P450sca-2酶突變體、其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及一種分離的多肽,其是SEQ?ID?NO:1所示的P450sca-2酶的變體或所述變體的生物學(xué)活性片段,其中所述多肽在對(duì)應(yīng)于SEQ?IDNO:1所示序列中的G52、F89、P159、D269、T323和E370位置上包括氨基酸取代,而且相對(duì)于SEQ?ID?NO:1所示的P450sca-2酶,所述多肽在宿主細(xì)胞中表達(dá)時(shí)賦予所述宿主細(xì)胞提高的在含十氫萘環(huán)化合物的十氫萘環(huán)的6β位引入羥基的能力。本發(fā)明還涉及編碼上述分離的多肽的多核苷酸,包含所述多核苷酸的重組載體,包含所述多核苷酸或所述重組載體的宿主細(xì)胞,以及通過(guò)所述宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化美伐他汀以制備普伐他汀的方法。本發(fā)明的方法可以提高從美伐他汀轉(zhuǎn)化制備普伐他汀的產(chǎn)率。
【專(zhuān)利說(shuō)明】P450sca-2酶突變體、其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物工程領(lǐng)域。更具體地,本發(fā)明涉及P450sca_2酶突變體、其制備方法、以及其在從美伐他汀制備普伐他汀中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]高脂血癥正在不斷的威脅著人們的健康,因此降血脂藥的開(kāi)發(fā)成為制藥行業(yè)的一個(gè)重要目標(biāo)。普伐他汀(pravastatin)是一種非常重要的降血脂藥(Tsujita Y等,1986,Biochim.Biophys.Acta 877,50-60;Koga T 等,1990,Biochim.Biophys.Acta1045,115-120)。普伐他汀鈉的工業(yè)生產(chǎn)是兩步發(fā)酵過(guò)程,包括從橘青霉(Penicilliumcitrinum)發(fā)酵生產(chǎn)美伐他汀(mevastatin),經(jīng)過(guò)濃堿處理制成美伐他汀鈉,最后利用微生物轉(zhuǎn)化的方法將美伐他汀鈉羥基化制成普伐他汀鈉(Serizawa N., 1996 Biotechnol.Annu.Rev.2, 373-389)。
[0003]嗜碳鏈霉菌(Streptomyces carbophilus)具有較強(qiáng)將美伐他汀鈉羥基化制備普伐他汀鈉的能力,廣泛用于普伐他汀的工業(yè)生產(chǎn)(Serizawa N., 1996Biotechnol.Annu.Rev.2,373-389)。通過(guò)對(duì)此羥基化過(guò)程的機(jī)理進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)其中起主要催化作用的酶屬于細(xì)胞色素P450酶系,根據(jù)其來(lái)源命名為P450sca(Matsuoka T等,1989,Eur.J.Biochem.184,707-713)。從嗜碳鏈霉菌中共純化出兩種P450sca酶,分別命名為P450sca-1酶和P450sca-2酶。這兩種P450sca酶具有類(lèi)似的分子量(46±1 kDa)和氨基酸組成(疏水氨基酸含量46-47%)。P450sca-2在催化美伐他汀轉(zhuǎn)化為普伐他汀中的比活性高于P450sca-1的比活性,并且其易于被純化,因此P450sca-2被普遍應(yīng)用于生物發(fā)酵法制備普伐他汀中。
[0004]然而,目前通過(guò)生物發(fā)酵法制得的普伐他汀的產(chǎn)率較低,因此需要更高效的P450sca-2酶來(lái)提高普伐他汀的產(chǎn)率。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005]一方面,本發(fā)明涉及一種分離的多肽,其是SEQ ID勵(lì):1所示的?4508(^-2酶的變體或所述變體的生物學(xué)活性片段,其中所述多肽在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1所示序列中的G52、F89、P159、D269、T323和E370位置上包括氨基酸取代,而且相對(duì)于SEQ ID NO:1所示的P450sca-2酶,所述多肽在宿主細(xì)胞中表達(dá)時(shí)賦予所述宿主細(xì)胞提高的在含十氫萘環(huán)化合物的十氫萘環(huán)的6β位引入羥基的能力。
[0006]在一個(gè)實(shí)施方式中,所述氨基酸取代為G52S、F891、P159A、D269E、T323A和E370V,且所述多肽包括SEQ ID Ν0:2所示的序列。
