一種前列腺癌熒光定量pcr診斷試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種用于快速檢測(cè)前列腺癌標(biāo)志物—DD3PCA3基因的存在的熒光定量PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))檢測(cè)試劑盒，適用于定性或定量檢測(cè)前列腺癌標(biāo)志物—DD3PCA3基因的存在；前列腺癌熒光定量PCR診斷試劑盒包括：DNA提取液，PCR反應(yīng)預(yù)混液，熱啟動(dòng)Taq酶，陽性標(biāo)準(zhǔn)品，陰性質(zhì)控品；本發(fā)明提供了一種特異性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好、定量準(zhǔn)確、速度快且通量高的前列腺癌熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒，具有更加省時(shí)、操作簡(jiǎn)便和定量準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)。
【專利說明】一種前列腺癌熒光定量PCR診斷試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種用于檢測(cè)前列腺癌細(xì)胞或組織中DD3rcA3基因存在的熒光定量PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))診斷試劑盒，適用于定性或定量檢測(cè)前列腺癌細(xì)胞或組織中DD3rcA3基因的存在。
【背景技術(shù)】
[0002]前列腺癌(prostate carcinoma,PCa)的發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈上升趨勢(shì),在歐美國(guó)家居男性惡性腫瘤第2位。我國(guó)隨著人口老年化，前列腺癌發(fā)病率日漸增加，成為危害我國(guó)老年男性健康的重要因素。前列腺癌的自然史十分獨(dú)特，除少數(shù)病例外，其生長(zhǎng)大多比較緩慢，平均倍增時(shí)間和轉(zhuǎn)移較慢，潛伏期較長(zhǎng)，有些甚至終生不被發(fā)現(xiàn)。許多患者早期沒有任何主觀不適，等到出現(xiàn)相應(yīng)臨床癥狀時(shí)已至疾病晚期，從而錯(cuò)過了最佳治療時(shí)機(jī)。因此，臨床上探尋前列腺癌新的診斷方法以協(xié)助前列腺癌的早期診斷，一直是人們研究的熱點(diǎn)。自1979年Wang等首先從前列腺組織內(nèi)分離和提純前列腺特異性抗原(PSA)以來，PSA在臨床上得到了大量的研究和應(yīng)用。PSA屬激肽釋放酶家族蛋白，為一種絲氨酸蛋白酶，是目前臨床上應(yīng)用最廣泛的前列腺腫瘤標(biāo)志物，研究表明PSA是前列腺組織特異性抗原，而不是PCa特異性抗原，故PCa可引起血清PSA水平升高，但是良性前列腺增生、前列腺炎、急性尿滯留、前列腺的各種手術(shù)操作和有關(guān)前列腺的各種檢查(如DRE)均可引起血清PSA水平的升高，疾病特異性比較差。當(dāng)PSA > 10ng/mL時(shí)，檢出PCa的幾率約70% ;當(dāng)PSA處于灰區(qū)(4~10ng/mL)時(shí)，僅有25%為PCa。PSA處于灰區(qū)時(shí)，應(yīng)用年齡校正的PSA正常值、PSA密度(PSAD)、PSA速率(PSAV)、游離PSA與總PSA比值(F/T)等衍生指標(biāo)雖然能提高診斷的特異性、減少約30%的不必要的穿刺活檢，但也使25%的患者漏診，約15%的PCa患者血清PSA小于4ng/mL。為尋找對(duì)PCa發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后進(jìn)行監(jiān)測(cè)的標(biāo)志物，許多學(xué)者從多方面、多角度對(duì)PCa進(jìn)行著探索性研究?；诿舾行浴⑻禺愋?、創(chuàng)傷性及實(shí)用性等方面的優(yōu)勢(shì)，PCa腫瘤標(biāo)志物的研究日益受到人們的重視。近年來，隨著對(duì)PCa分子水平研究的不斷深入，已分離至Ij一種新的 PCa 標(biāo)志物,即 DD3 (differential displaycode 3), DD3PCA3 基因是 1999年Bussemakers MJ等發(fā)現(xiàn)的一種功能為非編碼RNA的基因，定位于人類染色體9q21~22,全長(zhǎng)約25kb，由4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子組成。在前列腺的上皮細(xì)胞內(nèi)表達(dá)一種非編碼的mRNA，它參與多聚腺苷酸的轉(zhuǎn)錄但并不產(chǎn)生細(xì)胞質(zhì)蛋白，其功能類似于結(jié)構(gòu)RNA，表達(dá)水平與PCa關(guān)系非常密切。研究表明DD3基因在PCa組織中的表達(dá)水平是與其相鄰的正常前列腺組織中的10-100倍，而且在人體的其他正常組織中都不表達(dá)，在其他腫瘤組織中的表達(dá)極其微量，并且在前列腺炎和前列腺增生組織中其表達(dá)也處于較低水平，這表明DD3基因是PCa的特異性標(biāo)志基因。當(dāng)有少量的前列腺組織惡變時(shí)，DD3rcA3基因即可過量表達(dá)，并能隨癌細(xì)胞排放進(jìn)入血液、前列腺按摩液、精液以及尿液，它們可穩(wěn)定存在于這些體液中并能夠被精確檢測(cè)。