一種靶向stat3的慢病毒干擾載體的構建及鑒定的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及針對STAT3基因的不同部位，構建靶向STAT3的shRNA慢病毒干擾載體，鑒定并篩選出最佳抑制效率的干擾載體。針對STAT3基因的不同部位設計4對短發(fā)卡RNA(shRNA)的寡核苷酸片段，克隆到慢病毒干擾載體pLenti中，構建靶向載體PLKO.1-STAT3-shRNA-a1、a2、a3、a4。利用脂質體將其與包裝外殼蛋白質粒(pVSV-g)和包膜質粒(Pax-2)共轉染293T細胞，熒光顯微鏡觀察293T細胞綠色熒光蛋白(GFP)表達。獲取病毒懸液并測定其滴度，以定量病毒感染靶細胞后，Western?blot法進行檢測篩選。4個干擾載體經酶切和測序確定基因插入正確，篩選結果證實其明顯降低細胞內STAT3蛋白的表達。本發(fā)明為進一步研究JAK/STAT信號通路參與調控血管再狹窄過程中細胞增殖遷移的分子機制及為血管橋再狹窄的分子靶向治療奠定了基礎。
【專利說明】一種靶向STAT3的慢病毒干擾載體的構建及鑒定
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及基因工程領域，尤其一種靶向STAT3的慢病毒干擾載體的構建及鑒定構建及鑒定。
【背景技術】
[0002]信號轉導是細胞生命活動的一種最基本和最重要的方式，細胞因子受體介導的JAK-STAT (janus kinase/signal transducer and activator of transcription)信號傳導途徑是目前心血管分子生物學研究領域的熱點，它把細胞膜上感受的信號直接傳遞到核內一啟動基因轉錄，環(huán)節(jié)少而簡潔；近來研究表明，JAK-STAT途徑是人體內生理和病理反應的共同通路之一，與多種疾病發(fā)病及防治密切相關，廣泛參與細胞應激、生長、增殖、分化和凋亡等多種生物學效應，是多種細胞因子和生長因子信號轉導的重要途徑。國內目前有文獻對正常及低氧等損害情況下血管平滑肌細胞(VSMC)及微血管內皮細胞中全部JAK和STAT的基因和蛋白表達和變化情況進行了初步的研究。顯然深入研究JAK-STAT及其它信號轉導系統(tǒng)對探討疾病發(fā)病機制和防治具有重要意義。
[0003]近年來，RNA干擾(RNA interference, RNAi)這一新興的生物工程技術在疾病的發(fā)生、發(fā)展及治療研究領域發(fā)揮越來越重要的作用，為人們針對某種基因突變或過表達所引起的疾病治療提供了新的策略。本研究通過構建靶向TLR2的shRNA干擾載體PLK0.l-TLR2-shRNA,并篩選出最佳抑制效率的干擾載體，為進一步研究JAK-STAT信號通路參與調控血管再狹窄過程中細胞增殖遷移的分子機制及為血管橋再狹窄的分子靶向治療奠定了基礎。

【發(fā)明內容】

[0004]本發(fā)明提供一種 靶向STAT3的慢病毒干擾載體的構建及鑒定構建及鑒定方法。
[0005]靶向STAT3的慢病毒干擾載體的構建及鑒定構建及鑒定，其步驟為:
[0006]I)根據(jù)Gene Bank中STAT3的cDNA序列，參考shRNA設計原則，選擇cDNA序列上的四個部位作為目標序列，同時將選中的shRNA中的堿基序列隨機打亂設計為陰性對照，對照序列經BLAST檢測證實與STAT3mRNA及其他基因編碼序列無同源性。
[0007]2) shRNA模板中的loop結構選用了 TTCAAGAGA以避免形成終止信號，shRNA的轉錄終止序列采用T6結構。正義鏈模板的5'端添加了 CCGG，與AgeI酶切后形成的粘端互補；反義鏈模板的5'端添加了 AATTCAAAAA，與EcoR I酶切后形成的粘端互補。以下序列由上海生工生物技術有限公司合成。