[0007]在另一個(gè)實(shí)施 方式中,所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步包括在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1所示序列中的選自Tl 19、Ν363、Τ85、V194和它們?nèi)我饨M合的位置上的氨基酸取代。
[0008]在一個(gè)實(shí)施方式中,所述氨基酸取代在Τ119位置上。在一個(gè)實(shí)施方式中,所述氨基酸取代在Ν363位置上。在一個(gè)實(shí)施方式中,所述氨基酸取代在Τ85位置上。在一個(gè)實(shí)施方式中,所述氨基酸取代在V194位置上。在一個(gè)實(shí)施方式中,所述氨基酸取代在Tl 19和N363位置上。在一個(gè)實(shí)施方式中,所述氨基酸取代在T119和T85位置上。在一個(gè)實(shí)施方式中,所述氨基酸取代在T119和V194位置上。在一個(gè)實(shí)施方式中,所述氨基酸取代在N363和T85位置上。在一個(gè)實(shí)施方式中,所述氨基酸取代在N363和V194位置上。在一個(gè)實(shí)施方式中,所述氨基酸取代在T85和V194位置上。在一個(gè)實(shí)施方式中,所述氨基酸取代在T119、N363和T85位置上。在一個(gè)實(shí)施方式中,所述氨基酸取代在T119、N363和V194位置上。在一個(gè)實(shí)施方式中,所述氨基酸取代在T119、T85和V194位置上。在一個(gè)實(shí)施方式中,所述氨基酸取代在Ν363、Τ85和V194位置上。在一個(gè)實(shí)施方式中,所述氨基酸取代在Tl 19、Ν363、Τ85和V194位置上。
[0009]在一個(gè)實(shí)施方式中,所述Ν363位置的氨基酸取代為Ν363Υ或Ν363Η。在一個(gè)實(shí)施方式中,所述Τ119位置的氨基酸取代為T(mén)119S、T119C或Τ119Ν。在一個(gè)實(shí)施方式中,其中所述V194位置的氨基酸取代為V194C、V194N或V194T。
[0010]在一個(gè)實(shí)施方式中,其中所述Τ85位置的氨基酸取代為非極性疏水氨基酸,所述非極性疏水氨基酸選自以下組成:甲硫氨酸、丙氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、脯氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸和色氨酸。在一個(gè)實(shí)施方式中,其中所述Τ85位置的氨基酸取代為T(mén)85M、T85L、T85F或T85I。在一個(gè)實(shí)施方式中,所述氨基酸取代為T(mén)119S、N363Y、T85F和T194N。
[0011]另一方面,本發(fā)明涉及一種分離的多肽,其包含選自以下的氨基酸序列或由選自以下的氨基酸序列組成:
[0012]i)SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID NO:4, SEQ ID N0:5、SEQ IDNO:6, SEQ IDNO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10, SEQ IDN0:1U SEQ ID NO:12, SEQ IDNO:13、SEQ ID NO:14、SE Q ID NO:15 或 SEQ ID NO:16 ;
[0013]ii)與 SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQID NO:6, SEQID NO:7,SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:9,SEQ ID NO:10、SEQID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ IDNO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15 或 SEQ ID NO: 16 所示的氨基酸序列具有至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 的序列相同性的氨基酸序列;或
