專利名稱：極暗黃鏈霉菌的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體指一種對農(nóng)作物病具有廣譜拮抗作用，尤其對水稻紋枯病具有明顯抑制作用的極暗黃鏈霉菌(Streptomyces fulvissimus) CZB40。
背景技術(shù)：
水稻紋枯病是由立枯絲核菌(Rhzioeotniasoalni)引起的導(dǎo)致水稻減產(chǎn)的重要病害，可造成10%_30%的產(chǎn)量損失，發(fā)病嚴(yán)重時減產(chǎn)可達(dá)50%。近幾年，隨著高產(chǎn)雜交稻品種的推廣，施氮水平的提高，水稻復(fù)種指數(shù)的上升，水稻紋枯病的危害越來越嚴(yán)重。目前我國水稻紋枯病的防治主要以井R霉素與一些化學(xué)藥劑為主，長期單一使用井R霉素易導(dǎo)致立枯絲核菌產(chǎn)生抗藥性，近年井R霉素每季用藥次數(shù)已從20年前2次增加到現(xiàn)在的3-5次， 用藥量也從I. 5 kg/hm2上升到4. 5-6. Okg/hm，而化學(xué)藥劑存在毒性、殘留、環(huán)境污染等缺點，且由于立枯絲核菌腐生能力強(qiáng)和寄主范圍廣的特點，國內(nèi)外至今尚未發(fā)現(xiàn)對該病的高抗品種。
且，隨著化學(xué)殺菌劑對生態(tài)環(huán)境、有益生物及人體所引致負(fù)作用的加大，以及植物病原菌日益增加的抗藥性，利用一些生物防治菌作為生物殺菌劑來防治植物病害，以減輕化學(xué)農(nóng)藥對環(huán)境污染的研究引起各界的密切關(guān)注。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種對農(nóng)作物病具有廣譜拮抗作用的極暗黃鏈霉菌(Streptomyces fulvissimus) CZB40,尤其對水稻紋枯病菌具有良好的抑制效果。
本發(fā)明所述的極暗黃鏈霉菌(Streptomyces fulvissimus)CZB40,已于2012年12 月7日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號CCTCC NO :M2012519，保藏地址中國武漢武漢大學(xué)。
本發(fā)明菌株CZB40具有以下性質(zhì)
形態(tài)特征使用插片法在高氏I號培養(yǎng)基上28°C培養(yǎng)7d后，分別用光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，本菌株具有典型的鏈霉菌屬特征，菌落緊密、表面皺折，皮殼狀，青褐色。氣生菌絲和基內(nèi)菌絲均很豐富，在掃描電鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，氣生菌絲體形成孢子鏈時，孢子絲呈螺旋狀，孢子呈短圓柱形，見圖I。
生理生化特性本發(fā)明菌株CZB40在高氏一號固體培養(yǎng)基中生長產(chǎn)生暗黃色色素。本菌株能分解利用纖維素，使明膠液化，使淀粉水解，能使牛奶胨化，但不能使牛奶凝固，也不能產(chǎn)生硫化氫。
利用參照I. M. Kauffmann等及Jasmina Nikodinovic等的方法提取本發(fā)明菌株的基因組DNA，根據(jù)放線菌16SrDNA的結(jié)構(gòu)特點及其保守區(qū)設(shè)計特異引物(引物由上海生工生物工程公司合成)
正向引物16sF AGAGTTTGATCCTGGCTCAG (見 SEQ ID NO. I)；
反向引物16sR AAGGAGGTGATCCAGCCGCA (見 SEQ ID NO. 2)。
以提取的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增(50 μ L反應(yīng)體系)94°C預(yù)變性5min， 94°C變性Imin，56°C復(fù)性Imin，72°C延伸2min，25個循環(huán)，72°C延伸8min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)上海生工生物工程技術(shù)有限公司測序,序列經(jīng)BLAST分析并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(見圖2)表明，本發(fā)明菌株CZB40與極暗黃鏈霉菌(Streptomyces fulvissimus)的相似性達(dá)99%。結(jié)合形態(tài)和生理生化特征分析，將其鑒定為極暗黃鏈霉菌(Streptomyces fulvissimus)的一個新種， 命名為極暗黃鏈霉菌(Streptomyces fulvissimus) CZB40。