[0008]3)靶向STAT3的shRNA干擾載體PLK0.l_STAT3_shRNA構建及鑒定，用限制性內切酶Age1、Ec0RI酶切PLK0.1，連接退火片斷和載體，轉化，涂板，挑克隆，小抽質粒，并將克隆送上海英駿生物技術有限公司測序鑒定；
[0009]4)將干擾效果最好的PLK0.l-stat3 (al)，進行慢病毒包裝，_70°C冰柜保存。
[0010]本發(fā)明的優(yōu)點:[0011]I) STAT3是近年來研究異?；钴S的轉錄因子，在細胞因子和生長因子的作用下，通過JAK或絲氨酸激酶誘導，STAT3激活并形成P-STAT3，兩個分子p_STAT3相互作用形成二聚體進入細胞核，與目的基因的啟動子區(qū)域結合，調節(jié)靶基因轉錄。研究表明在多種腫瘤組織和細胞中存在STAT3的異?；罨瓦^表達，并上調與細胞增殖、遷移、細胞凋亡和血管生成等相關基因的表達，在細胞增殖性疾病中起重要作用，STAT3信號通路已成為調控細胞增殖、凋亡新的研究熱點。
[0012]2)為進一步研究JAK-STAT3信號通路對血管平滑肌細胞增殖的作用，本研究構建了靶向STAT3的shRNA重組慢病毒表達載體，特異性阻斷JAK-STAT3信號通路中的關鍵分子STAT3蛋白的表達。針對目的基因我們設計三對shRNA序列，構建了三個重組慢病毒表達載體，并將這些重組載體包裝病毒后感染大鼠血管平滑肌細胞，采用Western blot法驗證重組慢病毒對靶基因的抑制效率。
[0013]3)我們選擇抑制效率高的ShRNA-3進行后續(xù)研究，為進一步研究JAK-STAT3信號通路在血管平滑肌細胞增殖、凋亡等作用奠定了基礎，為抑制血管平滑肌細胞增殖的基因治療提供了新的思路。
【具體實施方式】
[0014]下面結合具體實施實例，對本發(fā)明進一步說明，但發(fā)明的保護范圍并不限于此。
[0015]雄性SD大鼠，體重150_250g，由南京醫(yī)科大學實驗動物中心提供。U6啟動子質粒(如PavU6+27)由北京本元正陽基因技術公司構建，克隆用大腸桿菌DH5 α株(Gibco/BRL公司)，限制性內切酶Age1、EcoRI，T4DNA連接酶，RT-PCR試劑盒均為大連Ta Kara生物公司產品；RNA提取試劑Tripure、DEPC購自美國Roche公司；DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶、Trizol試劑(Gibcobrl公司)，胎牛血清(Hyclone公司)，噻唑藍(MTT)、二甲基亞砜(DMSO) ,AnnexinV-FITC細胞凋亡檢測試劑盒(Roche公司)；Omniscript RT Kit (Qiagen公司)，反轉錄隨機引物(Toyobo公司)，SYBR Premix Ex Taq(大連Takara公司)。試驗中所用的核酸標準分子量Marker以及蛋白預染Marker均為美國Fermentas MBI公司產品。去內毒素質粒大量提取試劑盒為德國Qiagen公司產品。質粒轉染試劑LipofectamineTM 2000購置美國invitrogen公司。兔抗鼠STAT3單克隆抗體以及辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG購自美國Santa Cruz公司。用于Western blot檢測的增強化學發(fā)光試劑ECL為美國CellSignal 公司產品。PVDF 轉印膜購自美國 Schleicher&Schuell Bioscience 公司。
[0016]1)靶向 STAT3 的 shRNA 設計
[0017]根據(jù)Gene Bank中STAT3的cDNA序列，參考shRNA設計原則，選擇cDNA序列上的四個部位作為目標序列，同時將選中的shRNA中的堿基序列隨機打亂設計為陰性對照，對照序列經BLAST檢測證實與STAT3mRNA及其他基因編碼序列無同源性。shRNA模板中的loop結構選用了 TTCAAGAGA以避免形成終止信號，shRNA的轉錄終止序列采用T6結構。正義鏈模板的5'端添加了 CCGG，與Age I酶切后形成的粘端互補；反義鏈模板的5'端添加了 AATTCAAAAA，與EcoR I酶切后形成的粘端互補，序列如下。