[0014]iii)與 SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:5,SEQID NO:6,SEQID NO:7,SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:9,SEQ ID NO:10、SEQID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ IDNO: 13,SEQ ID NO: 14,SEQ ID NO: 15或SEQ ID NO: 16所示的氨基酸序列相比經(jīng)過(guò)取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸的氨基酸序列;而且
[0015]所述多肽在宿主細(xì)胞中表達(dá)時(shí)賦予所述宿主細(xì)胞提高的在含十氫萘環(huán)化合物的十氫萘環(huán)的6β位引入羥基的能力。
[0016]另一方面,本發(fā)明涉及一種分離的多肽,其是SEQ ID Ν0:1所示的P450sca_2酶的變體或所述變體的生物學(xué)活性片段,其中所述多肽在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1所示序列中的T119、N363、T85和V194中的一個(gè)或多個(gè)位置上包括氨基酸取代,而且相對(duì)于SEQ ID NO:1所示的P450sca-2酶,所述多肽在宿主細(xì)胞中表達(dá)時(shí)賦予所述宿主細(xì)胞提高的在含十氫萘環(huán)化合物的十氫萘環(huán)的6β位引入羥基的能力。
[0017]在一個(gè)實(shí)施方式中,所述氨基酸取代在Τ119位置上。在一個(gè)實(shí)施方式中,所述氨基酸取代在Ν363位置上。在一個(gè)實(shí)施方式中,所述氨基酸取代在Τ85位置上。在一個(gè)實(shí)施方式中,所述氨基酸取代在V194位置上。在一個(gè)實(shí)施方式中,所述氨基酸取代在Tl 19和N363位置上。在一個(gè)實(shí)施方式中,所述氨基酸取代在T119和T85位置上。在一個(gè)實(shí)施方式中,所述氨基酸取代在T119和V194位置上。在一個(gè)實(shí)施方式中,所述氨基酸取代在N363和T85位置上。在一個(gè)實(shí)施方式中,所述氨基酸取代在N363和V194位置上。在一個(gè)實(shí)施方式中,所述氨基酸取代在T85和V194位置上。在一個(gè)實(shí)施方式中,所述氨基酸取代在T119、N363和T85位置上。在一個(gè)實(shí)施方式中,所述氨基酸取代在T119、N363和V194位置上。在一個(gè)實(shí)施方式中,所述氨基酸取代在T119、T85和V194位置上。在一個(gè)實(shí)施方式中,所述氨基酸取代在Ν363、Τ85和V194位置上。在一個(gè)實(shí)施方式中,所述氨基酸取代在Tl 19、Ν363、Τ85和V194位置上。
[0018]在一個(gè)實(shí)施方式中,所述Ν363位置的氨基酸取代為Ν363Υ或Ν363Η。在一個(gè)實(shí)施方式中,所述Τ119位置的氨基酸取代為T(mén)119S、T119C或Τ119Ν。在一個(gè)實(shí)施方式中,其中所述V194位置的氨基酸取代為V194C、V194N或V194T。
[0019]在一個(gè)實(shí)施方式中,其中所述Τ85位置的氨基酸取代為非極性疏水氨基酸,所述非極性疏水氨基酸選自以下組成:甲硫氨酸、丙氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、脯氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸和色氨酸。在一個(gè)實(shí)施方式中,其中所述Τ85位置的氨基酸取代為T(mén)85M、T85L、T85F或 T85I。
[0020]在一個(gè)實(shí)施方式中,所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步在SEQ ID NO:1所示多肽或?qū)?yīng)于SEQ ID NO:1所示多肽中的G52、F89、P159、D269、T323和E370位置上具有氨基酸取代。在一個(gè)實(shí)施方式中,所述氨基酸取代為G52S、F891、P159A、D269E、T323A和E370V。
[0021]另一方面,本發(fā)明涉及一種分離的多肽,其包含以下的氨基酸序列或由以下氨基酸序列組成:
[0022]i)SEQ ID NO:17,SEQ ID NO:18,SEQ ID NO:19,SEQ ID NO:20,SEQID N0:21、SEQID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26 或 SEQ ID NO:27 ;