培養(yǎng)及發(fā)酵條件
培養(yǎng)基中的營養(yǎng)源并無特殊的規(guī)定，培養(yǎng)基中可含有常用于微生物培養(yǎng)的碳源、 氮源及其他營養(yǎng)源。其中，碳源可為葡萄糖、麥芽糖、馬鈴薯淀粉、可溶性淀粉、玉米粉、大米粉、蔗糖等。氮源可為NaN03、(MM)2SO4、酵母粉、蛋白胨、大豆粉等。其他營養(yǎng)源可為含鎂、 鈉、鉀之類的金屬鹽等。對溫度、時間等培養(yǎng)條件并無嚴(yán)格的限制，以適于本發(fā)明菌株的生長為宜。
將本發(fā)明菌株CZB40接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，可獲得發(fā)酵液，發(fā)酵培養(yǎng)基為玉米粉 10-30g、酵母粉 3-7g、MgSO4 O. 2_lg、NaCl O. 2_lg、K2HP O4 O. 2_lg、1000ml 水，pH 5-9 ； 發(fā)酵條件為接種量1-10% (體積)、溫度26-30°C、搖瓶轉(zhuǎn)速150-250r/min、發(fā)酵培養(yǎng)時間為48-96h。通過單因素試驗和均勻設(shè)計法對本發(fā)明菌株CZB40的發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳培養(yǎng)基(1000ml水)為25g玉米粉、5g酵母粉、O. 2g MgSO4、0. 8gNaCl、 O. 4gK2HP04 pH 6 ;最佳發(fā)酵條件為接種量5%、溫度29°C、轉(zhuǎn)速200r/min、發(fā)酵時間72h。
本發(fā)明菌株對農(nóng)作物病具有廣譜拮抗作用，對辣椒疫霉病菌、桃樹褐腐病菌、及水稻稻瘟病菌有較好的抑制作用，尤其對水稻紋枯病菌抑制效果明顯。


圖I是本發(fā)明菌株CZB40的孢子形態(tài)圖。
圖2是本發(fā)明菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹。
具體實施方式
下面以具體實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，本文中提及的各病原菌均由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理系提供。
實施例I
將從湖南省郴州市采集的土樣于室溫下風(fēng)干，稱取土樣IOg放入盛有90ml無菌水并帶有玻璃珠的三角瓶中，振蕩20min，用無菌移液管從中吸取Iml 土壤懸液注入盛有9ml 無菌水的試管中，混勻。從此試管中吸取Iml注入另一支盛有9ml無菌水的試管中，以此類推制備10 -2、10 -3、10 —4、10 —5、10 —6的土壤稀釋液。用無菌移液管吸取10 -2、10 -4、10 -6 稀釋液O. ImL分別滴加到加有3%的抑菌劑(K2Cr2O7)的培養(yǎng)基平板上，用無菌涂布棒涂勻， 靜置30min后,將培養(yǎng)皿放在28°C溫箱中倒置培養(yǎng)。及時挑單菌落至高氏一號培養(yǎng)基上劃線純化，得到本發(fā)明菌株。
其中，添加有3%的抑菌劑(K2Cr2O7)的培養(yǎng)基配方為可溶性淀粉20g、KNO3 lg、 K2HPO4 O. 5g、MgS04.7H20 0. 5g、NaCl 0. 5g、FeSO4. 7H20 0. Olg、瓊月旨 20g、水 lOOOmL、pH7. 2，加入的抑菌劑(K2Cr2O7) 3mL。
實施例2
將本發(fā)明菌株CZB40接種5% (體積)于發(fā)酵培養(yǎng)基(玉米粉25g、酵母粉5g、MgSO4 0.2g、NaCl O. 8g, K2HP O4 O. 4g、1000ml 水；pH6)，28°C 下以 200r/min 轉(zhuǎn)速搖瓶發(fā)酵培養(yǎng) 72h，用細(xì)菌過濾器(直徑=0. 22 μ m)過濾，得發(fā)酵液。