[0018]PLK0.l-stat3(al)
[0019]STAT-F
[0020]5' CCGGAACGACCTGCAGCAATACCATCTCGAGATGGTATTGCTGCAGGTCGTTTTTTTG3'[0021]STAT-R
[0022]5' AATTCAAAAAAACGACCTGCAGCAATACCATCTCGAGATGGTATTGCTGCAGGTCGTT3'
[0023]PLK0.l-stat3 (a2)
[0024]STAT-F
[0025]5' CCGG AACCTGCGAAGAATCAAGCAGCTCGAGCTGCTTGATTCTTCGCAGGTTTTTTTG 3'
[0026]STAT-R
[0027]5' AATTCAAAAAAACCTGCGAAGAATCAAGCAGCTCGAGCTGCTTGATTCTTCGCAGGTT3'
[0028]PLK0.l-stat3 (a3)
[0029]STAT-F
[0030]5' CCGG AAGATTGGGCATATGCAGCCACTCGAGTGGCTGCATATGCCCAATCTT TTTTTG3'
[0031]STAT-R
[0032]5' AATTCAAAAA AAGATTGGGCATATGCAGCCACTCGAGTGGCTGCATATGCCCAATCTT3'
[0033]PLK0.l-stat3 (a4)
[0034]STAT-F
[0035]5' CCGG AACAGCATCTTCAGGATGTCCCTCGAGGGACATCCTGAAGATGCTGTTTTTTTG3'
[0036]STAT-R
[0037]5' AATTCAAAAAAACAGCATCTTCAGGATGTCCCTCGAGGGACATCCTGAAGATGCTG 3'
[0038]2)靶向STAT3的shRNA干擾載體PLK0.l_STAT3_shRNA構建及鑒定
[0039]退火buffer溶解引物成25ul/10D，將上下游引物1:1混合，在94度水浴5min，熄火自然冷卻到室溫，4度lh。用限制性內切酶Age1、Ec0RI酶切PLK0.1，連接退火片斷和載體，轉化，涂板，挑克隆，小抽質粒，并將克隆送上海英駿生物技術有限公司測序鑒定。
[0040]3)重組慢病毒 PLK0.l-STAT3-shRNA 的包裝
[0041]HEK293細胞培養(yǎng)于IOcm平皿中，達50%~70%融合時進行轉染。利用脂質體將重組慢病毒質粒PLK0.l-STAT3-shRNA，包裝質粒和包膜質粒共轉染HEK293細胞。HEK293細胞用無血清的DMEM培養(yǎng)基洗滌后，加入2ml完全培養(yǎng)基和DNA-脂質體混合物，37°C,5%CO2細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，12小時后全量換液。繼續(xù)培養(yǎng)24小時后半量收集細胞上清，48小時后全量收集細胞上清。用0.22 μ m濾器濾過后分裝，_70°C冰柜保存。
[0042]4)重組慢病毒滴度測定
[0043]接種HEK293細胞于24孔板，按不同稀釋倍數(shù)稀釋病毒液，每一稀釋倍數(shù)設3個復孔，分別取100 μ I病毒液加入HEK293細胞中。37°C，CO2孵箱中孵育60min后，棄舊培養(yǎng)基，加入新鮮的DMEM完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24h后于熒光顯微鏡下計數(shù)綠色熒光細胞。I個發(fā)光的細胞即為I個表達單位(expression-forming units, efu)按下列公式計算病毒滴度:病毒滴度(efu/ml)=(綠色熒光細胞數(shù)/視野)X (視野數(shù)/孔數(shù))X病毒稀釋倍數(shù)+病毒體積。