[0023]ii)與SEQ ID NO:17,SEQ ID NO:18,SEQ ID NO:19,SEQ ID NO:20,SEQ ID N0:21、SEQ ID NO:22,SEQ ID NO:23,SEQ ID NO:24,SEQ IDNO:25,SEQ ID N0:26或SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列具有至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列相同性的氨基酸序列;或
[0024]iii)與 SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO:20, SEQ IDNO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ IDNO:25, SEQ ID NO:26 或 SEQID N0:27所示的氨基酸序列相比經(jīng)過(guò)取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸的氨基酸序列;而且
[0025]所述多肽在宿主細(xì)胞中表達(dá)時(shí)賦予所述宿主細(xì)胞提高的在含十氫萘環(huán)化合物的十氫萘環(huán)的6β位引入羥基的能力。
[0026]在一個(gè)實(shí)施方式中,所述含十氫萘環(huán)的化合物為他汀類(lèi)藥物。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中,所述他汀類(lèi)藥物為美伐他汀。
[0027]在一個(gè)實(shí)施方式中,所述宿主細(xì)胞是原核微生物或真核微生物。在一個(gè)實(shí)施方式中,所述原核微生物選自以下組中:大腸桿菌(Escherichia coli)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、 自養(yǎng)假諾卡氏菌(Pseudonocardiaautotrophica)、嗜碳鏈霉菌(Streptomyces carbophilus)和小四抱菌(Microtetraspora)。在一個(gè)實(shí)施方式中,所述真核微生物選自以下組中:裂殖酵母菌(Schizosaccharomyces)、漢遜酵母菌(Hansenula)、畢赤酵母菌(Pichia)、假絲酵母菌(Candida)、球擬酵母菌(Torulopsis)和紅酵母菌(Rhodotorula)。
[0028]另一方面,本發(fā)明涉及一種分離的多核苷酸,其包含編碼前述任一方面或任一項(xiàng)實(shí)施方式所述的分離的多肽的核苷酸序列。
[0029]另一方面,本發(fā)明涉及一種分離的多核苷酸,其包括以下核苷酸序列或由以下核苷酸序列組成:[0030]i)SEQ ID N0:31、SEQ ID NO:32,SEQ ID NO:33,SEQ ID NO:34,SEQID NO:35,SEQID NO:36,SEQ ID NO:37,SEQ ID NO:38,SEQ ID NO:39,SEQ ID NO:40,SEQ ID NO:41,SEQID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ IDNO:44,SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQID NO:48,SEQ ID NO:49,SEQ ID NO:50,SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:52,SEQ IDNO:53,SEQID NO:54, SEQ ID N0:55 或 SEQ ID NO:56 所示的核苷酸序列;
[0031]ii)與SEQ ID N0:31、SEQ ID NO:32,SEQ ID NO:33,SEQ ID NO:34,SEQ ID NO:35,SEQ ID NO:36,SEQ ID NO:37,SEQ ID NO:38,SEQ IDN0:39、SEQ ID NO:40,SEQ ID N0:41、SEQ ID NO:42,SEQ ID NO:43,SEQ ID NO:44,SEQ ID NO:45,SEQ ID NO:46,SEQ ID N0:47、SEQ IDN0:48、SEQ ID NO:49,SEQ ID NO:50,SEQ ID N0:5USEQ ID NO:52,SEQ ID N0:53、SEQ ID NO:54, SEQ ID N0:55 或 SEQ ID NO:56 所示的核苷酸序列具有至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 的序列相同性的核苷酸序列;或