1996年美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司( BI)推出熒光定量PCR儀，實(shí)現(xiàn)了 PCR從定性到定量的飛躍。由于其具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好、定量準(zhǔn)確、速度快、全封閉反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)迅速成為了分子生物學(xué)研究中的重要工具。目前，該項(xiàng)技術(shù)已被應(yīng)用于病原體測(cè)定、腫瘤基因檢測(cè)、免疫分析、基因表達(dá)、突變及其多態(tài)性的研究等多個(gè)領(lǐng)域。因此，應(yīng)用熒光定量PCR技術(shù)開發(fā)一種用于快速檢測(cè)前列腺癌細(xì)胞或組織中DD3rcA3基因的試劑盒是十分必要的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的在于提供一種特異性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好且準(zhǔn)確度高的前列腺癌熒光定量PCR診斷試劑盒，具有更加省時(shí)、操作簡(jiǎn)便和定量準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)。
[0004]本發(fā)明主要包括試劑盒的組成和使用方法。
[0005]前列腺癌熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒包括:(I)總RNA提取試劑，(2) PCR反應(yīng)預(yù)混液，⑶熱啟動(dòng)Taq酶，(4)陽性標(biāo)準(zhǔn)品，(5)陰性質(zhì)控品；
[0006]具體的說:
[0007](I)總RNA提取試劑
[0008]總RNA提取試劑成分為=Trizol試劑，40mL，DEPC處理水，ImLX 2
[0009](2) PCR反應(yīng)預(yù)混液
[0010]PCR 反應(yīng)預(yù)混液包括 PCR 反應(yīng)緩沖成分(200mM KCl, 200mMTris-HCl, pH 8.3)，IOmM的上游引物D D3-95F和IOmM的下游引物DD3-521R，IOmM熒光探針DD3-FAM，25mMMgCl2，2.5mM的dNTPs (dATP，dGTP，dCTP和dTTP等體積混合物)，IU的熱啟動(dòng)Taq酶和無菌雙蒸水；
[0011]DD3-95F 序列為:5' -GGTGGGAAGGACCTGATGATAC-3'，
[0012]DD3-521R，序列為:5' -GGGCGAGGCTCATCGAT-3'，
[0013]DD3-FAM 序列為:5' -AGAAATGCCCGGCCGCCATC-3'，其中 5'標(biāo)記 FAM 基團(tuán)，3'標(biāo)記TAMARA基團(tuán)；
[0014]⑶熱啟動(dòng)Taq酶
[0015]熱啟動(dòng)Taq酶的濃度為5U/ul，每反應(yīng)體系加入IU。
[0016](4)陽性標(biāo)準(zhǔn)品
[0017]陽性標(biāo)準(zhǔn)品是前列腺癌的特異性標(biāo)志DD3基因中部分核酸片段連接到T載體上構(gòu)建的質(zhì)粒，核酸片段的序列為:
[0018]
【權(quán)利要求】
1.一種用于檢測(cè)前列腺癌DD3rcA3基因存在的熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒，其特征在于: 由DNA提取液、PCR反應(yīng)預(yù)混液、熱啟動(dòng)Taq酶、陽性標(biāo)準(zhǔn)品和陰性質(zhì)控品組成。 所述的DNA是脫氧核糖核酸,所述的PCR是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng),所述的Taq酶是一種耐熱的DNA聚合酶。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的熒光定量PCR試劑盒，其特征是: PCR反應(yīng)預(yù)混液包括PCR反應(yīng)緩沖成分(200mM KCl, 200mMTris-HCl, pH8.3，50mM(NH4)2S04)，IOmM的上游引物DD3-95F和IOmM的下游引物DD3-521R，IOmM熒光探針DD3-FAM, 25mM MgCl2，2.5mM 的 dNTPs (dATP, dGTP, dCTP 和 dTTP 等體積混合物)，IU 的熱啟動(dòng)Taq酶和無菌雙蒸水； DD3-95F 序列為:5' -GGTGGGAAGGACCTGATGATAC-3'， DD3-521R，序列為:5' -GGGCGAGGCTCATCGAT-3'， DD3-FAM 序列為:5 ' -AGAAATGCCCGGCCGCCATC-3 '，其中 5 '標(biāo)記 FAM 基團(tuán)，3 '標(biāo)記TAMARA 基團(tuán)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的熒光定量PCR試劑盒，其特征是: 陽性標(biāo)準(zhǔn)品是前列腺癌的特異性標(biāo)志DD3基因中部分核酸片段連接到T載體上構(gòu)建的質(zhì)粒，核酸片段的序列為:
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103882100SQ201210563581
【公開日】2014年6月25日 申請(qǐng)日期:2012年12月24日 優(yōu)先權(quán)日:2012年12月24日
【發(fā)明者】張冬玲, 劉代新 申請(qǐng)人:蘇州中同生物科技有限公司