實施例3本發(fā)明菌株對水稻紋枯病菌的抑制作用
于培養(yǎng)皿中加入3ml本發(fā)明菌株發(fā)酵液與12mlPDA，混勻制成平板(以3ml無菌水與12mlPDA混勻制成平板做對照)，將培養(yǎng)在PDA上的水稻紋枯病菌的小菌餅(直徑=5mm) 倒置放到平板中央，重復(fù)3次。靜置Ih后放入28°C溫箱倒置培養(yǎng)l-2d。用十字交叉法測量抑菌圈直徑，并觀察抑菌圈透明程度和邊緣整齊程度，記錄結(jié)果并按下式計算抑制率
菌落直徑=相垂直的兩直徑的平均值一菌餅直徑
抑制率(％)=(對照菌落直徑一處理菌落直徑)/(對照菌落直徑一菌餅直徑)X 100%。(這里提及的菌餅直徑皆是指水稻紋枯病菌的小菌餅(直徑=5mm))
結(jié)果表明本發(fā)明菌株的抑菌率為89. 3%，說明了本發(fā)明菌株對水稻紋枯病菌的生長有較強(qiáng)的抑制作用，并能抑制水稻紋枯病菌菌核的形成。
實施例4本發(fā)明菌株對辣椒疫霉病菌的抑制作用
參照實施例3的步驟，只是將病原菌換為辣椒疫霉病菌，結(jié)果表明本發(fā)明菌株對辣椒疫霉病菌的抑制率為52. 94%，有較好的抑菌效果。
實施例5本發(fā)明菌株對桃樹褐腐病菌的抑制作用
參照實施例3的步驟，只是將病原菌換為桃樹褐腐病菌，結(jié)果表明本發(fā)明菌株對桃樹褐腐病菌的抑制率為80. 29%，有較好的抑菌效果。
實施例6本發(fā)明菌株對水稻稻瘟病菌的抑制作用
參照實施例3的步驟，只是將病原菌換為水稻稻瘟病菌，結(jié)果表明本發(fā)明菌株對水稻稻瘟病菌的抑制率為52. 94%，抑菌效果較好。
權(quán)利要求
1.一種極暗黃鏈霉菌，其特征在于該菌株為極暗黃鏈霉菌(Streptomycesfulvissimus)CZB40，2012年12月7日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號CCTCCNO M2012519o
2.一種發(fā)酵法制備極暗黃鏈霉菌發(fā)酵液的方法，其特征在于發(fā)酵所用菌株為權(quán)利要求I所述的極暗黃鏈霉菌CZB40，發(fā)酵培養(yǎng)基為玉米粉10-30g、酵母粉3-7g、MgSO4O.2-lg、NaCl O. 2_lg、K2HP O4 O. 2_lg、水 1000ml，pH 5-9 ;發(fā)酵條件為接種量 1_10%、溫度26-30°C、搖瓶轉(zhuǎn)速150-250r/min、發(fā)酵培養(yǎng)時間為48_96h。
3.如權(quán)利要求2所述的發(fā)酵法制備極暗黃鏈霉菌發(fā)酵液的方法，其特征在于所述培養(yǎng)基為:1000ml 培養(yǎng)基中 25g 玉米粉、5g 酵母粉、O. 2g MgSO4、0· 8gNaCl 及 O. 4gK2HP04 pH6 ;發(fā)酵條件為接種量5%、溫度29°C、轉(zhuǎn)速200r/min、發(fā)酵時間72h。
4.如權(quán)利要求2或3所述方法得到的發(fā)酵液。
5.如權(quán)利要求I所述的菌株在抑制水稻紋枯病中的應(yīng)用。
6.如權(quán)利要求I所述的菌株在抑制辣椒疫霉病菌中的應(yīng)用。
7.如權(quán)利要求I所述的菌株在抑制桃樹褐腐病菌中的應(yīng)用。
8.如權(quán)利要求I所述的菌株在抑制水稻稻瘟病菌中的應(yīng)用。
全文摘要
一種極暗黃鏈霉菌(Streptomyces fulvissimus)CZB40，2012年12月7日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號CCTCC NOM2012519。本菌株對農(nóng)作物病具有廣譜拮抗作用，對辣椒疫霉病菌、桃樹褐腐病菌、及水稻稻瘟病菌有較好的抑制作用，對水稻紋枯病菌的抑制效果尤為明顯。
文檔編號C12R1/465GK102978144SQ20121056618
公開日2013年3月20日 申請日期2012年12月24日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月24日
發(fā)明者朱宏建, 劉雙清, 周清明, 何龍 申請人:湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)