[0032]iii)在嚴(yán)格條件下與SEQ ID N0:31、SEQ ID NO:32,SEQ ID NO:33,SEQ ID NO:34,SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ IDN0:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41,SEQ ID NO:42,SEQ ID NO:43,SEQ ID NO:44,SEQ ID NO:45,SEQ ID NO:46,SEQ IDN0:47、SEQ ID NO:48,SEQ ID NO:49,SEQ ID NO:50,SEQ ID N0:5USEQ ID N0:52、SEQ ID NO: 53、SEQ ID NO: 54、SEQ ID NO: 55 或 SEQ IDNO: 56 所示的核苷酸序列雜交,且
[0033]其編碼的多肽在宿主細(xì)胞中表達(dá)時(shí)賦予所述宿主細(xì)胞提高的在含十氫萘環(huán)化合物的十氫萘環(huán)的6β位引入羥基的能力。
[0034]在一個(gè)實(shí)施方式中,所述的分離的多核苷酸進(jìn)一步包含編碼Pdr和編碼Pdx的核苷酸序列。
[0035]另一方面,本發(fā)明涉及一種重組載體,其包含前述任一項(xiàng)實(shí)施方式所述的分離的多核苷酸。
[0036]另一方面,本發(fā)明涉及一種宿主細(xì)胞,其包含前述任一項(xiàng)實(shí)施方式所述的分離的多核苷酸,或者轉(zhuǎn)化有前述任一項(xiàng)實(shí)施方式所述的重組載體。
[0037]在一個(gè)實(shí)施方式中,所述宿主細(xì)胞是原核微生物或真核微生物。在一個(gè)實(shí)施方式中,所述原核微生物選自以下組中:大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、自養(yǎng)假諾卡氏菌、嗜碳鏈霉菌和小四孢菌。在一個(gè)實(shí)施方式中,所述真核微生物選自以下組中:裂殖酵母菌、漢遜酵母菌、畢赤酵母菌、假絲酵母菌、球擬酵母菌和紅酵母菌。
[0038]另一方面,本發(fā)明涉及制備如前述任一項(xiàng)實(shí)施方式所述的分離的多肽的方法,包括培養(yǎng)如前述任一項(xiàng)實(shí)施方式所述的宿主細(xì)胞,和分離和純化如前述任一項(xiàng)實(shí)施方式所述的多肽。
[0039]另一方面,本發(fā)明涉及制備普伐他汀的方法,包括以下步驟:[0040]i)構(gòu)建本發(fā)明的重組載體;
[0041]ii)用本發(fā)明的重組載體轉(zhuǎn)化適合的宿主細(xì)胞;
[0042]iii)在存在底物美伐他汀或其鹽的情況下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化后的宿主細(xì)胞,由此將美伐他汀轉(zhuǎn)化為普伐他汀;和
[0043]iv)分離或純化普伐他汀或其鹽。
[0044]在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中,美伐他汀的鹽是美伐他汀鈉。
[0045]在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中,普伐他汀的鹽是普伐他汀鈉。
[0046]在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中,所述宿主細(xì)胞是大腸桿菌。
【專(zhuān)利附圖】
【附圖說(shuō)明】
[0047]圖1:所示為P450sca_2催化美伐他汀鈉轉(zhuǎn)化為普伐他汀鈉的示意圖。
[0048]圖2:所示為表達(dá)質(zhì)粒pET-P450sca-2-Pdr_Pdx的質(zhì)粒圖譜。
[0049]圖3:所示為美伐他汀鈉經(jīng)不同細(xì)胞轉(zhuǎn)化后的產(chǎn)物的HPLC分析結(jié)果,其中,A為普伐他汀鈉標(biāo)準(zhǔn)品為美伐他汀鈉標(biāo)準(zhǔn)品;C為只表達(dá)Pdr/Pdx的細(xì)胞(陰性對(duì)照);D為只表達(dá)P450sca-2的細(xì)胞(陰性對(duì)照);和E為表達(dá)P450sca_2/Pdr/Pdx的細(xì)胞。
[0050]圖4:所示為P450sca_2酶變體的三級(jí)結(jié)構(gòu)模型,其中:
[0051]A顯示出通過(guò)同源建模獲得的突變株1-R8-5C的P450sca_2的三級(jí)結(jié)構(gòu)模型,其中突變株1-R8-5C的P450sca-2相對(duì)于野生型P450sca_2的氨基酸突變用球棍模型表示并標(biāo)記;
[0052]B顯示出突變株1-R8-5C的P450sca_2與美伐他汀鈉的分子對(duì)接結(jié)果,其中美伐他汀鈉分子用黃色表示,底物口袋中的氨基酸用淺綠色球棍模型表示,R77和T85位點(diǎn)用紫色球棍模型表示;且