[0044]5)重組慢病毒感染大鼠胸主動脈血管平滑肌細胞
[0045]以6孔板為例，感染當天大鼠胸主動脈血管平滑肌細胞按每孔500 μ I培養(yǎng)液接種6X105個細胞。重組慢病毒PLK0.l-STAT3-shRNA病毒液以I感染復數(shù)(multiplicity ofinfection,MOI)加入，37°C，5% CO2細胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。12h后在熒光顯微鏡下觀察GFP表達情況。同時用空載體病毒PLenti感染血管平滑肌細胞作對照。[0046]6)重組慢病毒shRNA對STAT3基因的抑制作用
[0047]重組慢病毒PLK0.l-STAT3-shRNA病毒液以MOI = I感染復數(shù)加入，48h后收取細胞總蛋白，進行SDS-PAGE電泳，電泳后濕轉至PVDF膜，含5%脫脂奶粉的TBS-T (含0.05%Tween-20的TBS)37°C封閉60min，加1: 1000稀釋的抗STAT3蛋白的單克隆抗體4°C孵育過夜，TBS-T漂洗5minX 3次，加入I: 4000稀釋的辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG 37°C孵育45min，TBS-T漂洗5minX3次，ECL化學發(fā)光試劑檢測。
[0048]7)重組慢病毒干擾載體的鑒定
[0049]每個連接反應挑取6個菌落，接種到含50 μ g/ml Amp的LB培養(yǎng)基中。使用堿裂解法抽提質粒，并將質粒送出測序，經測序,干擾序列正確插入載體且無突變。
[0050]8)重組慢病毒的包裝和擴增重組慢病毒質粒PLK0.l-STAT3-shRNA，穿梭質粒和包裝質粒共同轉染293T細胞48h后在熒光顯微鏡下可以觀察到GFP表達。經熒光計數(shù)法測得重組慢病毒Ientivirus-Vif滴度為3X 107efu/ml，作為陰性對照的空載體病毒Ientivirus-Vec 滴度為 4X 107efu/ml。
[0051]9)重組慢病毒感染后對STAT3蛋白表達的影響
[0052]獲得的重組慢病毒重新感染大鼠胸主動脈血管平滑肌細胞48h后觀察到綠色熒光蛋白的表達。Western blot結果顯示重組慢病毒質粒PLK0.1_stat3(al)、a2、a3、a4均能夠抑制大鼠胸主動脈血管平滑肌細胞中STAT3蛋白表達，其中以PLK0.l-stat3(al)最為明顯，達到90% 以上。
【權利要求】
1.一種重組慢病毒質粒載體，其特征是該載體含有大鼠的STAT3的基因干擾片段。
2.按照權利要求1所述的載體，其特征是該載體為大腸桿菌表達載體。
3.按照權利要求2所述的載體，其特征是該載體為PLK0.l-STAT3-al。
4.按照權利要求3所述的載體，其特征是該載體的al序列為al-F:5' CCGGAACGACCTGCAGCAATACCATCTCGAGATGGTATTGCTGCAGGTCGTTTTTTTG 3'a2_R:5! AATTCAAAAAAACGACCTGCAGCAATACCATCTCGAGATGGTATTGCTGCAGGTCGTT3!。
5.按照權利要求4所述的載體， 轉染到大鼠體內后，降低STAT3蛋白表達。
【文檔編號】C12Q1/70GK103882060SQ201210563605
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2012年12月24日 優(yōu)先權日:2012年12月24日
【發(fā)明者】鄭麗麗, 楊艷菊 申請人:蘇州中同生物科技有限公司