAATGTTGTAAGG-3’ )和下游內(nèi)側(cè)特異性引物 MMP19-1nner-R (5,-GCACATCCATAGAGTCCTCA-3’ )進(jìn)行 5’ -RACE 反應(yīng),克隆得到基質(zhì)金屬蛋白酶19基因5’端序列;再利用反向引物MMP19-F進(jìn)行RT-PCR反應(yīng),克隆得到基質(zhì)金屬蛋白酶19基因3’端序列,反向引物MMP19-F:5’-GCCGAGGTCTGGAAGTATTG-3’ ;通過序列片段拼接矯正,最終獲得基質(zhì)金屬蛋白酶19基因核苷酸序列SEQ IDN0.1。
[0010]本發(fā)明具有如下優(yōu)點:
[0011]1.米用本發(fā)明對雙齒圍沙香基質(zhì)金屬蛋白酶19基因的成功克隆 和測序,首次確定其全部編碼序列和部分非編碼序列,從而也弄清了它所編碼的氨基酸序列,該序列可以用以設(shè)計引物再克隆該基因,也可以根據(jù)該序列或該序列所推導(dǎo)的氨基酸序列對該基因進(jìn)行重組表達(dá)或基因轉(zhuǎn)移。
[0012]2.雙齒圍沙香基質(zhì)金屬蛋白酶19基因的成功克隆和測序,為進(jìn)一步分析MMP19影響下生物抗逆能力,為MMP19其它功能的篩選及應(yīng)用奠定了基礎(chǔ);
[0013]3.利用本發(fā)明所得MMP19基因?qū)Σ煌瑵舛任廴疚锏谋磉_(dá)情況來作為污染早期預(yù)警工具提供了方法學(xué)的指導(dǎo)。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0014]圖1為本發(fā)明實施例提供的雙齒圍沙蠶基質(zhì)金屬蛋白酶19在不同濃度Cu脅迫下的表達(dá)效果圖。
【具體實施方式】
[0015]本發(fā)明通過對雙齒圍沙蠶差減文庫中所獲得的表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)與NCBI上的MMP19的EST序列進(jìn)行比對分析,利用DNAstar中的SeqMan軟件分析所有MMP19的同源性區(qū)域設(shè)計簡并引物;其克隆方法包括:(I)通過分析近源物種基質(zhì)金屬蛋白酶19的EST序列及CDS序列的保守區(qū)設(shè)計簡并引物MMP19-0uter-R、MMP19-1nner-R和反向引物MMP19-F ;
(2)從鮮活健康的雙齒圍沙蠶成體組織中提取總RNA ;(3)利用TaKaRa 5’ -Full Race試劑盒及下游外側(cè)特異性引物MMP19-0uter-R和下游內(nèi)側(cè)特異性引物MMP19_Inner-R進(jìn)行5’-RACE反應(yīng),克隆得到基質(zhì)金屬蛋白酶19基因5’端序列;(4)利用反向引物MMP19-F進(jìn)行RT-PCR反應(yīng),克隆得到基質(zhì)金屬蛋白酶19基因3’端序列;另外,該反向引物還可以為序列表中SEQ ID N0.1核苷酸序列片段;(5)通過序列片段拼接矯正,最終獲得基質(zhì)金屬蛋白酶19基因核苷酸序列SEQ ID N0.1。[0016]本發(fā)明首次從雙齒圍沙蠶中克隆到一種基質(zhì)金屬蛋白酶19基因,該序列cDNA全長1310bp,其中開放閱讀框位于21-1118位核苷酸,編碼365個氨基酸殘基。
[0017]實施例1
[0018]雙齒圍沙蠶基質(zhì)金屬蛋白酶19如SEQ ID N0.1所示:
【權(quán)利要求】
1.一種雙齒圍沙香基質(zhì)金屬蛋白酶19基因序列,其特征在于:雙齒圍沙香基質(zhì)金屬蛋白酶19基因序列為SEQ ID N0.1中核苷酸序列所示。
2.—種權(quán)利要求1所述的雙齒圍沙蠶基質(zhì)金屬蛋白酶19基因序列編碼蛋白,其特征在于:雙齒圍沙香基質(zhì)金屬蛋白酶19基因序列編碼蛋白為SEQID N0.2中氣基酸序列所不。
3.—種權(quán)利要求1所述的雙齒圍沙蠶基質(zhì)金屬蛋白酶19基因序列的克隆方法,其特征在于:首先從雙齒圍沙蠶組織中提取總RNA;而后采用下游外側(cè)特異性引物MMP19-0uter-R(5/ -GCAGCTTCAATGTTGTAAGG-3')和下游內(nèi)側(cè)特異性引物 MMP19_Inner-R(5; -GCACATCCATAGAGTCCTCA-3')進(jìn)行5’ -RACE反應(yīng),克隆得到基質(zhì)金屬蛋白酶19基因5’端序列;再利用反向引物MMP19-F進(jìn)行RT-PCR反應(yīng),克隆得到基質(zhì)金屬蛋白酶19基因3’端序列,反向引物MMP19-F:5' -GCCGAGGTCTGGAAGTATTG-3';通過序列片段拼接矯正,最終獲得熱休克蛋白 0基因核苷酸序列SEQ ID N0.1。
【文檔編號】C12N15/57GK103882041SQ201210563433
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2012年12月21日 優(yōu)先權(quán)日:2012年12月21日
【發(fā)明者】張倩茹, 魏樹和, 牟文燕 申請人:中國科學(xué)院沈陽應(yīng)用生態(tài)研究所