[0053]C顯示出底物進(jìn)入突變株1-R8-5C的P450sca_2的通道,其中在所示F/G loop、Fhelix和G helix區(qū)域中,紅色表示親水,藍(lán)色表示疏水,F(xiàn) helix的C末端上的V185用球狀模型表示,G helix的N末端上的V194用紫色球棍模型表示。
[0054]圖5:所示為P450cam與Pdx之間的兩條電子傳遞路徑。
[0055]圖6:所示為突變株1-R8-5C的P450sca_2與Pdx結(jié)合界面上的a C和α O,其中紫色球棍模型標(biāo)記的119位的蘇氨酸位于兩個(gè)α螺旋的連接處。
[0056]圖7:顯示從野生型P450sca-2開(kāi)始,進(jìn)行隨機(jī)突變和隨后定點(diǎn)飽和突變的策略,以及所得不同P450sca-2酶的突變體的全細(xì)胞活性。
[0057]圖8:顯示從突變株1-R8-5C的P450sca_2開(kāi)始,對(duì)4個(gè)重要位點(diǎn)T85、T119、V194和N363進(jìn)行迭代飽和突變組合的策略,以及所得不同P450sca-2酶的突變體的全細(xì)胞活性。
[0058]發(fā)明詳沭
[0059]本申請(qǐng)的發(fā)明人首次通過(guò)對(duì)野生型P450sca_2酶進(jìn)行定向進(jìn)化以提高P450sca_2酶催化美伐他汀轉(zhuǎn)化為普伐他汀的活性。具體地,本發(fā)明采用易錯(cuò)PCR對(duì)包含野生型P450sca-2酶核苷酸序列的多核苷酸載體進(jìn)行擴(kuò)增,轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞以構(gòu)建隨機(jī)突變文庫(kù),并隨后通過(guò)篩選得到一個(gè)全細(xì)胞活性顯著提高的突變株1-R8-5C。通過(guò)測(cè)序發(fā)現(xiàn),突變株
1-R8-5C中P450sca-2酶的氨基酸序列在SEQ ID NO:1所示多肽中的G52、F89、P159、D269、T323和E370位置具有氨基酸取代。
[0060] 因此,一方面,本發(fā)明涉及一種分離的多肽,其是SEQ ID N0:1所示的P450sca_2酶的變體或所述變體的生物學(xué)活性片段,其中所述多肽在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1所示序列中的G52、F89、P159、D269、T323和E370位置上包括氨基酸取代,而且相對(duì)于SEQ ID NO:1所示的P450sca-2酶,所述多肽在宿主細(xì)胞中表達(dá)時(shí)賦予所述宿主細(xì)胞提高的在含十氫萘環(huán)化合物的十氫萘環(huán)的6β位引入羥基的能力。在一個(gè)實(shí)施方式中,所述氨基酸取代為G52S、F891、P159A、D269E、T323A和E370V,且所述多肽包括SEQ ID N0:2所示的序列。
[0061]在本文中,術(shù)語(yǔ)“P450sca-2酶”是指來(lái)自于嗜碳鏈霉菌且屬于細(xì)胞色素P450酶家族的一種酶。野生型P450sca-2酶具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列,長(zhǎng)度為410個(gè)氨基酸,分子量為45KDa。當(dāng)P450sca-2酶和電子傳遞蛋白Pdr和Pdx在宿主細(xì)胞例如大腸桿菌中共表達(dá)時(shí),使得此宿主細(xì)胞具有在美伐他汀的十氫萘環(huán)6 β位引入羥基的能力。
[0062]圖1說(shuō)明了 P450sca_2酶催化底物美伐他汀鈉轉(zhuǎn)化普伐他汀鈉的示意圖。如圖1所示,首先P450sca-2酶與底物結(jié)合形成復(fù)合物,隨后Pdr與NADH進(jìn)行反應(yīng)以獲得電子,并將電子傳遞給Pdx,Pdx隨后將電子傳遞給P450sca-2酶。獲得電子的P450sca_2酶被還原,并向底物美伐他汀鈉的十氫萘環(huán)的6 β位引入羥基,隨后釋放出產(chǎn)物普伐他汀鈉。
[0063]在本文中,術(shù)語(yǔ)“P450sca_2酶的變體”是指包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸突變,且與野生型P450sca-2酶相比使得宿主細(xì)胞在美伐他汀的十氫萘環(huán)6 β位引入羥基的能力提高的酶。P450sca-2酶的變體可由本領(lǐng)域已知的任何方法制備。例如,P450sca_2酶的變體可通過(guò)從其它嗜碳鏈霉菌株系中分離獲得,或者通過(guò)人工誘變或突變的方式獲得。在本文中,術(shù)語(yǔ)“P450sca-2酶的變體”與“P450sca_2酶的突變體”或“修飾的P450sca_2酶”可互換使用。
[0064]在本文中,術(shù)語(yǔ)“氨基酸”為含有氨基基團(tuán)和羧酸基團(tuán)的有機(jī)化合物。在本發(fā)明中,氨基酸包括20種天然存在的氨基酸、非天然氨基酸和氨基酸類(lèi)似物(即其中的α碳具有側(cè)鏈的氨基酸)。天然存在的氨基酸包括選自以下組中的氨基酸:酪氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、丙氨酸、絲氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、脯氨酸、賴(lài)氨酸、組氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、色氨酸、精氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺和半胱氨酸。天然氨基酸殘基的縮寫(xiě)示于下表1中:
[0065]表1
【權(quán)利要求】
1.一種分離的多肽,其是SEQ ID勵(lì):1所示的?4508(^-2酶的變體或所述變體的生物學(xué)活性片段, 其中所述多肽在對(duì)應(yīng)于SEQ ID N0:1所示序列中的G52、F89、P159、D269、T323 和E370位置上包括氨基酸取代,而且 相對(duì)于SEQ ID勵(lì):1所示的?4508(^-2酶,所述多肽在宿主細(xì)胞中表達(dá)時(shí)賦予所述宿主細(xì)胞提高的在含十氫萘環(huán)化合物的十氫萘環(huán)的6β位引入羥基的能力。
2.權(quán)利要求1的分離的多肽,其中所述氨基酸取代為G52S、F891、P159A、D269E、T323A和E370V,且所述多肽包括SEQ ID N0:2所示的序列。
3.權(quán)利要求1或2的分離的多肽,其中所述多肽的氨基酸序列進(jìn)一步包括在對(duì)應(yīng)于SEQID NO:1所示序列中的選自T119、N363、T85、V194和它們?nèi)我饨M合的位置上的氨基酸取代。
4.權(quán)利要求3的分離的多肽,其中所述N363位置的氨基酸取代為N363Y或N363H;所述T119位置的氨基酸取代為T(mén)119S、T119C或T119N ;所述V194位置的氨基酸取代為V194C、V194N或V194T ;且所述T85位置的氨基酸取代為非極性疏水氨基酸。
5.權(quán)利要求4的分離的多肽,其中所述T85位置的氨基酸取代為T(mén)85M、T85L、T85F或T85I。
6.權(quán)利要求3的分離的多肽,其中所述氨基酸取代為T(mén)119N、N363Y、T85I和T194T。
7.權(quán)利要求3的分離的多肽,其中所述氨基酸取代為T(mén)119S、N363Y、T85F和T194N。
8.一種分離的多肽,其包含選自以下的氨基酸序列或由選自以下的氨基酸序列組成:
i)SEQID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ IDN0:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID N0:8、SEQ ID N0:9、SEQ ID NO: 10、SEQ IDNO:ll、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15 或 SEQ ID NO:16 ;
ii)與SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQID NO:6、SEQ IDNO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9、SEQ ID NO: 10, SEQID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ IDNO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15 或 SEQ ID NO: 16 所示的氨基酸序列具有至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 的序列相同性的氨基酸序列;或
iii)與SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQID NO:6, SEQ IDNO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9、SEQ ID NO: 10, SEQID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ IDNO: 13,SEQ ID NO: 14,SEQ ID NO: 15或SEQ ID NO: 16所示的氨基酸序列相比經(jīng)過(guò)取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸的氨基酸序列;而且 所述多肽在宿主細(xì)胞中表達(dá)時(shí)賦予所述宿主細(xì)胞提高的在含十氫萘環(huán)化合物的十氫萘環(huán)的6β位引入羥基的能力。
9.權(quán)利要求1或8所述的分離的多肽,所述含十氫萘環(huán)的化合物為他汀類(lèi)藥物,優(yōu)選美伐他汀。
10.權(quán)利要求1或8所述的分離的多肽,所述宿主細(xì)胞是原核微生物,所述原核微生物優(yōu)選自以下組中:大腸桿菌(Escherichia coli)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、自養(yǎng)假諾卡氏菌(Pseudonocardia autotrophica)、小四抱菌(Microtetraspora)和嗜碳鏈霉菌(Streptomyces carbophilus)。
11.一種分離的多核苷酸,其包含編碼權(quán)利要求1-10之一所述的分離的多肽的核苷酸序列。
12.—種分離的多核苷酸,其包含以下核苷酸序列或由以下核苷酸序列組成:
i)SEQID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQID NO:35、SEQ IDNO:36,SEQ ID NO:37,SEQ ID NO:38,SEQ ID NO:39,SEQ ID NO:40,SEQ ID NO:41,SEQ IDNO:42, SEQ ID NO:43, SEQ IDN0:44 或 SEQ ID NO:45 所示的核苷酸序列;
ii)與SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36,SEQ ID NO:37,SEQ ID NO:38,SEQ IDNO:39、SEQ ID NO:40,SEQ ID N0:41、SEQ ID NO:42,SEQ ID NO:43,SEQ ID N0:44 或 SEQ ID NO:45 所示的核苷酸序列具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 的序列相同性的核苷酸序列;或 iii)在嚴(yán)格條件下與SEQID NO:31、SEQ ID NO:32,SEQ ID NO:33,SEQ ID NO:34,SEQID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ IDNO:38, SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40,SEQID NO:41, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:43, SEQ ID N0:44 或 SEQ ID N0:45 所示的核苷酸序列雜交,且 其編碼的多肽在宿主細(xì)胞中表達(dá)時(shí)賦予所述宿主細(xì)胞提高的在含十氫萘環(huán)化合物的十氫萘環(huán)的6β位引入羥基的能力。
13.權(quán)利要求11或12的分離的多核苷酸,進(jìn)一步包含編碼Pdr和編碼Pdx的核苷酸序列。
14.一種重組載體,其包含權(quán)利要求11-13之一所述的分離的多核苷酸。
15.—種宿主細(xì)胞,其包含權(quán)利要求11-13之一所述的分離的多核苷酸,或者轉(zhuǎn)化有權(quán)利要求14所述的重組載體。
16.一種制備權(quán)利要求1-10之一所述的分離的多肽的方法,包括以下步驟: i)培養(yǎng)權(quán)利要求15所述的宿主細(xì)胞; ?)分離和純化權(quán)利要求ι-?ο之一所述的分離的多肽。
17.一種制備普伐他汀或其鹽的方法,包括以下步驟: i)構(gòu)建權(quán)利要求14所述的重組載體; ?)用所述重組載體轉(zhuǎn)化適合的宿主細(xì)胞; iii)在存在底物美伐他汀或其鹽的情況下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化后的宿主細(xì)胞,由此將美伐他汀轉(zhuǎn)化為普伐他?。缓? iv)分離或純化普伐他汀或其鹽。
【文檔編號(hào)】C12N15/53GK103898071SQ201210566984
【公開(kāi)日】2014年7月2日 申請(qǐng)日期:2012年12月24日 優(yōu)先權(quán)日:2012年12月24日
【發(fā)明者】林章凜, 巴麗娜, 李盼, 張暉, 段妍 申請(qǐng)人:清華大學(xué)